Name: Wewnątrzprzedmiotowy projekt eksperymentalny wykorzystujący zadanie lokalizacji obiektu w szczurach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Poznaj protokół zadania lokalizacji obiektu w szczurach do badania pamięci przestrzennej. Metoda umożliwia powtarzalne testowanie z kontrbalansowaniem, zwiększając moc statystyczną i redukując liczbę zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Antonios Asiminas, Dorothy Tse, Kiichi O'Hara i Davidowi Bettowi za wnikliwe komentarze i sugestie. Badanie to było wspierane przez program Erasmus+ (dla G.B. i L.N.); Graduate School of Health, Uniwersytet w Aarhus (do K.H.); Nagroda dla Młodego Badacza Fundacji Novo Nordisk 2017 (NNF17OC0026774), Lundbeckfonden (DANDRITE-R248-2016-2518) oraz PROMEMO - Center for Proteins in Memory, Centrum Doskonałości finansowane przez Duńską Narodową Fundację Badawczą (DNRF133) (do T.T.).

<ol><li>Hughes, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neotic+preferences+in+laboratory+rodents%3A+issues%2C+assessment+and+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Biobehavioral+Reviews%22%5BJournal%5D)">Neotic preferences in laboratory rodents: issues, assessment and substrates.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 31 (3), 441-464 (2007).</li>
<li>Blaser, R., Heyser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+object+recognition%3A+a+promising+approach+to+the+comparative+study+of+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spontaneous object recognition: a promising approach to the comparative study of memory.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 183(2015).</li>
<li>Dix, S. L., Aggleton, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+the+spontaneous+preference+test+of+recognition%3A+evidence+of+object-location+and+object-context+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Extending the spontaneous preference test of recognition: evidence of object-location and object-context recognition.</a> Behavioral Brain Research. 99 (2), 191-200 (1999).</li>
<li>Barker, G. R., Warburton, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+is+the+hippocampus+involved+in+recognition+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">When is the hippocampus involved in recognition memory.</a> Journal of Neuroscience. 31 (29), 10721-10731 (2011).</li>
<li>Mumby, D. G., Gaskin, S., Glenn, M. J., Schramek, T. E., Lehmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+damage+and+exploratory+preferences+in+rats%3A+memory+for+objects%2C+places%2C+and+contexts%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+%26+Memory%22%5BJournal%5D)">Hippocampal damage and exploratory preferences in rats: memory for objects, places, and contexts.</a> Learning & Memory. 9 (2), 49-57 (2002).</li>
<li>Gulinello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rigor+and+reproducibility+in+rodent+behavioral+research%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Rigor and reproducibility in rodent behavioral research.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 165, 106780(2019).</li>
<li>Rudeck, J., Vogl, S., Banneke, S., Schonfelder, G., Lewejohann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeatability+analysis+improves+the+reliability+of+behavioral+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Repeatability analysis improves the reliability of behavioral data.</a> PLoS One. 15 (4), 0230900(2020).</li>
<li>Gouveia, K., Hurst, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimising+reliability+of+mouse+performance+in+behavioural+testing%3A+the+major+role+of+non-aversive+handling%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Optimising reliability of mouse performance in behavioural testing: the major role of non-aversive handling.</a> Scientific Reports. 7, 44999(2017).</li>
<li>Migues, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+synaptic+removal+of+GluA2-containing+AMPA+receptors+prevents+the+natural+forgetting+of+long-term+memories%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Blocking synaptic removal of GluA2-containing AMPA receptors prevents the natural forgetting of long-term memories.</a> Journal of Neuroscience. 36 (12), 3481-3494 (2016).</li>
<li>Maingret, N., Girardeau, G., Todorova, R., Goutierre, M., Zugaro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampo-cortical+coupling+mediates+memory+consolidation+during+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hippocampo-cortical coupling mediates memory consolidation during sleep.</a> Nature Neuroscience. 19 (7), 959-964 (2016).</li>
<li>Chao, O. Y., de Souza Silva, M. A., Yang, Y. M., Huston, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+medial+prefrontal+cortex+-+hippocampus+circuit+that+integrates+information+of+object%2C+place+and+time+to+construct+episodic+memory+in+rodents%3A+Behavioral%2C+anatomical+and+neurochemical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Biobehavioral+Reviews%22%5BJournal%5D)">The medial prefrontal cortex - hippocampus circuit that integrates information of object, place and time to construct episodic memory in rodents: Behavioral, anatomical and neurochemical properties.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 113, 373-407 (2020).</li>
<li>Takeuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus+coeruleus+and+dopaminergic+consolidation+of+everyday+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory.</a> Nature. 537 (7620), 357-362 (2016).</li>
<li>Witten, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinase-driver+rat+lines%3A+tools%2C+techniques%2C+and+optogenetic+application+to+dopamine-mediated+reinforcement%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Recombinase-driver rat lines: tools, techniques, and optogenetic application to dopamine-mediated reinforcement.</a> Neuron. 72 (5), 721-733 (2011).</li>
<li>Costa, R., Tamascia, M. L., Nogueira, M. D., Casarini, D. E., Marcondes, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Handling+of+adolescent+rats+improves+learning+and+memory+and+decreases+anxiety%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Labaratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Handling of adolescent rats improves learning and memory and decreases anxiety.</a> Journal of the American Association for Labaratory Animal Science. 51 (5), 548-553 (2012).</li>
<li>Schmitt, U., Hiemke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+differences+in+open-field+and+elevated+plus-maze+behavior+of+rats+without+and+with+pretest+handling%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+Biochemistry+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Strain differences in open-field and elevated plus-maze behavior of rats without and with pretest handling.</a> Pharmacology Biochemistry and Behavior. 59 (4), 807-811 (1998).</li>
<li>Kosten, T. A., Kim, J. J., Lee, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+life+manipulations+alter+learning+and+memory+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Biobehavioral+Reviews%22%5BJournal%5D)">Early life manipulations alter learning and memory in rats.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 36 (9), 1985-2006 (2012).</li>
<li>Denenberg, V. H., Grota, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social-seeking+and+novelty-seeking+behavior+as+a+function+of+differential+rearing+histories%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Abnormal+and+Social+Psychology%22%5BJournal%5D)">Social-seeking and novelty-seeking behavior as a function of differential rearing histories.</a> Journal of Abnormal and Social Psychology. 69 (4), 453-456 (1964).</li>
<li>Clemens, L. E., Jansson, E. K., Portal, E., Riess, O., Nguyen, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+behavioral+comparison+of+the+common+laboratory+rat+strains+Lister+Hooded%2C+Lewis%2C+Fischer+344+and+Wistar+in+an+automated+homecage+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Brain%2C+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">A behavioral comparison of the common laboratory rat strains Lister Hooded, Lewis, Fischer 344 and Wistar in an automated homecage system.</a> Genes, Brain, and Behavior. 13 (3), 305-321 (2014).</li>
<li>Ennaceur, A., Michalikova, S., Bradford, A., Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+analysis+of+the+behavior+of+Lister+and+Wistar+rats+in+anxiety%2C+object+recognition+and+object+location+tasks%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Detailed analysis of the behavior of Lister and Wistar rats in anxiety, object recognition and object location tasks.</a> Behavioral Brain Research. 159 (2), 247-266 (2005).</li>
<li>Deacon, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Housing%2C+husbandry+and+handling+of+rodents+for+behavioral+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments.</a> Nature Protocols. 1 (2), 936-946 (2006).</li>
<li>Contreras, M. P., Born, J., Inostroza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+allocentric+object-place+recognition+memory+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The expression of allocentric object-place recognition memory during development.</a> Behavioral Brain Research. 372, 112013(2019).</li>
<li>Yaski, O., Eilam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+global+and+local+geometries+shape+exploratory+behavior+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">How do global and local geometries shape exploratory behavior in rats.</a> Behavioral Brain Research. 187 (2), 334-342 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zadanie lokalizacji obiektów może być wykorzystywane w różnych badaniach do badania pamięci przestrzennej, jak opisano wcześniej. Elastyczność konfiguracji umożliwia modelowanie pamięci krótkotrwałej i długotrwałej o różnej sile i może być łatwo wdrożona przy niskich kosztach. Ponieważ jednak w protokole znajduje się wiele parametrów, które mogą wpływać na wyniki, a różne badania różnią się nieznacznie w tych parametrach6, można napotkać trudności z pomyślnym wdrożeniem zadania po raz pierwszy. Powyższy protokół ma na celu płynne przeprowadzenie czytelników przez ten proces. Dalsze kluczowe kroki, które mogą mieć znaczenie dla pomyślnej realizacji zadania z dużą powtarzalnością, zostaną omówione poniżej.
Chociaż sesja kodowania/testowania często jest głównym celem podczas przeprowadzania eksperymentów z lokalizacją obiektów, protokoły obsługi i przyzwyczajenia mają głęboki wpływ na wynik tego rodzaju testów behawioralnych, w których wynik zależy od niezakłóconego naturalnego zachowania szczurów14,15. W związku z tym kroki poprzedzające sesję kodowania/testową powinny być zaprojektowane z ostrożnością, ponieważ mogą wpływać na zachowanie i pamięć szczurów, a w konsekwencji wpływać na wyniki końcowe. Dobry poziom obchodzenia się i przyzwyczajenia, tak aby szczury zapoznały się z eksperymentatorem i zadaniem, zminimalizuje wpływ czynników stresowych, jednocześnie zwiększając prawdopodobieństwo wykazywania naturalnych zachowań8. Jak wspomniano w protokole, obchodzenie się z młodymi może rozpocząć się już w momencie odsadzenia szczeniąt, jeśli szczep szczura jest utrzymywany w obiekcie macierzystym. Opierając się na wcześniejszych doświadczeniach (dane nie pokazane) oraz na podstawie kilku wcześniejszych badań16,17, ta wczesna obsługa skutkuje niskim poziomem lęku i zwiększoną ciekawością w kolejnych miesiącach.
Ponieważ zadanie lokalizacji obiektu zależy wyłącznie od wewnętrznego popędu eksploracyjnego szczurów, oczekiwane zachowanie może być łatwo utrudnione, jeśli szczury nie są chętne do eksploracji lub niechętnie zbliżają się do nowości, co jest określane jako "zachowanie neofobiczne"1. W związku z tym zdecydowanie zaleca się dołączenie dokładnego protokołu postępowania i habituacji zgodnie z konkretnymi potrzebami badania. Protokół ten może być wykorzystany jako przewodnik po minimalnych wymaganiach, a dalsze kroki mogą zostać wdrożone (np. jeśli badanie ma obejmować wstrzyknięcia na późniejszym etapie, wymagane jest przyzwyczajenie do procedur iniekcji i określona pozycja trzymania). Szczep i wiek szczurów doświadczalnych to dwa inne wpływowe czynniki, które należy wziąć pod uwagę przed planowaniem eksperymentu, aby uniknąć nieoptymalnych wyników. Różne szczepy szczurów mogą mieć różne zachowania i wyjściowe poziomy lęku 18,19,20, dlatego w zależności od zastosowanego szczepu może być wymagane specyficzne dostosowanie protokołu.
Potwierdzono, że protokół ten działa dobrze u transgenicznych szczurów Th-Cre ze szczepem Long-Evans czterokrotnie skrzyżowanym wstecznie ze szczepem Lister Hooded i dzikim typem Lister Hooded. Logicznie idealny wiek początkowy dla szczurów w eksperymentach behawioralnych to około 12 tygodni20, ale należy wziąć pod uwagę zmienność między szczepami i specyficzne wymagania zadania. Możliwe jest również wykorzystanie rozwijających się szczurów, jeśli jest to interesujące dla badania, chociaż mogą być wymagane korekty w protokole, które nie są tutaj uwzględnione. Jednak ważne jest, aby zastanowić się, czy szczur w danym wieku rozwinął funkcje poznawcze wymagane do skutecznego wykonania tego zadania. Badanie21 badające tę kwestię wykazało, że tylko dorastające szczury w 38. dniu po urodzeniu, a nie wcześniej, wykazywały allocentryczną pamięć przestrzenną odzwierciedloną w preferencji dla obiektu w nowej lokalizacji, jak zaobserwowano u dorosłych szczurów. Przedstawiony tutaj protokół okazał się skuteczny na szczurach, które miały 15-16 tygodni na początku pierwszej sesji kodowania/testu. Wcześniej ten sam protokół silnego kodowania dawał wyniki nieoptymalne lub ujemne przy użyciu 23-tygodniowych szczurów, które nie osiągnęły optymalnego poziomu przyzwyczajenia z powodu braku obsługi i przyzwyczajenia w wystarczająco młodym wieku. Szczury te albo nie zachowywały się inaczej niż na poziomie przypadku, albo w rzeczywistości wykazywały awersję do nowości, co zaobserwowano w kategoriach preferencji dla stabilnych obiektów zamiast obiektów przemieszczonych (dane nie pokazane). Wyniki te dostarczają dowodów na to, że wiek i czas obchodzenia się z habituacją mogą mieć wpływ na skuteczność habituacji, a w efekcie przyczyniać się do obserwacji zachowań lękowych i neofobicznych w testach.
W tym miejscu przedstawiono dwa różne protokoły, zapewniające silne lub słabe kodowanie w zadaniu lokalizacji obiektu. Podczas ustanawiania tych protokołów zaobserwowano, że zainteresowanie obiektami spadało po 5-10 minutach eksploracji podczas pojedynczych długich prób (np. 20-minutowego kodowania), a szczury ostatecznie przestały eksplorować. Powoduje to słabszą pamięć lokalizacji obiektów. Protokół kodowania, który przeplata próby kodowania krótkimi okresami odpoczynku (np. kodowanie 3 x 5 min), przezwycięża ten problem i prowadzi do wysokiej eksploracji podczas prób. Tak więc czas aktywnej eksploracji i różny układ tych dwóch protokołów kodowania wpływa na siłę pamięci, która jest silniejsza po kodowaniu 3 x 5 min niż po 20-minutowych protokołach kodowania. Podobne wyniki można również osiągnąć przy użyciu nieco innych czasów trwania w przypadku pojedynczych protokołów badania klinicznego w porównaniu z protokołami badania z przeplotem, a także można dokonać korekt w celu dostosowania do potrzeb badania i szczepu szczurów.
W przeciwieństwie do protokołów wykorzystujących zwykłe, białe, otwarte pole z tylko zewnętrznymi wskazówkami w pomieszczeniu, przedstawiony tutaj protokół wykorzystuje arenę z odrębnymi kontekstami i wskazówkami wewnątrz labiryntu, które prawdopodobnie wymagają więcej czasu na naukę. W związku z tym zaleca się dodanie kroku habituacji kontekstu w protokole przed próbą kodowania. Pozwoli to szczurom na stworzenie mapy przestrzennej każdego kontekstu podczas habituacji i skróci czas trwania kolejnej próby kodowania, ponieważ szczury będą musiały zakodować tylko lokalizacje obiektów w odniesieniu do tej mapy. Co więcej, przyzwyczajenie do kontekstu pozwoli szczurom przyzwyczaić się do wszelkich możliwych dystraktorów w każdym kontekście, takich jak wskazówki przestrzenne 3D, minimalizując zachowania inne niż eksploracja obiektów w następnej sesji kodowania/testu. Dzięki wdrożeniu dokładnej metody równoważenia składającej się z kilku poziomów (tj. szerokiego zakresu kombinacji lokalizacji obiektów (liczników) i kierunku przemieszczenia obiektu), niepożądane preferencje, które mogą wzrosnąć z powodu różnic w natężeniu światła i kolorach/wzorach ścian w rogach areny, są zminimalizowane.
Podczas powtarzania zadania należy wziąć pod uwagę kilka czynników, aby zwiększyć powtarzalność między sesjami kodowania/testowego i zminimalizować wpływ powtórzeń. Po pierwsze, należy zaprojektować odrębne konteksty (tak wiele, jak liczba powtórzeń sesji kodowania/testów), aby uniknąć akumulacji pamięci przestrzennej, która może być spowodowana wykonywaniem powtarzających się sesji przy użyciu tego samego kontekstu. Aby to osiągnąć, użyto aparatu z wymiennymi ściankami o różnych kolorach i wzorach (ryc. 1B,C). Wyraźne ściany i obiekty 3D (takie jak zabawki lub małe przedmioty codziennego użytku o różnych kolorach i kształtach, patrz protokół i rysunek 1C) zawieszone na ścianach są przestrzennymi wskazówkami i punktami orientacyjnymi, których szczury potencjalnie używają do uczenia się lokalizacji obiektów w odniesieniu do ich kontekstów. W przypadku, gdy test nie wytworzy preferencji dla poruszanego obiektu, można rozważyć zmianę tych parametrów kontekstu (projekt ściany i wskazówki przestrzenne). Alternatywnie, do zadań związanych z lokalizacją obiektów można użyć areny w kształcie prostokąta lub koła zamiast kwadratowej areny, jak w tym protokole. Mówi się, że okrągłe areny eliminują preferencje dotyczące narożników22, które często obserwuje się na arenach z rogami, a zatem mogą być korzystne, gdy mamy do czynienia ze szczególnie niespokojnym szczepem szczurów lub myszy. Podczas gdy wymagania dotyczące tworzenia czterech odrębnych kontekstów w tym protokole działają najbardziej optymalnie w przypadku czworokątnego kształtu, okrągła arena może być również funkcjonalna po pewnych poprawkach.
Po drugie, odstępy czasu między każdą sesją kodowania/testowania powinny być określone w taki sposób, aby szczury za każdym razem zachowywały ten sam poziom zainteresowania, unikając jednocześnie ryzyka skumulowanego uczenia się wynikającego z gęstego harmonogramu powtórzeń. Zazwyczaj wystarczający jest interwał co najmniej dwukrotnie dłuższy niż czas opóźnienia między kodowaniem a próbami testowymi, przy czym dłuższe interwały są bardziej korzystne dla więcej niż dwóch powtórzeń. Oznacza to, że podczas gdy minimum 48-godzinny odstęp po 24-godzinnym teście jest wystarczający dla jednego lub dwóch powtórzeń, zaleca się stosowanie 1-tygodniowego odstępu dla czterech powtórzeń. Jak pokazują wyniki przedstawione na rysunku 5 oraz porównanie za pomocą ANOVA, zadanie można z powodzeniem powtórzyć czterokrotnie. Na tej podstawie ustalony protokół może być wykorzystany do zrównoważenia do czterech warunków eksperymentalnych. Liczba grup eksperymentalnych określa liczbę powtórzeń sesji kodowania/prób w różnych kontekstach. Wyniki przedstawione na rysunku 5 reprezentują jeden z możliwych sposobów wykorzystania protokołu z dwiema grupami eksperymentalnymi. Grupy zostały zrównoważone w dwóch sesjach, a te same warunki powtórzono w dwóch dodatkowych sesjach (dla celów walidacji). Drugi zestaw sesji z przeciwwagą może być również wykorzystany do zrównoważenia nowych warunków. Podobnie, trzy lub cztery warunki eksperymentalne mogą być porównane za pomocą odpowiednio trzech lub czterech sesji z przeciwwagą.
W takich przypadkach konteksty powinny być zaprojektowane tak, aby uwzględniały kontrastujące cechy opisane w protokole. Warto zauważyć, że konstrukcja z przeciwwagą może nie być odpowiednia dla eksperymentów, w których mają być stosowane dodatkowe manipulacje, takie jak interwencja farmakologiczna, która może pozostawić długotrwały efekt lub uszkodzenie. Aby utrzymać skuteczność i powtarzalność testów, eksperyment powinien być odpowiednio zaprojektowany. Dane z powtarzanych testów mogą być prezentowane i analizowane na kilka sposobów, jak pokazano na rysunku 5. W celu wstępnej analizy, grupy eksperymentalne w każdym kontekście mogą być indywidualnie porównane do poziomu szansy za pomocą testu t dla jednej próby w celu określenia wszelkich istotnych preferencji (Rysunek 5B,D). Może to być pomocne w szybkim zrozumieniu danych, ale zapewnia tylko pośrednie porównanie grup. Tak więc, aby porównać dwie lub więcej grup, dane należy analizować za pomocą testów t dla dwóch prób (sparowanych lub niesparowanych) lub odpowiednio ANOVA. Może to mieć formę międzyosobowego porównania grup w ramach jednej sesji kodowania/testu (Rysunek 4A i Rysunek 5B,D) lub wewnątrzobiektowego porównania grup z dwóch (lub więcej) równoważonych kontekstów (Rysunek 5C,E). Ta ostatnia metoda jest zdecydowanie zalecana, zwłaszcza gdy mamy do czynienia ze słabymi warunkami pamięci, co, jak wyjaśniono wcześniej, skutkuje dużą wariancją z powodu losowości w zachowaniu.
Połączenie zrównoważonych kontekstów prowadzi do powstania większych grup, które są zobowiązane do wiarygodnej wizualizacji zachowania grupy przy minimalnej zmienności. Stosując protokół z powtórzeniami w sesjach z przeciwwagą, można spodziewać się zmniejszenia liczby szczurów do około jednej trzeciej liczby, która byłaby wymagana przy użyciu pojedynczego testu o tej samej mocy statystycznej. Zwykle wystarczająca jest wielkość próby w zakresie od 7 do 15 szczurów (łącznie) dla sesji z przeciwwagą i w zakresie od 20 do 50 szczurów (od 10 do 25 na grupę) dla pojedynczej sesji, przy wielkości efektu i mocy większej niż 0,8. Zmniejszenie liczby potrzebnych zwierząt i wzrost informacji, które uzyskujemy od każdego zwierzęcia za pomocą tego protokołu, zarówno udoskonala badanie, jak i służy zasadom 3R etycznego wykorzystywania zwierząt w badaniach. Na tym etapie ważne jest, aby pamiętać, że losowe zachowanie szczurów, któremu nie towarzyszy silna pamięć, może skutkować indywidualnymi silnymi preferencjami zarówno poniżej, jak i powyżej szansy, ale średnia grupowa powinna dawać preferencję nie różniącą się znacząco od przypadku. Poszczególne dane należy interpretować ostrożnie. Rozkład poszczególnych punktów danych w grupie może być również pomocny w interpretacji wyników. Jak widać na rys. 4 i rys. 5, rozkład zmienia się w zależności od siły pamięci. Ogólnie rzecz biorąc, przedstawiony tutaj protokół może być łatwo zastosowany w celu realizacji zadania lokalizacji obiektu z powtórzeniami w celu modelowania krótkotrwałej i/lub długotrwałej pamięci przestrzennej. Prosty i elastyczny protokół treningowy oraz możliwość wdrażania kolejnych manipulacji sprawiają, że zadanie to jest popularnym wyborem. Te modyfikacje protokołu umożliwiają badanie poszczególnych kroków, takich jak pozyskiwanie, konsolidacja i przywoływanie pamięci.

Spontaniczne zadania rozpoznawania (np. rozpoznawanie obiektów, rozpoznawanie miejsc obiektów) były wykorzystywane w dużym stopniu w badaniu pamięci u gryzoni. Testy te różnią się od różnych testów używanych do oceny pamięci, które opierają się na warunkowaniu strachu lub motywacji nagrody, w tym, że spontaniczne zadania rozpoznawania opierają się wyłącznie na spontanicznym zachowaniu eksploracyjnym w kierunku nowych bodźców. To zachowanie, określane jako 'preferencja neotyczna'1, jest nieodłączne dla gryzoni, jak również dla innych gatunków ssaków i niektórych nie-ssaków, takich jak ptaki i ryby2. Rozpoznawanie miejsca obiektu, które zależy od pamięci przestrzennej, można obserwować za pomocą zadania lokalizacji obiektu (znanego również jako zadanie rozpoznawania obiektów przestrzennych)3. Badania nad zmianami chorobowymi wykazały, że rozpoznawanie miejsc obiektów wymaga nienaruszonego hipokampa4,5. Ze względu na stosunkowo prosty protokół treningowy i brak jakiegokolwiek wzmocnienia, zadanie to jest preferowane w wielu badaniach. Brak zarówno pozytywnego, jak i negatywnego wzmocnienia minimalizuje dodatkowe parametry i obszary mózgu, które mogą kierować zachowaniem. W związku z tym zachowanie tutaj jest neutralne i opiera się na ciekawości i pamięci przestrzennej, co pozwala na badanie mechanizmów, które są zaangażowane w kodowanie, konsolidację i odzyskiwanie pamięci przestrzennej.
Protokół zadania lokalizacji obiektów zazwyczaj składa się z sesji habituacji, po których następuje pojedyncza sesja kodowania i prób testowych, oddzielonych okresem opóźnienia, który waha się od kilku minut do godzin. Zdecydowanie zaleca się, aby szczury były traktowane wcześniej, aby zminimalizować poziom stresu zwierząt, a co za tym idzie, zachowanie, które może wpływać na pamięć rozpoznawczą, takie jak niechęć do nowości. Podobnie, dobrze zaprojektowany protokół habituacji odgrywa istotną rolę w zapobieganiu stresowi, który może utrudniać naturalne zachowanie szczura podczas zadania. Jednak zakres obsługi i przyzwyczajenia różni się znacznie między laboratoriami i eksperymentatorami, co może przyczyniać się do niskiej powtarzalności6,7,8. W próbie kodowania szczur ma czas na zbadanie areny z dwoma identycznymi obiektami umieszczonymi w dwóch wyznaczonych rogach. W próbie testowej, która jest opóźniona o pewien okres, szczur ma czas na zbadanie areny za pomocą tej samej pary obiektów, ale tym razem jeden z nich został przeniesiony w nowe miejsce. Spontaniczna preferencja wykazywana przez szczury i wynikający z niej wzrost czasu spędzonego na eksploracji obiektu w nowej lokalizacji wskazują na rozpoznanie przestrzenne i pamięć lokalizacji obiektów3. Modyfikacja próby kodowania (czas trwania i liczba powtórzeń) wpływa na siłę pamięci.
W zależności od celu badania, długość opóźnienia między kodowaniem a próbami testowymi może być modyfikowana w celu modelowania pamięci krótkotrwałej niezależnej od syntezy białek lub pamięci długotrwałej zależnej od syntezy białek. W związku z tym zadanie lokalizacji obiektu może być wykorzystywane do wielu różnych badań, dostosowując protokół w razie potrzeby. Co więcej, między tymi badaniami możliwe jest również zastosowanie manipulacji eksperymentalnych, takich jak interwencje farmakologiczne i optogenetyczne, podobnie jak obrazowanie in vivo. Istnieje kilka badań9,10, które informują o powtarzających się iteracjach zadania lokalizacji obiektów w tej samej kohorcie szczurów. Kontrastuje to z tradycyjnym zastosowaniem, w którym jedno zwierzę ma jedną sesję bez powtórzeń. Jednak skuteczność tych paradygmatów nie została dokładnie zbadana, ani nie ma żadnych prac metodycznych je opisujących. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, jest to pierwszy zgłoszony opis protokołu, który szczegółowo opisuje zadanie lokalizacji obiektu z maksymalnie czterema powtórzeniami przy użyciu tej samej kohorty szczurów, która również systematycznie porównuje wyniki z każdego powtórzenia. Powtórzenia mogą być wykorzystane do zrównoważenia warunków eksperymentalnych, aby umożliwić porównanie wewnątrz obiektu ze zmniejszoną zmiennością między testami. Niezawodna powtarzalność zadania pozwala na łączenie danych, co oznacza, że wystarczająco duża ilość danych może zostać wygenerowana przy użyciu stosunkowo niewielkiej liczby szczurów. Wreszcie, powtórzenia z użyciem tego samego szczura mogą być korzystne w eksperymentach obejmujących operacje chirurgiczne i implantacje, zmniejszając liczbę wymaganych szczurów, co w konsekwencji oszczędza czas i koszty pracy.
To badanie przedstawia obszerny protokół szczegółowo opisujący, jak wykonać zadanie lokalizacji obiektów u dorosłych szczurów za pomocą prób silnego i słabego kodowania, a następnie prób testowych z opóźnieniami 1-godzinnymi i 24-godzinnymi. Protokół silnego kodowania wytwarza statystycznie istotną pamięć rozpoznawczą podczas testowania z opóźnieniami 1-godzinnymi i 24-godzinnymi, a zatem może być używany do badania zarówno wspomnień krótkotrwałych, jak i długotrwałych po zastosowaniu manipulacji w celu zahamowania tych wspomnień11. W przeciwieństwie do tego, słaby protokół kodowania generuje znaczną ilość pamięci krótkotrwałej tylko wtedy, gdy jest testowany z 1-godzinnym opóźnieniem. Brak pamięci długotrwałej może być wykorzystany do badania manipulacji w celu zwiększenia zapamiętywania pamięci11,12. Protokół ten obejmuje również szczegółowe sesje obsługi i habituacji, które mają na celu zwiększenie możliwości powielania zadania lokalizacji obiektu. Artykuł ten pokazuje również powtórzenie zadania w czterech różnych kontekstach z tą samą kohortą szczurów przy użyciu protokołu słabego kodowania, który potwierdza, że za każdym razem daje powtarzalne i spójne wyniki.

<table><tbody><tr><td>Pole otwarte/eksperymentalne</td><td>O'Hara & Co (Japonia)</td><td>OF-3001</td><td>Otwarta skrzynka polowa do zadania lokalizacji obiektu</td></tr><tr><td>Obiekt 1: stożki</td><td>O'Hara & Co (Japonia)</td><td>ORO-RR</td><td></td></tr><tr><td>Obiekt 2: piłki nożne</td><td>O'Hara & Co (Japonia)</td><td>ORO-RB</td><td></td></tr><tr><td>Obiekt 3: prostokątne bloki</td><td>O'Hara & Co (Japonia)</td><td>ORO-RC</td><td>Bloki prostokątne zostały zmodyfikowane po zakupie</td></tr><tr><td>Aparatura do zadań lokalizacji obiektów</td><td>O'Hara & Co (Japonia)</td> <td>SPP-4501</td><td>Skrzynka tłumiąca dźwięk, która zawiera skrzynkę otwartego pola do zadania lokalizacji obiektu</td></tr><tr><td>Oprogramowanie śledzące</td><td>O'Hara & Co (Japonia)</td><td>TimeSSI</td><td>Do śledzenia ruchu i funkcji automatycznej kamery</td></tr><tr><td>Dziki typ Lister Szczury kapturowe</td><td>Charles River</td><td>603</td><td></td></tr></tbody></table>

wewnątrzprzedmiotowy projekt eksperymentalny wykorzystujący zadanie lokalizacji obiektu w szczurach

A Within-Subject Experimental Design using an Object Location Task in Rats

Rozpoznawanie miejsc obiektów jest główną metodą używaną do badania pamięci przestrzennej u gryzoni. Ta pamięć rozpoznawania miejsca obiektu stanowi podstawę zadania lokalizacji obiektu. Niniejszy artykuł zawiera obszerny protokół, który pomoże w ustaleniu zadania lokalizacji obiektu z opcją do czterech powtórzeń przy użyciu tej samej kohorty szczurów. Zarówno słabe, jak i silne protokoły kodowania mogą być wykorzystywane do badania krótko- i długoterminowych wspomnień przestrzennych o różnej sile oraz do umożliwienia realizacji odpowiednich manipulacji hamujących lub wzmacniających pamięć. Ponadto, powtórzenie testu z przedstawioną tutaj przeciwwagą pozwala na połączenie wyników z dwóch lub więcej testów w celu porównania wewnątrz obiektu w celu zmniejszenia zmienności między szczurami. Ta metoda pomaga zwiększyć moc statystyczną i jest zdecydowanie zalecana, szczególnie w przypadku przeprowadzania eksperymentów, które powodują dużą zmienność indywidualnych zachowań. To bezpośrednio udoskonala badanie poprzez zwiększenie ilości danych uzyskanych od każdego zwierzęcia i zmniejszenie ogólnej liczby potrzebnych zwierząt. Wreszcie, realizacja zadania polegającego na powtarzalnej lokalizacji obiektu zwiększa efektywność badań, które obejmują zabiegi chirurgiczne, oszczędzając czas i pracę.

Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki dla protokołów kodowania silnego i słabego, opisanych z użyciem samców szczurów transgenicznych tyrozynohydroksylazy (Th)-Cre13 szczepu Long-Evans, wstecznie skrzyżowanych czterokrotnie ze szczepem Lister Hooded, oraz szczurów typu dzikiego Lister Hooded. Wykorzystano szczury transgeniczne Th-Cre, ponieważ linia ta będzie stosowana w przyszłych badaniach z zakresu optogenetyki. W każdym protokole pamięć testowano z opóźnieniem 1 i 24 h. Testy po 1 h obrazują pamięć krótkotrwałą, natomiast testy po 24 h obrazują pamięć długotrwałą. Wartość wykluczająca dla preferencji kodowania została obliczona zgodnie z opisem w protokole, na podstawie połączonych danych z pięciu testów (protokoły kodowania silnego i słabego) jako [50,8% ± (2×10,8%)]. Szczury, których preferencja kodowania znajdowała się powyżej lub poniżej tych wartości, zostały wykluczone z analiz odpowiednich testów.
Do eksperymentów z silnym kodowaniem wykorzystano 16 szczurów, a do eksperymentów ze słabym kodowaniem 19 szczurów. Podczas prób silnego kodowania (kodowanie 3 × 5 min; Rysunek 4A) nie stwierdzono istotnej preferencji dla żadnego z obiektów (52,0 ± 1,9%, n = 16, t15 = 1,1, p = 0,29; test t dla jednej próby względem poziomu przypadku). Ten protokół silnego kodowania doprowadził do preferencji obiektu w nowej lokalizacji, co objawiło się średnią procentową eksploracją, która była istotnie wyższa od poziomu przypadku (50%) w testach z opóźnieniem 1 h oraz 24 h (pamięć 1-h, 77,9 ± 2,4%, n = 8, t7 = 11,8, p &lt; 0,001; pamięć 24-h, 65,2 ± 5,3%, n = 8, t7 = 2,8, p = 0,025; test t dla jednej próby względem poziomu przypadku). Nie stwierdzono istotnej różnicy między pamięcią 1-h a 24-h (p = 0,056; nieparzysty test t Welcha).
Podczas prób z słabym kodowaniem (kodowanie przez 20 min; wyniki z czterech kontekstów połączone; Rysunek 4B) nie stwierdzono istotnej preferencji dla żadnego z obiektów (51,1 ± 1,0%, n = 66, t65 = 1,2, p = 0,24; test t dla jednej próby względem poziomu przypadkowego). Ten protokół słabego kodowania spowodował istotny wzrost preferencji dla obiektu w nowej lokalizacji w porównaniu z poziomem przypadkowym w testach z opóźnieniem 1 h, ale nie w testach z opóźnieniem 24 h (połączone dane z wszystkich czterech kontekstów; pamięć 1-h, 66,7 ± 2,0%, n = 32, t31 = 8,2, p &lt; 0,001; pamięć 24-h, 49,6 ± 2,6%, n = 34, t33 = 0,16, p = 0,87; test t dla jednej próby względem poziomu przypadkowego). Stwierdzono istotną różnicę między wynikami w testach z opóźnieniem 1 h i 24 h (pamięć 1-h: n = 32, pamięć 24-h: n = 34, t61,5 = 5,2, p &lt; 0,001; nieparzysty test t Welcha).
Pamięci na poziomie grupy nie zaobserwowano w teście z 24-godzinną przerwą, co wskazywały wyniki na poziomie przypadku, jednak odnotowano różnice międzyosobnicze. Tak większa zmienność w warunkach słabej lub braku pamięci (np. test po 24 h) jest powszechnie obserwowana ze względu na bardziej losową eksplorację obiektów. Dlatego ważne jest, aby nie interpretować wyników poszczególnych szczurów indywidualnie. Zamiast tego, rozkład indywidualnych punktów danych można wykorzystać wraz ze średnią grupową jako wiarygodny wynik testu. Im silniejsze kodowanie, tym bardziej jednorodne staje się zachowanie szczurów i tym mniejsza liczba zwierząt jest potrzebna do osiągnięcia istotności statystycznej, co można zaobserwować na Rysunku 4A dla protokołu silnego kodowania. W przeciwieństwie do tego, w przypadku warunków słabych niezbędne są większe grupy w celu uzyskania wiarygodnych wyników (Rysunek 4B).
<img alt="Schemat kodowania pamięci z wykresami słupkowymi porównującymi czas eksploracji przy silnym i słabym kodowaniu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62458/62458fig4v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Wydajność pamięci po silnym i słabym kodowaniu. (A) Próba silnego kodowania (kodowanie 3 × 5 min), po której nastąpiły próby testowe po 1 h lub 24 h. Podczas prób kodowania nie stwierdzono istotnej preferencji żadnego z obiektów (n = 16). Silne kodowanie spowodowało istotny wzrost preferencji obiektu w nowym miejscu w testach z opóźnieniem 1 h oraz 24 h w porównaniu do poziomu przypadkowego (pamięć 1 h i 24 h: n = 8 w każdej grupie). Nie stwierdzono istotnych różnic między grupami. (B) Próba słabego kodowania (kodowanie 20 min), po której nastąpiły próby testowe po 1 h lub 24 h. Podczas prób kodowania nie stwierdzono istotnej preferencji żadnego z obiektów w skali grupy (n = 66). Słabe kodowanie spowodowało istotny wzrost preferencji obiektu w nowym miejscu w teście z opóźnieniem 1 h, ale nie 24 h, w porównaniu do poziomu przypadkowego (pamięć 1 h: n = 32; pamięć 24 h: n = 34). Stwierdzono istotną różnicę w wynikach testów z opóźnieniem 1 h i 24 h. Wyniki zostały połączone z czterech kontekstów. Pojedyncze punkty danych przedstawiono jako kropki. Wszystkie słupki przedstawiają procent eksploracji obiektu w nowym miejscu jako średnia ± SEM. *p &lt; 0.05, ***p &lt; 0.001; jednopróbkowy test t względem poziomu przypadkowego (50%, linia przerywana). ###p &lt; 0.001; ns, brak istotności; nieparzysty test t Welcha. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62458/62458fig4v3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Istotną zaletą tego ugruntowanego protokołu jest możliwość jego przeprowadzenia czterokrotnie w czterech różnych kontekstach (Rysunek 1C) z wykorzystaniem tej samej grupy szczurów. Wyniki przedstawione na Rysunku 5 obrazują jeden z możliwych sposobów zastosowania kontrbalansowania z dwiema grupami eksperymentalnymi (grupy z pamięcią 1-h i 24-h). Dwie grupy zostały poddane kontrbalansowaniu w obrębie dwóch kontekstów (konteksty 1 i 2), a następnie powtórzono tę procedurę w dwóch dodatkowych kontekstach (konteksty 3 i 4; Rysunek 5A). Wyniki z czterech kontekstów zaprezentowano pojedynczo na Rysunku 5B,D, gdzie pamięć każdej grupy eksperymentalnej oceniano poprzez porównanie preferencji z poziomem przypadkowym w każdym kontekście (pamięć 1-h: Kontekst 1, 69,9 ± 3,6%, n = 9, t8 = 5,5, p &lt; 0,001; Kontekst 2, 65,6 ± 3,9%, n = 9, t8 = 4,0, p = 0,004; Kontekst 3, 65,2 ± 3,8%, n = 7, t6 = 4,0, p = 0,007; Kontekst 4, 65,3 ± 5,6%, n = 7, t6 = 2,7, p = 0,035; pamięć 24-h: Kontekst 1, 45,1 ± 6,4%, n = 9, t8 = 0,77, p = 0,46; Kontekst 2, 49,1 ± 4,9%, n = 9, t8 = 0,18, p = 0,86; Kontekst 3, 57,2 ± 4,1%, n = 8, t7 = 1,7, p = 0,12; Kontekst 4, 47,6 ± 4,7%, n = 8, t7 = 0,52, p = 0,62; jednopróbkowy test t względem poziomu przypadkowego).
W kontekstach 1, 2 i 4 porównanie międzyosobnicze grup wykazało istotne różnice między pamięcią 1-h a 24-h (pamięć 1-h kontra pamięć 24-h: Kontekst 1, t12.7 = 3.4, p = 0.005; Kontekst 2, t15.2 = 2.6, p = 0.019; Kontekst 3, t13.0 = 1.4, p = 0.17; Kontekst 4, t12.2 = 2.4, p = 0.032; nieparzysty test t Welcha). Aby uzyskać lepszą reprezentację i umożliwić porównanie wewnątrzobiektowe danych, połączono wyniki z dwóch zrównoważonych kontekstów (Rysunek 5C,E). Połączone grupy eksperymentalne ponownie porównano indywidualnie z poziomem przypadkowym (połączone Konteksty 1 i 2: pamięć 1-h, 67.8 ± 2.6%, n = 18, t17 = 6.7, p &lt; 0.001; pamięć 24-h, 47.1 ± 3.9%, n = 18, t17 = 0.74, p = 0.47; połączone Konteksty 3 i 4: pamięć 1-h, 65.3 ± 3.3%, n = 14, t13 = 4.7, p &lt; 0.001; pamięć 24-h, 52.4 ± 3.2%, n = 16, t15 = 0.73, p = 0.48; jednopróbkowy test t względem poziomu przypadkowego). Następnie porównano ze sobą grupy eksperymentalne.
W obu parach kontekstów odnotowano istotne różnice między grupami, co wykazały porównania wewnątrzobiektowe (pamięć po 1 h versus pamięć po 24 h: połączone konteksty 1 i 2, t16 = 3.5, p = 0.003; połączone konteksty 3 i 4, t13 = 2.4, p = 0.032; parowy test t). Podobne wyniki uzyskano również u szczurów rasy Lister Hooded typu dzikiego w protokole słabego kodowania, wykorzystując konteksty 1 i 4 w dwóch zrównoważonych sesjach (dane nie przedstawiono). Powtarzalność i wiarygodność wyników potwierdzono, porównując każdy zestaw danych za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA. Nie wykryto istotnych różnic pomiędzy czterema kontekstami (pamięć po 1 h: F3,28 = 0.31, p = 0.81; pamięć po 24 h: F3,30 = 0.99, p = 0.41). Zatem test lokalizacji przedmiotu można powtarzać w sposób wiarygodny przy minimalnym wpływie powtórzeń, pod warunkiem przestrzegania instrukcji zawartych w niniejszym protokole.
<img alt="Schemat badania behawioralnego z wykresami słupkowymi przedstawiającymi czas eksploracji w różnych kontekstach i przy różnych opóźnieniach testowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62458/62458fig5v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Różne sposoby prezentacji i analizy wyników protokołu słabego kodowania z dwiema grupami eksperymentalnymi zrównoważonymi w ramach dwóch sesji. (A) Schemat eksperymentalny dla zrównoważenia z dwiema grupami eksperymentalnymi (grupy pamięci 1-h i 24-h) w ramach dwóch sesji (konteksty 1 i 2). Zrównoważenie powtórzono w dwóch dodatkowych sesjach (konteksty 3 i 4). (B i D) Wyniki z każdego kontekstu i grup eksperymentalnych porównywano indywidualnie z poziomem przypadkowym oraz względem siebie. We wszystkich czterech kontekstach preferencja obiektu w nowej lokalizacji w testach z opóźnieniem 1-h była znacząco zwiększona w porównaniu z poziomem przypadkowym [Kontekst 1 i 2: n = 9 na grupę (B); Kontekst 3 i 4: n = 7 na grupę (D)]. W testach z opóźnieniem 24-h preferencja obiektu w nowej lokalizacji nie różniła się od poziomu przypadkowego (Kontekst 1 i 2: n = 9 na grupę; Kontekst 3 i 4: n = 8 na grupę). Porównanie międzyosobnicze wykazało istotną różnicę między preferencjami grup eksperymentalnych w kontekstach 1, 2 i 4, ale nie w kontekście 3. *p &lt; 0.05, **p &lt; 0.01, ***p &lt; 0.001; test t dla jednej próby względem poziomu przypadkowego (50%, linia przerywana). #p &lt; 0.05; ##p &lt; 0.01; ns, brak istotności; nieparowany test t Welcha. (C i E) Wyniki przedstawiono po połączeniu grup eksperymentalnych z dwóch zrównoważonych kontekstów [Konteksty 1 i 2 połączone, n = 17 na grupę (C); Konteksty 3 i 4 połączone, n = 14 na grupę (E)]. Preferencja obiektu w nowej lokalizacji była znacząco zwiększona w porównaniu z poziomem przypadkowym w testach z opóźnieniem 1-h, ale nie 24-h, w obu parach kontekstów. Porównanie wewnątrzobiektowe grup eksperymentalnych wykazało istotne różnice między preferencjami obiektu w nowej lokalizacji w testach z opóźnieniem 1-h i 24-h w obu parach kontekstów. ***p &lt; 0.001; test t dla jednej próby względem poziomu przypadkowego (50%, linia przerywana). #p &lt; 0.05, ##p &lt; 0.01; parowy test t. Pojedyncze punkty danych przedstawiono jako kropki. Wszystkie słupki wskazują procent eksploracji obiektu w nowej lokalizacji jako średnia ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62458/62458fig5v3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół zawiera szczegółowe kroki dla zadania lokalizacji obiektu z czterema powtórzeniami przy użyciu tej samej kohorty szczurów. Słabe i silne kodowanie może wytwarzać wspomnienia krótko- i długotrwałe. Elastyczność protokołu z powtarzaniem może być korzystna w badaniach obejmujących operacje chirurgiczne, oszczędzając czas i pracę.

Wewnątrzprzedmiotowy projekt eksperymentalny wykorzystujący zadanie lokalizacji obiektu w szczurach

Object place recognition is a prominent method used to investigate spatial memory in rodents. This object place recognition memory forms the basis of the ...

Object Location Task pozwala nam badać różne mechanizmy powstawania lub zachowywania pamięci przestrzennej poprzez wykorzystanie spontanicznych zachowań eksploracyjnych u gryzoni. Protokół ten pozwala na powtórzenie zadania lokalizacji obiektu do czterech razy, co pomaga zwiększyć moc statystyczną oraz wydajność i wyniki badań, które obejmują zabiegi chirurgiczne. Na początek zdobądź kwadratową arenę wykonaną z nieprzezroczystego, nieporowatego twardego tworzywa sztucznego o szerokości co najmniej 60 centymetrów i wysokości 50 centymetrów.Aby skutecznie rejestrować ruchy szczurów przez zautomatyzowane oprogramowanie, upewnij się, że kolor podłogi kontrastuje z kolorem szczura. Umieść arenę w pudełku lub na platformie otoczonej zasłoną. Aby stworzyć kontekst, wstaw na arenę drugą warstwę wstawianych ścian w różnych kolorach lub wzorach.Zawieś przestrzenne wskazówki 3D, które mają wyraźne geometryczne kształty i kolory na tyle wysoko, aby szczury nie mogły ich dosięgnąć. Przymocuj do podłogi areny różne pary przedmiotów, które nie są porowate, nie nadają się do żucia i są łatwe do czyszczenia, z wyraźnymi geometrycznymi kształtami i teksturami. Napełnij wiadro w kształcie kwadratu materiałem pościelowym.Losowo umieść w wiadrze od pięciu do 10 obiektów o różnych kształtach i rozmiarach, które różnią się od obiektów, które będą używane w eksperymencie. W pierwszej sesji przynieś wszystkie klatki domowe do pokoju doświadczalnego i pozwól szczurom przyzwyczaić się do pokoju i uspokoić się na co najmniej 30 minut. Umieść dwa do czterech szczurów z tej samej klatki razem w wiadrze na około 20 minut.Wyczyść wiadro, usuwając wszelkie odchody między każdą grupą szczurów. Umieść wszystkie szczury w ich domowych klatkach i odłóż je do pomieszczenia mieszkalnego. W przypadku drugiej sesji przynieś wszystkie klatki do pokoju doświadczalnego i pozostaw je na co najmniej 30 minut.Umieść każdego szczura indywidualnie w wiadrze na 10 minut. Umieść szczura z powrotem w klatce domowej i wyczyść wiadro po każdym szczurze. Po zakończeniu zwróć wszystkie klatki do pomieszczenia mieszkalnego.W przypadku czwartej sesji przynieś wszystkie klatki do pokoju doświadczalnego i pozostaw je na co najmniej 30 minut. Umieść dwa do czterech szczurów z tej samej klatki razem na pustej arenie bez kontekstu i wskazówek przestrzennych przez 20 minut. Umieść wszystkie szczury z powrotem w klatce domowej i przetrzyj arenę 70% etanolem po każdej grupie szczurów.Zmodyfikuj pustą arenę, aby utworzyć pierwszy kontekst bez umieszczania obiektów na arenie. W przypadku pierwszej sesji habituacji kontekstowej przynieś wszystkie klatki do pokoju eksperymentów i opuść je na co najmniej 30 minut. Uruchom rejestrator, a następnie umieść pierwszego szczura na środku areny i pozwól szczurowi eksplorować arenę przez 10 minut.Następnie zatrzymaj rejestrator i umieść szczura z powrotem w klatce domowej. Po zakończeniu zwróć wszystkie klatki do pomieszczenia mieszkalnego. Dla każdego szczura powtórz ten proces dla sesji drugiej i trzeciej przez dwa kolejne dni, tak aby w sumie na szczura przypadały trzy sesje habituacji kontekstu.Przynieś wszystkie klatki do pomieszczenia doświadczalnego i pozostaw na co najmniej 30 minut. Korzystając z przygotowanego wcześniej harmonogramu, umieść pierwszą identyczną parę przedmiotów w wyznaczonych miejscach za pomocą mat klejących lub taśmy dwustronnej. Uruchom rejestrator i umieść pierwszego szczura na arenie w równej odległości od każdego obiektu zwróconego w stronę ściany lub rogu, który nie jest zajęty przez żaden obiekt.W przypadku słabego kodowania pozwól szczurowi eksplorować arenę i obiekty przez 20 minut na pojedynczą próbę. Aby uzyskać silne kodowanie, pozwól szczurowi na eksplorację przez pięć minut z trzema próbami dla tego samego szczura. Zatrzymaj rejestrator.Umieść szczura z powrotem w klatce domowej, usuń przedmioty i przetrzyj arenę etanolem po każdym nagraniu. Przynieś wszystkie klatki do pomieszczenia doświadczalnego, pozostawiając wystarczająco dużo czasu przed pierwszym testem, aby szczury mogły zostać pozostawione na co najmniej 30 minut. Umieść obiekty w wyznaczonych miejscach.Uruchom rejestrator i umieść pierwszego szczura na arenie przodem do ściany lub rogu, który nie jest zajęty przez żaden obiekt. Pozwól szczurowi eksplorować arenę i obiekty przez pięć minut. Umieść szczura z powrotem w klatce domowej.Usuń przedmioty i dokładnie przetrzyj zarówno przedmioty, jak i arenę 70% etanolem. Powtórz nagranie dla każdego szczura, a następnie zwróć klatki z powrotem do pomieszczenia socjalnego. Dla każdego szczura oceń czas eksploracji dla każdego obiektu zarówno w próbach kodowania, jak i testów.Oceniaj próby kodowania przez cały czas trwania i próby testowe przez dwie minuty, aby uzyskać najlepszą wydajność dyskryminacji. Oblicz procent eksploracji dla każdego obiektu lub wskaźnik dyskryminacji dla każdego szczura i oblicz średnie wartości dla grup. Użyj testu T dla jednej próby, aby wykryć znaczącą preferencję powyżej poziomu szansy.Silny protokół kodowania doprowadził do preferencji dla obiektu w nowej lokalizacji ze znacznie wyższym średnim procentem eksploracji niż 50% poziom szansy w testach zarówno z jednogodzinnym, jak i 24-godzinnym opóźnieniem. Słaby protokół kodowania spowodował znaczny wzrost preferencji dla obiektu w nowej lokalizacji, w porównaniu z poziomem szansy w testach z jednogodzinnym opóźnieniem, ale nie 24-godzinnym. Istotną zaletą tego protokołu jest to, że można go wykonać cztery razy przy użyciu czterech różnych kontekstów z tą samą kohortą szczurów.Przedstawiono tutaj wyniki jednego z możliwych sposobów wykorzystania równoważenia z dwiema grupami eksperymentalnymi pamięci godzinnej i pamięci 24-godzinnej. Obie grupy zostały zrównoważone w kontekście pierwszym i drugim, który został powtórzony w dwóch dodatkowych kontekstach, trzecim i czwartym. Wyniki z tych czterech kontekstów są prezentowane indywidualnie, gdzie pamięć dla każdej grupy eksperymentalnej została oceniona poprzez porównanie preferencji do poziomu szansy w każdym kontekście.Nie stwierdzono istotnej różnicy między czterema kontekstami. W celu lepszej reprezentacji i porównania danych w ramach podmiotów, wyniki z dwóch równoważonych kontekstów zostały połączone i porównane za pomocą porównania w obrębie badanych, a mianowicie testu T w parach. Ponieważ zadanie to opiera się na ciekawości, obchodzenie się z nim i przyzwyczajenie jest kluczowe, aby zwierzę nie było przytłoczone ani przestraszone podczas testu.W protokole tym można zastosować dalsze manipulacje, takie jak interwencja farmakologiczna i optogenetyczna, a także obrazowanie in vivo w celu badania wspomnień krótkotrwałych i długotrwałych oraz wzmacniania lub osłabiania tych wspomnień.

a-within-subject-experimental-design-using-an-object-location-task

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Zaproponowano w pełni zautomatyzowany protokół warunkowania działania gryzoni. Protokół opiera się na precyzyjnej kontroli czasowej zdarzeń behawioralnych w celu zbadania zakresu, w jakim ta kontrola wpływa na aktywność neuronalną leżącą u podstaw integracji sensomotorycznej i eksperymentów kontroli poznawczej.

W pełni zautomatyzowany protokół kondycjonowania gryzoni do eksperymentów z integracją sensomotoryczną i kontrolą poznawczą

Opisujemy protokoły szkolenia szczurów do przewlekłych zapisów elektrofizjologicznych w pełni zautomatyzowanych zadaniach poznawczych w labiryncie projekcji podłogowej.

Zautomatyzowane wizualne zadania poznawcze do rejestrowania aktywności neuronalnej za pomocą labiryntu projekcji podłogowej

Zdolność do oceny funkcji wykonawczych, takich jak elastyczność behawioralna u szczurów, jest przydatna do badania neurobiologii funkcji poznawczych zarówno u nienaruszonych zwierząt, jak i w modelach chorób. W tym miejscu opisujemy zautomatyzowane zadania do oceny zmiany strategii i odwróconego uczenia się, które są szczególnie wrażliwe na zakłócenia w sieciach kory przedczołowej.

Procedury instrumentalne do oceny elastyczności behawioralnej u szczurów

Celem tego protokołu jest zbadanie poznania przestrzennego u gryzoni. Wodny labirynt z podwójnym H to nowatorski test, który jest szczególnie przydatny do wyjaśnienia różnych elementów uczenia się, konsolidacji i pamięci, a także wzajemnego oddziaływania systemów pamięci.

Labirynt Double-H: solidny test behawioralny do uczenia się i pamięci u gryzoni

Ten protokół opisuje, jak tymczasowo i zdalnie wyciszyć aktywność neuronalną w dyskretnych obszarach mózgu, podczas gdy szczury są zaangażowane w zadania związane z uczeniem się i pamięcią. Podejście to łączy farmakogenetykę (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) z paradygmatem behawioralnym (sensoryczne warunkowanie wstępne), które ma na celu rozróżnienie różnych elementów uczenia się.

Metoda zdalnego wyciszania aktywności neuronalnej u gryzoni podczas dyskretnych faz uczenia się

Test rozpoznawania obiektów (ORT) to prosty i skuteczny test do oceny uczenia się i pamięci u myszy. Metodologia została opisana poniżej.

Nowatorski test rozpoznawania obiektów do badania uczenia się i pamięci u myszy

Tutaj udostępniamy protokół, który zawiera obszerne instrukcje dotyczące ekonomicznego ustanawiania lokalizacji obiektów mysich i nowatorskich testów behawioralnych rozpoznawania obiektów, w tym projektowania, kosztu i budowy wymaganego sprzętu, a także wykonywania testów behawioralnych, zbierania danych i analizy.

Nowatorskie rozpoznawanie obiektów i testy behawioralne lokalizacji obiektów u myszy przy ograniczonym budżecie

Opisano procedurę pomiaru szybkości i dokładności sprawności motorycznej szczurów w warunkach społecznych. Protokół umożliwia nam zbadanie wpływu samej obecności innych osób na szybkość i dokładność sprawności motorycznej w jednym eksperymencie.

Zadanie polegające na ocenie wpływu partnera na szybkość i dokładność sprawności motorycznej u szczurów

Obecny protokół opisuje rekonfigurowalny labirynt, unikalny system do testowania nawigacji przestrzennej i fenotypów behawioralnych u gryzoni. Zdolność adaptacji tego systemu labiryntów umożliwia wykonywanie różnych eksperymentów w jednym środowisku fizycznym. Łatwość przegrupowania strukturalnego pozwala uzyskać wiarygodne i powtarzalne wyniki eksperymentalne.

Wykorzystanie rekonfigurowalnego systemu labiryntów w celu zwiększenia powtarzalności testów nawigacji przestrzennej u gryzoni

Większość eksperymentów behawioralnych dla gryzoni została pierwotnie opracowana dla szczurów. Ze względu na różnice behawioralne między szczurami a myszami, czasami wymagane są modyfikacje dla myszy. Przedstawiamy metodę badania przestrzennej pamięci roboczej u myszy, minimalizującą stres podczas zadania pamięci roboczej.

Zadanie związane z przestrzenną pamięcią roboczą dla myszy w półautomatycznym 8-ramiennym labiryncie promieniowym, zmniejszające skojarzenia pamięci lękliwej w labiryncie

Poznaj protokół zadania lokalizacji obiektu w szczurach do badania pamięci przestrzennej. Metoda umożliwia powtarzalne testowanie z kontrbalansowaniem, zwiększając moc statystyczną i redukując liczbę zwierząt.

Wewnątrzprzedmiotowy projekt eksperymentalny wykorzystujący zadanie lokalizacji obiektu w szczurach

Przeglądaj więcej filmów