Zastosowanie mysiego testu pętli jelitowej z łatką Peyera w celu oceny wychwytu bakterii przez limfocyty M

M komórek w wyspecjalizowanym nabłonku związanym z pęcherzykami pokrywającymi plamy Peyera odgrywają ważną rolę w immunonadzorze błony śluzowej w tkance limfatycznej związanej z jelitami. Tutaj opisaliśmy metodę oceny transcytozy bakteryjnej przez limfocyty M in vivo. Ta metoda zapewnia metodę zrozumienia funkcji komórek M w układzie odpornościowym.

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie wychwytu bakteryjnego przez limfocyty M zlokalizowane w układzie odpornościowym błony śluzowej jelit. Pierwszym krokiem tej procedury jest odsłonięcie i podwiązanie plam stosów jelitowych znieczulonej myszy. Bakterie fluorescencyjne są następnie wstrzykiwane do podwiązanego obszaru.

Godzinę później łaty stosów są wycinane. Komórki w tkance są następnie przenikane i barwione pod kątem markera komórek M, GP dwa. Na koniec próbki obserwuje się za pomocą mikroskopu konfokalnego i można uwidocznić bakterie będące transcytozą przez komórki M.

Oprócz zapewnienia wglądu w molekularne podstawy transcytozy bakteryjnej przez komórki m, odrzucenie może być zastosowane do innego systemu. Na przykład protokół ten może być stosowany do wspomagania przepuszczalności komórek i w jelicie oprawionym przy użyciu chloru i drobnoustrojów Za pomocą sterylnego szklanego rozsiewacza rozprowadź fluorescencyjne bakterie na płytce ślimakowej LB i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż widoczne będą pojedyncze kolonie. Zbierz pojedynczą kolonię ze stałego ślimaka i zaszczep ją w dwóch mililitrach świeżej pożywki LB.

Następnie hoduj bakterie na shakerze przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy kultura starterowa wyrośnie, przenieś 500 mikrolitrów bakterii do 4,5 mililitra pożywki LB i inkubuj tę nową kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy do czterech godzin lub do momentu, gdy jej gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnie jedną wskazującą, że wzrost bakterii jest w fazie logarytmicznej. W tym momencie odwirować kulturę w temperaturze 3000 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zebrać bakterie po odwirowaniu, wyrzucić snat i umyć osad pięcioma mililitrami sterylnego PBS Po powtórzeniu kroku mycia Resus zawiesić bakterie w pięciu mililitrach PBS.

Po umieszczeniu myszy w ciągłym znieczuleniu fluorowym użyj sterylnych narzędzi, aby aseptycznie otworzyć brzuch myszy. Zacznij od odsłonięcia jelita cienkiego i zlokalizuj plamy PI. Po znalezieniu plastrów PI użyj sterylnej przędzy do szycia, aby podwiązać jelito około pięciu milimetrów po jednej stronie plastra.

Należy uważać, aby podczas zabiegu nie doszło do przerwania naczynek krwionośnych. Po podwiązaniu jelita za pomocą strzykawki wstrzyknąć 50 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej o objętości około 10 do siedmiu jtk do pętli z podwiązanymi stosami po luźnej stronie jelita. Następnie użyj przędzy do podwiązania drugiej strony jelita.

Zamknij brzuch myszy klipsem i utrzymuj mysz w znieczuleniu przez godzinę przed eutanazją. Aby zebrać grządkę stosów, ostrożnie wytnij łatę stosów. Następnie kilkakrotnie energicznie przepłucz PBS przez pobrany odcinek jelita, aby umyć wierzchołkową stronę plastra PI i usunąć nadmiar płynu śluzówkowego i bakterii.

Po umyciu plastra PI umieść go w dołku na 24-dołkowej płytce i dodaj efekty cyto lub roztwór cyto perm. Próbkę należy inkubować na lodzie przez jedną godzinę. Po utrwaleniu łatki P'S namocz ją w jednym mililitrze buforu do prania trwałej ondulacji na pięć minut.

Powtórz ten krok prania trzy razy. Następnie umieścić próbkę w jednym mililitrze buforu blokującego i inkubować ją na lodzie przez 30 minut. Po etapie blokowania dodaj przeciwciało monoklonalne anty mysie GP do końcowego stężenia pięciu mikrogramów na mililitr i inkubuj próbkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby wybarwić komórki M.

Następnie umyj próbkę jak poprzednio. Dodać drugorzędową podłogę dla sprzężonego przeciwciała i inkubować próbkę na lodzie w ciemności przez dwie godziny. Po zabarwieniu próbki należy ją delikatnie umyć w PBS.

Następnie umieść trzy lub cztery kawałki okrągłego szkła nakrywkowego na szkiełku podstawowym i zanurz plaster w 200 mikrolitrach 30% roztworu glicerolu w PBS. Na szkiełku podstawowym należy użyć dwukonfokalnego mikroskopu laserowego DM IRE lub mikroskopu dekonwolucyjnego przywracającego wzrok Delta do obserwacji próbki. Na tym zdjęciu można zobaczyć, że salmonella typhimurium oznaczona zielonym GFP jest otoczona przez GP dwa pokazany na czerwono na wierzchołkowej błonie plazmatycznej.

Na tym obróconym obrazie bakterie są widoczne w subwierzchołkowych pęcherzykach cytoplazmatycznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ocenić transcytozę bakteryjną przez komórki M za pomocą zligowanego pys jelitowego Lu asay.