Zastosowanie testu pętli jelitowej z podwiązaną plamką Peyer’a u myszy do oceny wychwytu bakterii przez komórki M
17 grudnia 2011
Komórki M w wyspecjalizowanym nabłonku związanym z mieszykami, pokrywającym kępki Peyera, odgrywają istotną rolę w nadzorze immunologicznym błony śluzowej w tkance limfatycznej związanej z jelitami. W niniejszej pracy opisaliśmy metodę oceny transcytozy bakteryjnej przez komórki M in vivo. Metoda ta pozwala na zrozumienie funkcji komórek M w układzie odpornościowym.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie poboru bakterii przez komórki M zlokalizowane w obrębie mucosalnego układu odpornościowego jelita. Pierwszym krokiem tej procedury jest odsłonięcie i podwiązanie kęp Peyera w jelitach znieczulonej myszy. Następnie do podwiązanego obszaru wstrzykuje się fluorescencyjne bakterie.
Godzinę później wycina się fragmenty tkanek z obszarów pyres. Następnie komórki w tkance poddawane są permeabilizacji i barwieniu na marker komórek M, GP2. Na koniec próbki są obserwowane przy użyciu mikroskopu konfokalnego, co pozwala na wizualizację bakterii poddawanych transcytozie przez komórki M.
Oprócz dostarczenia wglądu w molekularne podstawy transcytozy bakteryjnej przez komórki M, metodę tę można zastosować w innych systemach. Na przykład niniejszy protokół mógłby zostać wykorzystany do badania przepuszczalności komórkowej w zapalnym jelicie z wykorzystaniem chlorofili i drobnoustrojów. Używając sterylnego szklanego rozprowadzacza, nanieś bakterie fluorescencyjne na płytkę agarową LB i inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C, aż pojawią się pojedyncze kolonie. Wyizoluj pojedynczą kolonię z twardego agaru i zaszczep ją do 2 mL świeżej pożywki LB.
Następnie inkubować bakterie w wytrząsarku przez noc w temperaturze 37 °C. Po namnożeniu kultury startowej przenieść 500 µL bakterii do 4,5 ml pożywki LB i inkubować tę nową kulturę w temperaturze 37 °C przez trzy do czterech godzin lub do momentu, aż gęstość optyczna przy 600 nm osiągnie wartość 1, co wskazuje, że wzrost bakterii znajduje się w fazie logarytmicznej. W tym momencie odwirować kulturę z prędkością 3000 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C w celu zebrania bakterii. Po odwirowaniu odrzucić nadsącz i przemyć osad pięcioma ml sterylnego PBS. Po powtórzeniu etapu przemywania resuspenderować bakterie w pięciu ml PBS.
Po umieszczeniu myszy w ciągłej anestezji izofluranem, za pomocą sterylnych narzędzi w sposób aseptyczny otwórz jamę brzuszną zwierzęcia. Rozpocznij od odsłonięcia jelita cienkiego i zlokalizuj płatki Peyera. Po znalezieniu płatków Peyera użyj sterylnej nici chirurgicznej, aby podwiązać jelito w odległości około pięciu milimetrów od jednego z boków płatka.
Należy uważać, aby nie przerwać naczyń krwionośnych podczas procedury. Po podwiązaniu jelita należy za pomocą strzykawki wstrzyknąć 50 µL zawiesiny bakteryjnej o stężeniu 10⁷ CFU do podwiązanego pętlowego fragmentu jelita po stronie wolnej. Następnie należy za pomocą nici podwiązać drugą stronę jelita.
Zamknąć brzuch myszy za pomocą klipsa i utrzymywać zwierzę pod narkozą przez jedną godzinę przed przeprowadzeniem eutanazji. Aby pobrać fragment Peyer's patch, należy go ostrożnie wyciąć. Następnie należy kilkakrotnie intensywnie przepłukać pobrany odcinek jelita roztworem PBS, aby oczyścić stronę apikalną fragmentu Peyer's patch oraz usunąć nadmiar płynu śluzówkowego i bakterii.
Po wypłukaniu preparatu z błony komórkowej (patch), należy umieścić go w dołku płytki 24-dołkowej i dodać roztwór cyto effects lub cyto perm. Próbkę należy inkubować w lodzie przez jedną godzinę. Po utrwaleniu preparatu należy go namoczyć w 1 ml buforu do płukania po permeabilizacji przez pięć minut.
Powtórz ten etap płukania trzykrotnie. Następnie umieść próbkę w 1 ml buforu blokującego i inkubuj ją w temperaturze 0 °C przez 30 minut. Po etapie blokowania dodaj przeciwciało monoklonalne anty-mysie GP2 do stężenia końcowego 5 µg/ml i inkubuj próbkę przez noc w temperaturze 4 °C, aby przeprowadzić barwienie komórek M.
Następnie należy przemyć próbkę w taki sam sposób jak poprzednio. Dodać przeciwciało wtórne sprzężone z markerem i inkubować próbkę na lodzie w ciemności przez dwie godziny. Po zabarwieniu próbki należy ją delikatnie przemyć w PBS.
Następnie należy umieścić trzy lub cztery okółki szkiełka nakrywkowego na szkiełku przedmiotowym i zatopić fragment pires w 200 µL 30% roztworu glicerolu w PBS. Próbkę należy obserwować na szkiełku, używając konfokalnego mikroskopu laserowego DM IRE dwa lub mikroskopu dekonwolucyjnego Delta vision restoration. Na obrazie widać zielone, znakowane GFP salmonella typhimurium otoczone przez GP dwa, widoczne na czerwono na apikalnej błonie plazmatycznej.
Na tym obróconym obrazie bakterie są widoczne w pęcherzykach cytoplazmatycznych poniżej wierzchołka. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat tego, jak oceniać transcytozę bakteryjną przez komórki M, wykorzystując ligowany test jelitowy Lu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół oceny wychwytu bakterii przez komórki M w kępkach Peyera myszy z wykorzystaniem testu z podwiązaną pętlą jelitową. Metoda ta umożliwia wizualizację i kwantyfikację transcytozy bakteryjnej przez komórki M, dostarczając wiedzy na temat odpowiedzi odpornościowej błony śluzowej w jelitach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Mikrobiologia
- Biologia błon śluzowych
Wstęp
- Przewód pokarmowy jest kolonizowany przez liczne bakterie komensalne i wystawiony na działanie patogenów.
- Tkanka limfatyczna związana z jelitami (GALT) jest niezbędna dla odpowiedzi immunologicznej błon śluzowych.
- Komórki M w kępkach Peyera pośredniczą w transcytozie antygenów z światła jelita do pęcherzyków limfatycznych.
- Gp2 jest markerem i funkcjonalnym receptorem na komórkach M dla niektórych bakterii, w tym Escherichia coli oraz Salmonella Typhimurium.
Cel badania
- Opracowanie i zademonstrowanie ulepszonego testu pętli jelitowej z kępkami Peyera u myszy w celu oceny wychwytu bakterii przez komórki M.
- Wizualizacja i ilościowe określenie transcytozy bakteryjnej przez komórki M z wykorzystaniem znakowania fluorescencyjnego i mikroskopii konfokalnej.
- Ułatwienie zrozumienia molekularnych mechanizmów leżących u podstaw stymulacji odporności śluzówkowej za pośrednictwem komórek M.
Zastosowane metody
- Przygotowanie i znakowanie fluorescencyjne bakterii (np. Salmonella Typhimurium wykazujących ekspresję GFP).
- Operacja podwiązania pętli jelitowej u znieczulonych myszy w celu wyizolowania kępek Peyera.
- Iniekcja fluorescencyjnych bakterii do pętli jelitowej zawierającej kępkę Peyera.
- Pobranie, fiksacja, permeabilizacja i immunostaining tkanki kępek Peyera z użyciem przeciwciała anty-Gp2.
- Wizualizacja transcytozy bakteryjnej przez komórki M przy użyciu mikroskopii konfokalnej.
Główne wyniki
- Pomyślna wizualizacja fluorescencyjnych bakterii w komórkach M w kępkach Peyera.
- Barwienie Gp2 specyficznie znakuje komórki M, umożliwiając identyfikację miejsc pobierania bakterii.
- Bakterie obserwuje się w subapikalnych pęcherzykach cytoplazmatycznych komórek M, co potwierdza transcytozę.
- Protokół umożliwia ocenę, które gatunki bakterii są transcytowane przez komórki M.
Wnioski
- Udoskonalony test pętli jelitowej jest skuteczny w badaniu pobierania bakterii przez komórki M in vivo.
- Metoda ta stanowi platformę do badania molekularnych mechanizmów transcytozy antygenów oraz aktywacji odporności śluzówkowej.
- Podejście to można zaadaptować do badania innych aspektów przepuszczalności jelit oraz interakcji między gospodarzem a mikroorganizmami.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa ocena transcytozy bakteryjnej przez komórki M w kępkach Koplavica pozwala wypełnić istotną lukę w zrozumieniu nadzoru odpornościowego śluzówki oraz oddziaływań między gospodarzem a mikrobami. Analiza ta umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w badaniu szlaków pobierania antygenów, co zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkryć w immunologii i badaniach nad mikrobiomem. Zdolność tej metody do rozróżniania gatunków bakterii poddawanych transcytozie przez komórki M dostarcza kluczowych informacji dla walidacji celów i selekcji projektów w strategiach immunomodulacji błon śluzowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę mechanizmów pobierania antygenów za pośrednictwem komórek M w systemie istotnym fizjologicznie.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów dla cząsteczek modulujących odpowiedzi odpornościowe błon śluzowych.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnienie roli Gp2 i ligandów bakteryjnych w transcytozie.
- Zapewnia pewność prognostyczną w procesie rozwoju kandydatów immunomodulujących lub opartych na mikrobiomie.
Przesiewy i rozwój testów
- Ustanawia zwalidowaną platformę ex vivo do ilościowego oznaczania wychwytu bakterii przez komórki M przy użyciu fluorescencji i mikroskopii konfokalnej.
- Umożliwia odtwarzalne pomiary zdarzeń transcytozy dla różnych szczepów bakteryjnych i warunków doświadczalnych.
- Wspiera standaryzację testu w celu późniejszego przesiewu modulatorów wpływających na funkcję lub przepuszczalność komórek M.
- Ułatwia wiarygodną ocenę związków kandydackich celujących w ścieżki odporności błon śluzowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z modelami istotnymi dla chorób w badaniu interakcji między gospodarzem a drobnoustrojami w błonie śluzowej jelit.
- Zapewnia ciągłość translacyjną od etapu odkryć do przedklinycznej walidacji celów immunologicznych błony śluzowej.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju kandydatów na immunoterapie i szczepionki ukierunkowane na odporność jelit z uwzględnieniem analizy ryzyka.
- Wspiera identyfikację translacyjnych biomarkerów powiązanych z poborem antygenów za pośrednictwem komórek M.
Integracja potoków i przepływów pracy
Niniejszy test włącza się w proces od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając weryfikację hipotez dotyczących pobierania antygenu, wspierając identyfikację wiodących kandydatów na leki oraz dostarczając informacji niezbędnych do przedklinicznej walidacji modulatorów odporności błon śluzowych.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie transcytozy pośredniczonej przez komórki M w celu wyjaśnienia dróg pobierania antygenów i minimalizowania ryzyka związanego z mechanizmami biologicznymi.
- Przesiewanie: Dostarczanie standaryzowanych, ilościowych odczytów do porównywania pobierania bakterii pomiędzy różnymi szczepami i interwencjami.
- Analityka: Zapewnienie obrazowania konfokalnego i pomiarów opartych na fluorescencji w celu wsparcia statystycznego porównania grup eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączenie wstępnych wyników odkryć z modelami przedklinicznymi odporności jelitowej i interakcji gospodarz-mikrob.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferowanie wielokrotnego wykorzystania platformy do oceny różnych gatunków bakterii i potencjalnych modulatorów w ramach procesów immunologii błon śluzowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów odporności śluzówkowej i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje kwantyfikację poboru bakterii i wspiera powtarzalność między badaniami.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji dla decyzji typu go/no-go w programach immunomodulacyjnych i ukierunkowanych na mikrobiom, zwiększając efektywność kapitałową.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów celujących w szlaki odpornościowe jelit z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie technik chirurgicznych u myszy oraz mikroskopii konfokalnej.
- Wymaga dostępu do odczynników do znakowania fluorescencyjnego i infrastruktury obrazowej.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów przetwarzania tkanek i barwienia pomiędzy zespołami.
- Możliżna jest potrzeba adaptacji metody dla różnych gatunków bakterii lub systemów modelowych.
- Przepustowość jest ograniczona przez wymogi przepływu pracy w zakresie operacji i obrazowania.
