Wywoływanie padaczki pourazowej w mysim modelu powtarzalnego rozlanego urazowego uszkodzenia mózgu

Nasz protokół jest pierwszym, który szczegółowo opisuje mysi model padaczki pourazowej wywołanej łagodnym urazowym uszkodzeniem mózgu. Zastosowanie łagodnego modelu rozlanego urazowego uszkodzenia mózgu naśladuje ważny aspekt patologii urazowego uszkodzenia mózgu u człowieka, który prawie zawsze ma składnik rozproszony. Aby opracować biomarkery i metody leczenia, potrzebne są badania z wykorzystaniem modeli, które odpowiednio odtwarzają aspekty patologii człowieka.

Nasz model urazowego uszkodzenia mózgu ma również potencjał, aby zapewnić wgląd w mechanizmy, które powodują upośledzenie funkcji mózgu po łagodnym urazowym uszkodzeniu mózgu lub wstrząśnieniu mózgu. Po potwierdzeniu braku reakcji na odruch bólowy umieść mysz na podkładce piankowej i umieść głowę myszy pod rurką zrzutu ciężaru. Umieść płaski krążek ze stali nierdzewnej o średnicy 1.3 centymetra i grubości jednego milimetra i wadze 880 miligramów na środku głowy zwierzęcia między oczami a uszami.

Usuń szpilkę w rurze zrzutu ciężarka, aby zwolnić 100-gramowy pręt z wysokości 50 centymetrów. Aby wywołać pozorowane obrażenia u myszy kontrolnych, usuń pręt obciążnika z rurki, aby zapobiec przypadkowemu zwolnieniu szpilki podczas spadku wagi. Po indukcji utraty masy ciała połóż zwierzę na poduszce grzewczej pokrytej sterylnym ręcznikiem chłonnym wyściełanym poliamidem z monitorowaniem aż do pełnego leżenia.

Następnie umieść mysz w czystej klatce, która została podgrzana na poduszce grzewczej z żelem regeneracyjnym i kilkoma zwilżonymi kawałkami karmy na 45 minut. Aby przygotować pole operacyjne do wszczepienia elektrody EEG, umieść czujnik temperatury na podkładce i umieść znieczuloną mysz z uszkodzonym mózgiem na sterylnej serwety na poduszce grzewczej na aparacie stereotaktycznym. Po utrwaleniu głowy za pomocą nauszników nałóż maść nawilżającą na oczy zwierzęcia i użyj kremu do depilacji, aby usunąć włosy ze skóry głowy.

Zdezynfekuj odsłoniętą skórę trzema 20-sekundowymi naprzemiennymi wacikami z powidonu, jodem, chirurgicznym roztworem antyseptycznym i 70% etanolem okrężnymi ruchami. Po usunięciu skóry głowy nałóż małe hemostatyki na otwarte granice skóry, aby rozszerzyć odsłonięty obszar. Następnie za pomocą skalpela delikatnie usuń okostną i przetrzyj czaszkę wodą utlenioną.

Gdy czaszka zostanie oczyszczona z tkanki i zacznie mieć białawy wygląd, osusz kość sterylną gazą lub wacikiem. Do implantacji elektrod użyj wiertła szybkoobrotowego z okrągłym wiertłem stalowym o średnicy 0,5 milimetra z prędkością od 5 000 do 6 000 obrotów na minutę, aby utworzyć sześć otworów na zadziory dla elektrod śrubowych. Po wywierceniu wszystkich otworów umieść sześć elektrod śrubowych w otworach na zadziory i wymieszaj pół miarki proszku cementu dentystycznego z kilkoma kroplami rozpuszczalnika.

Użyj szpatułki, aby mieszać, aż mieszanka cementu dentystycznego będzie lepka, ale plastyczna i wystarczająco sztywna, aby mogła się odpowiednio zagęścić po umieszczeniu na czaszce zwierzęcia. Nałóż cement na całą odsłoniętą powierzchnię czaszki i każdą elektrodę. Po jednej do dwóch minut włącz lutownicę i umieść trzy mocowania głowicy EEG w ramieniu uchwytu stereotaktycznego.

Umieść mocowanie głowicy nad czaszką tak, aby sześć pozycji przewodów drutu odpowiadało położeniu przewodu każdego elektrody śrubowej. Opuść urządzenie tak, aby jego brzuszna część spoczywała na cemencie dentystycznym. Skręć drut każdego przewodu z każdej z elektrod śrubowych z odpowiednim przewodem drutu mocowania głowicy, każdą skręconą parę przewodów, aby zapewnić prawidłowe przewodzenie sygnału i użyj nożyczek, aby przyciąć nadmiar drutu.

Zegnij każdą przylutowaną parę przewodów wokół mocowania głowicy. Gdy wszystkie pary zostaną zgięte, przykryj cały drut świeżym cementem dentystycznym, pozostawiając odsłoniętą tylko czarną część mocowania głowy. Uwolnij hemostatyki przytrzymujące płaty skóry i nałóż środek antyseptyczny z chlorheksydyną na obszar wokół implantu, aby uniknąć infekcji.

Następnie przenieś zwierzę z aparatu na wagę, aby zmierzyć wagę zwierzęcia jako odniesienie do przyszłego monitorowania przed umieszczeniem zwierzęcia w czystej klatce na ciepłej poduszce grzewczej z monitorowaniem, żelem regeneracyjnym i kilkoma zwilżonymi kawałkami karmy. Na tym rysunku pokazano spontaniczny napad padaczkowy u myszy 97 dni po wielokrotnym spadku masy ciała urazowym uszkodzeniu mózgu zarejestrowanym za pomocą trzech mocowań EEG na głowę skonfigurowanych tak, jak pokazano w tym protokole wideo. Pokazano tu spontaniczny, niekonwulsyjny napad elektrograficzny zarejestrowany u myszy 65 dni po powtarzającym się urazie mózgu spowodowanym spadkiem wagi.

Na tym rysunku spontaniczny napad padaczkowy u myszy 23 dni po wielokrotnym urazie mózgu spowodowanym spadkiem masy ciała zarejestrowano za pomocą jednego montażu EEG na głowie. Moc spektralna typowego napadu wskazuje, że największa gęstość mieści się w zakresie od 10 do 40 Hz ze szczytem na 15 Hz. Protokół ten przedstawia ramy czasowe wystąpienia napadów u zwierząt po powtarzającym się spadku masy ciała, urazowym uszkodzeniu mózgu, demonstrując częstość występowania napadów u niektórych zwierząt i podkreślając znaczenie uzyskiwania ciągłych, a nie przerywanych nagrań.

Właściwe umieszczenie stalowego dysku, staranne wszczepienie elektrod śrubowych i staranne przewodów mają kluczowe znaczenie dla udanego długoterminowego eksperymentu. Po monitorowaniu EEG zwierzęta z uszkodzeniem mózgu, u których rozwijają się drgawki, można oddzielić od tych, u których nie występują, w celu późniejszej analizy ich różnic komórkowych, molekularnych i fizjologicznych. Stratyfikacja zwierząt z padaczką pourazową od tych, które doznały urazowego uszkodzenia mózgu, ale nie rozwijają napadów, ma kluczowe znaczenie dla opracowania interwencji i biomarkerów.