Name: Zastosowanie mysiego testu pętli jelitowej z łatką Peyera w celu oceny wychwytu bakterii przez limfocyty M (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Poznaj metodę oceny wychwytu bakterii przez limfocyty M w mysich łatkach Peyera przy użyciu testu pętli jelitowej. Technika ta umożliwia wizualizację transcytozy bakteryjnej i badanie odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej jelit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować wszystkim członkom EIB za opracowanie tej techniki. Niniejsze badanie było częściowo finansowane z grantów Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii Japonii: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas „Membrane Traffic” (H.O.) oraz „Matrix of Infectious Phenomena” (K.H.), Young Scientists (S.F. i K. H.), Scientific Research (H.O.) oraz Scientific Research on Innovative Areas „Intracellular Logistics” (H.O.).

1. Przygotowanie komórek bakteryjnych
<ol>
	<li>Wysiać bakterie fluorescencyjne z zapasu w glicerolu (np. S. Typhimurium ekspresujące GFP) na płytkę z agarem LB zawierającym 100 μg/ml ampicyliny.</li>
	<li>Hodować pojedynczą koloni z agaru LB przez noc w 2 ml świeżej pożywki LB.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml hodowli bakteryjnej do 4,5 ml świeżej pożywki LB i inkubować do osiągnięcia gęstości optycznej 1,0 przy 600 nm.</li>
	<li>Zebrać komórki bakteryjne poprzez wirowanie (3,000 x g, 5 min, 4°C).</li>
	<li>Odlać nadsącz i dwukrotnie przemyć osad 5,0 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej z fosforanem (PBS).</li>
	<li>Resuspendować osad bakteryjny w 5 ml PBS i wykorzystać 50 μl zawiesiny zawierającej około 107 jednostek tworzących kolonie (CFU) jako inokulum.</li>
	<li>W przypadku użycia bakterii znakowanych fluorescencyjnie, komórki bakteryjne znakowano odczynnikiem do znakowania fluorescencyjnego zgodnie ze standardowym protokołem.</li>
</ol>
2. Znieczulenie
<ol>
	<li>Napełnić niewielkie plastikowe pudełko (10 x 10 x 5 cm) 5% (v/v) odparowanego izofluranu zmieszanego z powietrzem (przepływ: 200 ml/min).</li>
	<li>Zanestetyzować myszy samce lub samice w wieku od ośmiu do szesnastu tygodni w pudełku.</li>
	<li>Po znieczuleniu przenieść myszy na stół sekcyjny.</li>
	<li>Podtrzymać znieczulenie myszy, stosując 2% (v/v) odparowany izofluran zmieszany z powietrzem (przepływ: 200 ml/min) (Rysunek 1). Jest to procedura terminalna.</li>
</ol>
3. Analiza pętli z podwiązanymi kępkami Peyera
<ol>
	<li>Naciąć skórę brzucha na 1 cm, a następnie rozciąć otrzewnę brzuszna u znieczyszonej myszy i wyciągnąć jelito cienkie zawierające kępki Peyera.</li>
	<li>Podwiązać jelito nicią chirurgiczną, uważając, aby nie uszkodzić naczyń krwionośnych. Uwaga: należy podwiązać tylko jedną stronę jelita, pozostawiając drugą stronę wolną.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki wstrzyknąć 50 μl zawiesiny bakteryjnej lub PBS (kontrola) do podwiązanej pętli kępki Peyera od strony wolnej jelita (Rycina 2).</li>
	<li>Podwiązać stronę wolną i zamknąć brzuch myszy za pomocą klipsa.</li>
	<li>Po 1 h usunąć podwiązaną pętlę kępki Peyera, a następnie uśmiercić mysz poprzez zwichnięcie szyi.</li>
	<li>Wyciąć kępkę Peyera z podwiązanej pętli.</li>
	<li>Przepłukać stronę apikalną kępki Peyera 1 ml PBS za pomocą strzykawki z igłą, aby usunąć nadmiar płynu śluzówkowego i bakterii. Przepłukać kępkę Peyera dodatkowo dwa razy.</li>
</ol>
4. Barwienie całego preparatu i analiza mikroskopowa kłaczków Peyer'a za pomocą mikroskopu konfokalnego
<ol>
	<li>Utkwić kępki Peyerów w roztworze BD Cytofix/Cytoperm na lodzie przez 1 hr.</li>
	<li>Przemyć kępki Peyerów trzy razy 1 ml buforu BD Perm/Wash przez 5 min, a następnie zablokować 1 ml buforu blokującego zawierającego 0,1% (w/v) saponiny i 0,2% (w/v) BSA w PBS przez 30 min na lodzie.</li>
	<li>Do preparatu dodać 200-krotnie rozcieńczone przeciwciało monoklonalne anty-mysie GP2 (5 μg/ml) w celu detekcji komórek M.</li>
	<li>Inkubować przez 2 hrs w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4°C.</li>
	<li>Przemyć trzy razy 1 ml zimnego PBS, a następnie do preparatu dodać 200-krotnie rozcieńczone przeciwciało anty-szczurze IgG sprzężone z DyLight549 (20 μg/ml).</li>
	<li>Inkubować próbkę na lodzie przez 2 hrs.</li>
	<li>Przemyć trzy razy 1 ml zimnego PBS, a następnie do preparatu dodać 50-krotnie rozcieńczoną faloidynę sprzężoną z Alexa 633 w celu detekcji F-aktyny.</li>
	<li>Inkubować na lodzie przez 2 hrs.</li>
	<li>Przemyć delikatnie 1 ml zimnego PBS. Następnie umieścić trzy do czterech okrągłych szkiełek nakrywkowych na preparacie i zatopić preparaty w 30% roztworze glicerolu w PBS na szkiełku (Rycina 3).</li>
	<li>Obserwować preparaty przy użyciu konfokalnego mikroskopu laserowego DM-IRE2 lub mikroskopu dekonwolucyjnego DeltaVision Restoration.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
Przykładowy preparat z analizy pętli kępki Peyera myszy z podwiązaniem z zastosowaniem GFP-S. Typhimurium był obserwowany przy użyciu mikroskopu dekonwolucyjnego DeltaVision Restoration (Rysunek 4). GFP-S. Typhimurium jest transportowane przez transcytozę przez komórki M GP2+. Analiza pętli jelitowej kępki Peyera myszy pozwala zidentyfikować rodzaje bakterii komensalnych lub patogennych, które mogą być transportowane przez transcytozę przez komórki M.
<img alt="Ustawienie systemu anestezji dla małego ssaka, wyposażonego do podawania anestetyku wziewnego, eksperyment laboratoryjny." src="/files/ftp_upload/3225/3225fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Anestezja myszy z wykorzystaniem odparowanego izofluranu. Odparowany izofluran był dostarczany za pomocą dedykowanego aparatu do anestezji (lewa strona).
<img alt="Schemat strzykawki wstrzykującej fluorescencyjne bakterie do kęcika Peyera w eksperymencie z pętlą jelitową." src="/files/ftp_upload/3225/3225fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Podsumowanie testu pętli jelitowej z podwiązanym kęcikiem Peyera. Zawiesinę fluorescencyjnych bakterii wstrzyknięto za pomocą strzykawki do podwiązanej pętli z kęcikiem Peyera po luźnej stronie jelita.
<img alt="Test dyfuzyjny na agarze, szalki Petriego, analiza oporności na antybiotyki, eksperyment mikrobiologiczny." src="/files/ftp_upload/3225/3225fig3.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Montaż preparatów. Preparaty zatopiono w 30% roztworze glicerolu w PBS na specjalnym szkiełku, w którym perforowana plastikowa płytka (o grubości 1 mm) została przymocowana do szkiełka przedmiotowego za pomocą substancji klejącej.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna GFP-Salmonella Typhimurium w komórkach nabłonkowych, widok od strony apikalnej do bazalnej." src="/files/ftp_upload/3225/3225fig4.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Przykład testu pętli z podwiązaną kępką Peyera u myszy z użyciem GFP-S. Typhimurium. Marker GP2, uznawany za specyficzny marker komórek M5, został zabarwiony przeciwciałami anty-mysim GP2 (kolor czerwony). Preparat obserwowano za pomocą mikroskopu dekonwolucyjnego DeltaVision Restoration. GFP-wyrażające S. Typhimurium współlokalizowały z GP2 na apikalnej błonie plazmatycznej komórki M oraz w podapikalnych pęcherzykach cytoplazmatycznych (groty strzałek). Góra: widok apikalny. Dół i bok: widoki boczne. Pasek skali: 10 μm.

<ol><li>Fagarasan, S., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+IgA+synthesis%3A+regulation+of+front-line+body+defences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 63-72 (2003).</li>
<li>Hapfelmeier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+microbial+colonization+of+germ-free+mice+reveals+the+dynamics+of+IgA+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reversible microbial colonization of germ-free mice reveals the dynamics of IgA immune responses.</a> Science. 328, 1705-1709 (2010).</li>
<li>Owen, R. L., Jones, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+specialization+within+human+Peyer%27s+patches%3A+an+ultrastructural+study+of+intestinal+lymphoid+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell specialization within human Peyer's patches: an ultrastructural study of intestinal lymphoid follicles.</a> Gastroenterology. 66, 189-203 (1974).</li>
<li>Neutra, M. R., Mantis, N. J., Kraehenbuhl, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaboration+of+epithelial+cells+with+organized+mucosal+lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissues.</a> Nat. Immunol. 2, 1004-1009 (2001).</li>
<li>Hase, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+through+glycoprotein+2+of+FimH%28%2B%29+bacteria+by+M+cells+initiates+mucosal+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Uptake through glycoprotein 2 of FimH(+) bacteria by M cells initiates mucosal immune response.</a> Nature. 462, 226-230 (2009).</li>
<li>Punyashthiti, K., Finkelstein, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteropathogenicity+of+Escherichia+coli.+I.+Evaluation+of+mouse+intestinal+loops%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Enteropathogenicity of Escherichia coli. I. Evaluation of mouse intestinal loops.</a> Infect. Immun. 4, 473-478 (1971).</li>
<li>Owen, R. L., Pierce, N. F., Apple, R. T., Cray, W. C. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M+cell+transport+of+Vibrio+cholerae+from+the+intestinal+lumen+into+Peyer%27s+patches%3A+a+mechanism+for+antigen+sampling+and+for+microbial+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">M cell transport of Vibrio cholerae from the intestinal lumen into Peyer's patches: a mechanism for antigen sampling and for microbial transepithelial migration.</a> J. Infect. Dis. 153, 1108-1118 (1986).</li>
<li>Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M+cells--entryways+of+opportunity+for+enteropathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">M cells--entryways of opportunity for enteropathogens.</a> J. Exp. Med. 180, 7-9 (1994).</li>
<li>Clark, M. A., Hirst, B. H., Jepson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-cell+surface+beta1+integrin+expression+and+invasin-mediated+targeting+of+Yersinia+pseudotuberculosis+to+mouse+Peyer%27s+patch+M+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">M-cell surface beta1 integrin expression and invasin-mediated targeting of Yersinia pseudotuberculosis to mouse Peyer's patch M cells.</a> Infect. Immun. 66, 1237-1243 (1998).</li>
<li>Jensen, V. B., Harty, J. T., Jones, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+the+invasive+pathogens+Salmonella+typhimurium%2C+Listeria+monocytogenes%2C+and+Shigella+flexneri+with+M+cells+and+murine+Peyer%27s+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Interactions of the invasive pathogens Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, and Shigella flexneri with M cells and murine Peyer's patches.</a> Infect. Immun. 66, 3758-3766 (1998).</li>
<li>Nagai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Peyer%27s+patches+in+the+induction+of+Helicobacter+pylori-induced+gastritis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Role of Peyer's patches in the induction of Helicobacter pylori-induced gastritis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 8971-8976 (2007).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Czas inkubacji podwiązanej kępki Peyera z zawiesiną bakteryjną wynosi zazwyczaj 1 hr, aby zaobserwować wbudowywanie się bakterii w komórki M. W przypadku 4 hr inkubacji bakterie są często wykrywane w strefie komórek T kępek Peyera. Ponieważ anestezja wziewna izofluranem w formie par pozwala utrzymać stabilny stan myszy, czas inkubacji podwiązanej kępki Peyera z zawiesiną bakteryjną można wydłużyć, aby zaobserwować bakterie przemieszczające się do strefy komórek T w kępce Peyera. Kluczowym punktem tego eksperymentu jest z...

<table><tbody><tr><td>LB Agar z ampicyliną- 100</td><td>SIGMA</td><td>L5667</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw barwnika reaktywnego Cy3 mono</td><td>GE Healthcare</td><td>PA23001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 350 kwas karboksylowy, ester succinimidylowy</td><td>Invitrogen</td><td>A10168</td><td></td></tr><tr><td>Aparat do znieczulenia inhalacyjnego</td><td>Shinano Seisakusho</td><td>SN-487</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do fiksacji i permeabilizacji</td><td>BD</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko mysiej glikoproteinie 2</td><td>MBL</td><td>D278-3</td><td>rozcieńczenie 200-krotne (5&amp;mu;g/ml)</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-szczur IgG, specyficzne dla fragmentu F(ab')2</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>112-505-006</td><td>rozcieńczenie 200-krotne (20&amp;mu;g/ml)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633 Falloidyna</td><td>Molecular Probes</td><td>A22284</td><td>rozcieńczenie 50-krotne</td></tr><tr><td>Konfokalny skaningowy mikroskop laserowy</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMIRE2</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop dekonwolucyjny DeltaVision Restoration</td><td>Applied Precision</td><td>DeltaVision Core</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie testu pętli jelitowej z podwiązaną plamką peyer’a u myszy do oceny wychwytu bakterii przez komórki m

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Wnętrze naszych jelit jest zasiedlone przez ogromną liczbę bakterii komensalnych. Powierzchnia błony śluzowej przewodu pokarmowego jest nieustannie wystawiona na ich działanie, a sporadycznie także na działanie patogenów. Tkanka limfatyczna związana z jelitami (GALT) odgrywa kluczową rolę w indukcji odpowiedzi immunologicznej błon śluzowych na te drobnoustroje1, 2. Aby zainicjować odpowiedź immunologiczną błon śluzowych, antygeny śluzówkowe muszą zostać przetransportowane z światła jelita przez barierę nabłonkową do zorganizowanych mieszków limfatycznych, takich jak kępki Peyera. Transcytoza antygenów ta jest pośredniczona przez wyspecjalizowane komórki M nabłonka3, 4. Komórki M są atypowymi komórkami nabłonkowymi, które aktywnie fagocytują makrocząsteczki i drobnoustroje. W przeciwieństwie do komórek dendrytycznych (DCs) i makrofagów, które kierują antygeny do lizosomów w celu ich degradacji, komórki M głównie dokonują transcytozy zinternalizowanych antygenów. Ta intensywna transcytoza makrocząsteczek przez komórki M dostarcza antygen antygeny do leżących poniżej zorganizowanych mieszków limfatycznych i uważa się, że jest ona niezbędna do zainicjowania swoistych odpowiedzi immunologicznych błon śluzowych. Jednakże molekularne mechanizmy promujące to pobieranie antygenów przez komórki M są w dużej mierze nieznane. Wcześniej zgłosiliśmy, że glikoproteina 2 (Gp2), specyficznie eksprymowana na apikalnej błonie plazmatycznej komórek M spośród enterocytów, służy jako receptor transcytozy dla podgrupy komensalnych i patogennych enterobakterii, w tym Escherichia coli oraz Salmonella enterica serowaru Typhimurium (S. Typhimurium), poprzez rozpoznawanie FimH, składnika pili typu I na zewnętrznej błonie bakteryjnej 5. Przedstawiamy tutaj metodę zastosowania testu pętli jelitowej w kępkach Peyera myszy w celu oceny pobierania bakterii przez komórki M. Metoda ta jest ulepszoną wersją wcześniej opisanego testu pętli jelitowej myszy 6, 7. Ulepszenia są następujące: 1. Jako środek znieczulający zastosowano izofluran. 2. Przygotowano podwiązaną pętlę jelitową o długości około 1 cm, zawierającą kępkę Peyera. 3. Bakterie pobrane przez komórki M zostały znakowane fluorescencyjnie za pomocą odczynnika do znakowania fluorescencyjnego lub poprzez nadekspresję białka fluorescencyjnego, takiego jak zielone białko fluorescencyjne (GFP). 4. Komórki M w nabłonku związanym z mieszkami pokrywającym kępkę Peyera wykryto za pomocą immunobarwienia całego preparatu z użyciem przeciwciała anty-Gp2. 5. Fluorescencyjną transcytozę bakterii przez komórki M obserwowano za pomocą analizy mikroskopii konfokalnej. Test pętli jelitowej w kępkach Peyera myszy może dostarczyć odpowiedzi na pytanie, jakie rodzaje bakterii komensalnych lub patogennych są transcytowane przez komórki M i może pomóc nam zrozumieć molekularny mechanizm stymulacji układu odpornościowego błon śluzowych za pośrednictwem komórek M.

Komórki M w wyspecjalizowanym nabłonku związanym z mieszykami, pokrywającym kępki Peyera, odgrywają istotną rolę w nadzorze immunologicznym błony śluzowej w tkance limfatycznej związanej z jelitami. W niniejszej pracy opisaliśmy metodę oceny transcytozy bakteryjnej przez komórki M in vivo. Metoda ta pozwala na zrozumienie funkcji komórek M w układzie odpornościowym.

Zastosowanie testu pętli jelitowej z podwiązaną plamką Peyer’a u myszy do oceny wychwytu bakterii przez komórki M

Wnętrze naszego jelita jest zasiedlone przez ogromną liczbę bakterii komensalnych. Powierzchnia śluzowa przewodu pokarmowego jest nieustannie narażona...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie poboru bakterii przez komórki M zlokalizowane w obrębie mucosalnego układu odpornościowego jelita. Pierwszym krokiem tej procedury jest odsłonięcie i podwiązanie kęp Peyera w jelitach znieczulonej myszy. Następnie do podwiązanego obszaru wstrzykuje się fluorescencyjne bakterie.Godzinę później wycina się fragmenty tkanek z obszarów pyres. Następnie komórki w tkance poddawane są permeabilizacji i barwieniu na marker komórek M, GP2. Na koniec próbki są obserwowane przy użyciu mikroskopu konfokalnego, co pozwala na wizualizację bakterii poddawanych transcytozie przez komórki M.Oprócz dostarczenia wglądu w molekularne podstawy transcytozy bakteryjnej przez komórki M, metodę tę można zastosować w innych systemach. Na przykład niniejszy protokół mógłby zostać wykorzystany do badania przepuszczalności komórkowej w zapalnym jelicie z wykorzystaniem chlorofili i drobnoustrojów. Używając sterylnego szklanego rozprowadzacza, nanieś bakterie fluorescencyjne na płytkę agarową LB i inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C, aż pojawią się pojedyncze kolonie. Wyizoluj pojedynczą kolonię z twardego agaru i zaszczep ją do 2 mL świeżej pożywki LB.Następnie inkubować bakterie w wytrząsarku przez noc w temperaturze 37 °C. Po namnożeniu kultury startowej przenieść 500 µL bakterii do 4,5 ml pożywki LB i inkubować tę nową kulturę w temperaturze 37 °C przez trzy do czterech godzin lub do momentu, aż gęstość optyczna przy 600 nm osiągnie wartość 1, co wskazuje, że wzrost bakterii znajduje się w fazie logarytmicznej. W tym momencie odwirować kulturę z prędkością 3000 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C w celu zebrania bakterii. Po odwirowaniu odrzucić nadsącz i przemyć osad pięcioma ml sterylnego PBS. Po powtórzeniu etapu przemywania resuspenderować bakterie w pięciu ml PBS.Po umieszczeniu myszy w ciągłej anestezji izofluranem, za pomocą sterylnych narzędzi w sposób aseptyczny otwórz jamę brzuszną zwierzęcia. Rozpocznij od odsłonięcia jelita cienkiego i zlokalizuj płatki Peyera. Po znalezieniu płatków Peyera użyj sterylnej nici chirurgicznej, aby podwiązać jelito w odległości około pięciu milimetrów od jednego z boków płatka.Należy uważać, aby nie przerwać naczyń krwionośnych podczas procedury. Po podwiązaniu jelita należy za pomocą strzykawki wstrzyknąć 50 µL zawiesiny bakteryjnej o stężeniu 10⁷ CFU do podwiązanego pętlowego fragmentu jelita po stronie wolnej. Następnie należy za pomocą nici podwiązać drugą stronę jelita.Zamknąć brzuch myszy za pomocą klipsa i utrzymywać zwierzę pod narkozą przez jedną godzinę przed przeprowadzeniem eutanazji. Aby pobrać fragment Peyer's patch, należy go ostrożnie wyciąć. Następnie należy kilkakrotnie intensywnie przepłukać pobrany odcinek jelita roztworem PBS, aby oczyścić stronę apikalną fragmentu Peyer's patch oraz usunąć nadmiar płynu śluzówkowego i bakterii.Po wypłukaniu preparatu z błony komórkowej (patch), należy umieścić go w dołku płytki 24-dołkowej i dodać roztwór cyto effects lub cyto perm. Próbkę należy inkubować w lodzie przez jedną godzinę. Po utrwaleniu preparatu należy go namoczyć w 1 ml buforu do płukania po permeabilizacji przez pięć minut.Powtórz ten etap płukania trzykrotnie. Następnie umieść próbkę w 1 ml buforu blokującego i inkubuj ją w temperaturze 0 °C przez 30 minut. Po etapie blokowania dodaj przeciwciało monoklonalne anty-mysie GP2 do stężenia końcowego 5 µg/ml i inkubuj próbkę przez noc w temperaturze 4 °C, aby przeprowadzić barwienie komórek M.Następnie należy przemyć próbkę w taki sam sposób jak poprzednio. Dodać przeciwciało wtórne sprzężone z markerem i inkubować próbkę na lodzie w ciemności przez dwie godziny. Po zabarwieniu próbki należy ją delikatnie przemyć w PBS.Następnie należy umieścić trzy lub cztery okółki szkiełka nakrywkowego na szkiełku przedmiotowym i zatopić fragment pires w 200 µL 30% roztworu glicerolu w PBS. Próbkę należy obserwować na szkiełku, używając konfokalnego mikroskopu laserowego DM IRE dwa lub mikroskopu dekonwolucyjnego Delta vision restoration. Na obrazie widać zielone, znakowane GFP salmonella typhimurium otoczone przez GP dwa, widoczne na czerwono na apikalnej błonie plazmatycznej.Na tym obróconym obrazie bakterie są widoczne w pęcherzykach cytoplazmatycznych poniżej wierzchołka. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat tego, jak oceniać transcytozę bakteryjną przez komórki M, wykorzystując ligowany test jelitowy Lu.

application-mouse-ligated-peyers-patch-intestinal-loop-assay-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zastosowanie mysiego testu pętli jelitowej z łatką Peyera w celu oceny wychwytu bakterii przez limfocyty M

Ten film demonstruje generowanie modelu pętli jelita krętego do badania przepuszczalności jelit w modelu mysim. Metoda ta zapewnia żywy model do zrozumienia funkcji bariery nabłonkowej i wynikającej z niej odpowiedzi immunologicznej.

Model pętli jelita krętego myszy: model chirurgiczny do badania przepuszczalności jelit u myszy

W tym filmie opisujemy procedurę chirurgiczną polegającą na generowaniu pętli proksymalnej okrężnicy myszy lub segmentu pcLoop, po której następuje doświetlna iniekcja markerów fluorescencyjnych do segmentu w celu zbadania przepuszczalności nabłonka jelitowego.

Generowanie mysiego modelu pętli proksymalnej jelita grubego: procedura chirurgiczna mająca na celu wygenerowanie pętli proksymalnej jelita grubego i pomiar przepuszczalności jelit poprzez wykrycie markerów fluorescencyjnych w surowicy po wstrzyknięciu doświetlnym

Rośnie zainteresowanie zrozumieniem funkcji immunologicznych określonych subpopulacji komórek w łatach Peyera (PP), głównych miejscach indukcyjnych tkanek limfatycznych związanych z jelitami.  W tym miejscu przedstawiamy równoległe protokoły przygotowania preparatów pojedynczych komórek PP do analizy cytometrii przepływowej i kriosekcji PP do barwienia immunologicznego.

Izolowanie i barwienie immunologiczne limfocytów i komórek dendrytycznych z mysich plastrów Peyera

Ten protokół opisuje użycie wyciętych preparatów tkanki jelitowej lub "worków jelitowych" jako modelu ex vivo funkcji bariery jelitowej. Model ten może być stosowany do oceny integralności zarówno bariery nabłonkowej, jak i warstwy żelu śluzowego w określonych miejscach jelitowych w zwierzęcych modelach chorób układu pokarmowego.

Ex vivo Pęcherzyki jelitowe do oceny przepuszczalności błony śluzowej w modelach chorób przewodu pokarmowego

Opisujemy tutaj transgeniczny model myszy reporterowej do wizualizacji komórek wytwarzających IL-22 wewnątrz różnych tkanek myszy. Ta metoda może być wykorzystana do śledzenia lokalizacji innych cytokin lub białek wydzielniczych u myszy.

Wizualizacja limfocytów z ekspresją IL-22 przy użyciu myszy reporterowych

Tutaj prezentujemy protokół do ustalenia ważnych punktów końcowych i markerów proliferacyjnych uszkodzenia jelita cienkiego i hiperproliferacji kompensacyjnej przy użyciu modelu zapalenia błony śluzowej wywołanego chemioterapią. Demonstrujemy wykrywanie proliferujących komórek za pomocą markera specyficznego dla cyklu komórkowego i przy użyciu masy jelita cienkiego, głębokości krypty i wysokości kosmków jako punktów końcowych.

Ważne punkty końcowe i markery proliferacyjne do oceny uszkodzenia jelita cienkiego i adaptacji przy użyciu mysiego modelu zapalenia błony śluzowej wywołanego chemioterapią

Korzystając z mikroskopii przyżyciowej, przedstawiona tutaj metoda umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym wydalania komórek nabłonka jelitowego u żywych zwierząt. W związku z tym miejscowo wybarwiona błona śluzowa jelit (akryflawina i rodamina B-dekstran) znieczulonych myszy jest obrazowana do rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Podejście oparte na mikroskopii przyżyciowej do oceny przepuszczalności jelit i wydajności wydalania komórek nabłonkowych

Tutaj opisujemy dokładną metodę pobierania limfocytów przewodu piersiowego i obserwacji migracji limfocytów tropikalnych jelitowych w plamach Peyera szczura przez 3 godziny za pomocą fotografii poklatkowej. Ta technika może wyjaśnić, w jaki sposób dynamika limfocytów wpływa na stan zapalny.

Obserwacja mikroskopowa dynamiki limfocytów w szczurzych łatach Peyera

Rozregulowana funkcja bariery nabłonkowej jelit i reakcje immunologiczne są cechami charakterystycznymi nieswoistego zapalenia jelit, które pozostają słabo zbadane z powodu braku modeli fizjologicznych. W tym miejscu opisujemy model pętli jelitowej myszy, który wykorzystuje dobrze unaczyniony i zewnętrzny odcinek jelita do badania przepuszczalności błony śluzowej i rekrutacji leukocytów in vivo.

Funkcjonalna ocena przepuszczalności jelit i migracji przeznabłonkowej neutrofili u myszy przy użyciu standaryzowanego modelu pętli jelitowej

Opisujemy mysi model pooperacyjnej niedrożności jelit generowany przez manipulację jelitową. Funkcję pasażu pokarmowego, zmiany patologiczne i aktywację komórek odpornościowych oceniano 24 godziny po zabiegu.

Pooperacyjny model mysiej niedrożności jelit

Badanie to przedstawia metodę obrazowania 3D z wykorzystaniem tkanek jelitowych w całości oraz mikroskopii wielofotonowej do ilościowego określenia wydzielanego śluzu, umożliwiając precyzyjną analizę objętościową i wizualizację dynamiki śluzu w odpowiedzi na bodźce takie jak chlorek karbamoilocholiny.

Trójwymiarowa ilościowa identyfikacja śluzu jelitowego za pomocą obrazowania tkanek w całości

Poznaj metodę oceny wychwytu bakterii przez limfocyty M w mysich łatkach Peyera przy użyciu testu pętli jelitowej. Technika ta umożliwia wizualizację transcytozy bakteryjnej i badanie odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej jelit.

Zastosowanie testu pętli jelitowej z podwiązaną plamką Peyer’a u myszy do oceny wychwytu bakterii przez komórki M

Przeglądaj więcej filmów