Wywoływanie padaczki pourazowej w mysim modelu powtarzalnego rozlanego urazowego uszkodzenia mózgu
10 lutego 2020
Ten systematyczny protokół opisuje nowy zwierzęcy model padaczki pourazowej po powtarzającym się łagodnym urazowym uszkodzeniu mózgu. Pierwsza część szczegółowo opisuje etapy indukcji urazowego uszkodzenia mózgu przy użyciu zmodyfikowanego modelu spadku masy ciała. Druga część zawiera instrukcje dotyczące podejścia chirurgicznego dla jedno- i wielokanałowych systemów akwizycji danych elektroencefalograficznych.
Nasz protokół jest pierwszym, który szczegółowo opisuje mysi model padaczki pourazowej wywołanej łagodnym urazowym uszkodzeniem mózgu. Zastosowanie łagodnego modelu rozlanego urazowego uszkodzenia mózgu naśladuje ważny aspekt patologii urazowego uszkodzenia mózgu u człowieka, który prawie zawsze ma składnik rozproszony. Aby opracować biomarkery i metody leczenia, potrzebne są badania z wykorzystaniem modeli, które odpowiednio odtwarzają aspekty patologii człowieka.
Nasz model urazowego uszkodzenia mózgu ma również potencjał, aby zapewnić wgląd w mechanizmy, które powodują upośledzenie funkcji mózgu po łagodnym urazowym uszkodzeniu mózgu lub wstrząśnieniu mózgu. Po potwierdzeniu braku reakcji na odruch bólowy umieść mysz na podkładce piankowej i umieść głowę myszy pod rurką zrzutu ciężaru. Umieść płaski krążek ze stali nierdzewnej o średnicy 1.3 centymetra i grubości jednego milimetra i wadze 880 miligramów na środku głowy zwierzęcia między oczami a uszami.
Usuń szpilkę w rurze zrzutu ciężarka, aby zwolnić 100-gramowy pręt z wysokości 50 centymetrów. Aby wywołać pozorowane obrażenia u myszy kontrolnych, usuń pręt obciążnika z rurki, aby zapobiec przypadkowemu zwolnieniu szpilki podczas spadku wagi. Po indukcji utraty masy ciała połóż zwierzę na poduszce grzewczej pokrytej sterylnym ręcznikiem chłonnym wyściełanym poliamidem z monitorowaniem aż do pełnego leżenia.
Następnie umieść mysz w czystej klatce, która została podgrzana na poduszce grzewczej z żelem regeneracyjnym i kilkoma zwilżonymi kawałkami karmy na 45 minut. Aby przygotować pole operacyjne do wszczepienia elektrody EEG, umieść czujnik temperatury na podkładce i umieść znieczuloną mysz z uszkodzonym mózgiem na sterylnej serwety na poduszce grzewczej na aparacie stereotaktycznym. Po utrwaleniu głowy za pomocą nauszników nałóż maść nawilżającą na oczy zwierzęcia i użyj kremu do depilacji, aby usunąć włosy ze skóry głowy.
Zdezynfekuj odsłoniętą skórę trzema 20-sekundowymi naprzemiennymi wacikami z powidonu, jodem, chirurgicznym roztworem antyseptycznym i 70% etanolem okrężnymi ruchami. Po usunięciu skóry głowy nałóż małe hemostatyki na otwarte granice skóry, aby rozszerzyć odsłonięty obszar. Następnie za pomocą skalpela delikatnie usuń okostną i przetrzyj czaszkę wodą utlenioną.
Gdy czaszka zostanie oczyszczona z tkanki i zacznie mieć białawy wygląd, osusz kość sterylną gazą lub wacikiem. Do implantacji elektrod użyj wiertła szybkoobrotowego z okrągłym wiertłem stalowym o średnicy 0,5 milimetra z prędkością od 5 000 do 6 000 obrotów na minutę, aby utworzyć sześć otworów na zadziory dla elektrod śrubowych. Po wywierceniu wszystkich otworów umieść sześć elektrod śrubowych w otworach na zadziory i wymieszaj pół miarki proszku cementu dentystycznego z kilkoma kroplami rozpuszczalnika.
Użyj szpatułki, aby mieszać, aż mieszanka cementu dentystycznego będzie lepka, ale plastyczna i wystarczająco sztywna, aby mogła się odpowiednio zagęścić po umieszczeniu na czaszce zwierzęcia. Nałóż cement na całą odsłoniętą powierzchnię czaszki i każdą elektrodę. Po jednej do dwóch minut włącz lutownicę i umieść trzy mocowania głowicy EEG w ramieniu uchwytu stereotaktycznego.
Umieść mocowanie głowicy nad czaszką tak, aby sześć pozycji przewodów drutu odpowiadało położeniu przewodu każdego elektrody śrubowej. Opuść urządzenie tak, aby jego brzuszna część spoczywała na cemencie dentystycznym. Skręć drut każdego przewodu z każdej z elektrod śrubowych z odpowiednim przewodem drutu mocowania głowicy, każdą skręconą parę przewodów, aby zapewnić prawidłowe przewodzenie sygnału i użyj nożyczek, aby przyciąć nadmiar drutu.
Zegnij każdą przylutowaną parę przewodów wokół mocowania głowicy. Gdy wszystkie pary zostaną zgięte, przykryj cały drut świeżym cementem dentystycznym, pozostawiając odsłoniętą tylko czarną część mocowania głowy. Uwolnij hemostatyki przytrzymujące płaty skóry i nałóż środek antyseptyczny z chlorheksydyną na obszar wokół implantu, aby uniknąć infekcji.
Następnie przenieś zwierzę z aparatu na wagę, aby zmierzyć wagę zwierzęcia jako odniesienie do przyszłego monitorowania przed umieszczeniem zwierzęcia w czystej klatce na ciepłej poduszce grzewczej z monitorowaniem, żelem regeneracyjnym i kilkoma zwilżonymi kawałkami karmy. Na tym rysunku pokazano spontaniczny napad padaczkowy u myszy 97 dni po wielokrotnym spadku masy ciała urazowym uszkodzeniu mózgu zarejestrowanym za pomocą trzech mocowań EEG na głowę skonfigurowanych tak, jak pokazano w tym protokole wideo. Pokazano tu spontaniczny, niekonwulsyjny napad elektrograficzny zarejestrowany u myszy 65 dni po powtarzającym się urazie mózgu spowodowanym spadkiem wagi.
Na tym rysunku spontaniczny napad padaczkowy u myszy 23 dni po wielokrotnym urazie mózgu spowodowanym spadkiem masy ciała zarejestrowano za pomocą jednego montażu EEG na głowie. Moc spektralna typowego napadu wskazuje, że największa gęstość mieści się w zakresie od 10 do 40 Hz ze szczytem na 15 Hz. Protokół ten przedstawia ramy czasowe wystąpienia napadów u zwierząt po powtarzającym się spadku masy ciała, urazowym uszkodzeniu mózgu, demonstrując częstość występowania napadów u niektórych zwierząt i podkreślając znaczenie uzyskiwania ciągłych, a nie przerywanych nagrań.
Właściwe umieszczenie stalowego dysku, staranne wszczepienie elektrod śrubowych i staranne przewodów mają kluczowe znaczenie dla udanego długoterminowego eksperymentu. Po monitorowaniu EEG zwierzęta z uszkodzeniem mózgu, u których rozwijają się drgawki, można oddzielić od tych, u których nie występują, w celu późniejszej analizy ich różnic komórkowych, molekularnych i fizjologicznych. Stratyfikacja zwierząt z padaczką pourazową od tych, które doznały urazowego uszkodzenia mózgu, ale nie rozwijają napadów, ma kluczowe znaczenie dla opracowania interwencji i biomarkerów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje nowy model mysiego pourazowego epilepsji wywołanego łagodnym urazem mózgu. Szczegółowo opisuje indukcję urazu mózgu za pomocą zmodyfikowanego modelu upadku ciężaru i dostarcza instrukcji dotyczących pozyskiwania danych elektroencefalograficznych.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Uraz mózgu
- Elektrofizjologia
Tło
- Pourazowa epilepsja jest istotną konsekwencją urazu mózgu.
- Łagodny uraz mózgu często ma składnik rozproszony, naśladując ludzką patologię.
- Modele badawcze są niezbędne do opracowywania biomarkerów i metod leczenia.
- Ten model ma na celu wyjaśnienie mechanizmów upośledzenia funkcji mózgu po urazie.
Cel badania
- Ustanowienie wiarygodnego modelu zwierzęcego do badania pourazowej epilepsji.
- Naśladowanie ludzkich warunków urazu mózgu.
- Ułatwienie badań nad potencjalnymi lekami i biomarkerami.
Stosowane metody
- Indukcja łagodnego urazu mózgu metodą upadku ciężaru.
- Umieszczenie stalowego dysku na głowie myszy w celu indukcji urazu.
- Zbieranie danych elektroencefalograficznych do monitorowania aktywności mózgu.
- Ocena odruchu bólowego, aby zapewnić odpowiednie wywołanie urazu.
Główne wyniki
- Udana indukcja pourazowej epilepsji w modelu mysim.
- Ustanowienie protokołu pozyskiwania danych w elektroencefalografii.
- Wgląd w mechanizmy upośledzenia funkcji mózgu po urazie.
- Potencjał dla przyszłych badań nad biomarkerami i strategiami leczenia.
Wnioski
- Ten model zapewnia cennym narzędzie do badania pourazowej epilepsji.
- Wiążę się bliskie warunki ludzkiego urazu mózgu.
- Dalsze badania mogą prowadzić do postępów w leczeniu i rozumieniu tego stanu.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This model addresses a critical gap in preclinical epilepsy research by enabling study of diffuse traumatic brain injury without focal lesions, mirroring the majority of human TBI cases. It supports target validation and mechanistic de-risking for anti-epileptogenic interventions by providing a reproducible system to study epileptogenesis after mild, repetitive injury. The latency period and spontaneous seizure phenotype allow for longitudinal biomarker screening and therapeutic window assessment in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in diffuse TBI-induced epileptogenesis without confounding focal lesions.
- Operational Value: Provides a disease-relevant system for functional target validation and pathway clarification in acquired epilepsy.
- Predictive Value: Supports predictive confidence by modeling human-like latency and spontaneous seizure onset after mild injury.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantifiable electrographic seizure endpoints (10–40 Hz spectral power, peak at 15 Hz) for compound screening.
- Reproducibility: Standardized weight drop parameters (100g from 50cm) and electrode placement enable consistent seizure induction across cohorts.
- Scalability: Continuous video-EEG monitoring supports longitudinal assessment of seizure burden and clustering for therapeutic response evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Mirrors human PTE latency and seizure semiology, supporting biomarker alignment and preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Allows stratification of epileptic vs. non-epileptic TBI animals for mechanistic analysis of impairment and intervention response.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables evaluation of disease-modifying effects rather than acute seizure suppression, reducing late-stage biological risk.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for disease-modifying anti-epileptogenic strategies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of epileptogenic pathways following diffuse, non-lesional TBI.
- Screening: Enables assay development using continuous EEG readouts to quantify seizure incidence, duration, and spectral features.
- Analytics: Provides quantitative dependent variables (seizure onset latency, clustering, power spectra) for comparing genetic, pharmacological, or environmental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical validation via latency-period monitoring and spontaneous convulsive/non-convulsive seizure phenotypes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for chronic epilepsy modeling across genetic backgrounds and injury paradigms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in PTE etiology by isolating diffuse injury as a sufficient trigger for epileptogenesis.
- Operational Value: Standardizes surgical and induction procedures (disc placement, burr hole patterning, electrode soldering) for cross-site reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying compounds that modify epileptogenesis rather than merely suppress seizures.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on disease-modifying potential in a clinically reflective model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotactic surgery, EEG electrode implantation, and soldering techniques for reliable signal acquisition.
- Dependent on precise instrumentation: weight drop tube, high-speed drill (0.5mm bit, 5,000–6,000 RPM), and multi-channel EEG acquisition systems.
- Necessitates cross-team standardization of postoperative care protocols (heating pads, recovery gel, monitoring) to minimize variability in seizure latency.
- Adaptation considerations include model scalability to rat systems or alternative injury modalities while preserving diffuse injury characteristics.
- Practical limitations include surgical morbidity risk and the need for months-long monitoring, demanding sustained animal care and data management infrastructure.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:56
Weight Drop Traumatic Brain Injury (TBI)
2:01
Electroencephalography (EEG) Electrode Implantation Surgical Field Preparation
3:11
EEG Electrode Implantation
5:13
Results: Representative Spontaneous Seizure Depictions and Timelines
6:17
Conclusion
