Rejestrowanie aktywności sieci w obwodach nocyceptywnych rdzenia kręgowego za pomocą układów mikroelektrod

Opisany preparat MEA 4-AP do warstwy rdzenia zapewnia platformę do badania połączeń obwodów rogu grzbietowego i tego, jak te sieci oddziałują podczas rdzeniowego przetwarzania sensorycznego. Przedstawiona metodologia umożliwia badanie aktywności obwodu rogu grzbietowego na makroskopowym regionalnym poziomie rozdzielczości. Preparat ten może być stosowany jako szybkie narzędzie przesiewowe do oceny zdolności związków do zakłócania sygnalizacji w obwodach czuciowych kręgosłupa.

Metoda ta pomaga wypełnić lukę w naszym zrozumieniu, w jaki sposób aktywność określonych typów komórek i małych mikroobwodów wpływa na duże populacje neuronów, aby następnie kształtować wynik reakcji zachowania rogu grzbietowego i ostatecznie doświadczenie bólu. Na początek dobrze napełnij MEA surowicą końską przez 30 minut. Po usunięciu serum dokładnie spłucz MEA pięć razy wodą destylowaną, aż woda destylowana przestanie się pienić.

Następnie napełnij studnię sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym. Po odcięciu głowy znieczulonej myszy usuń skórę z okolicy brzucha, wykonując małe nacięcie w skórze na poziomie bioder. Następnie pociągnij skórę po obu stronach nacięcia rostralnie, aż cała skóra zostanie usunięta z górnej części klatki piersiowej do górnej części miednicy, zarówno brzusznie, jak i grzbietowo.

Po umieszczeniu ciała na lodzie użyj podejścia brzusznego, aby odsłonić kręgosłup, usuwając wnętrzności i przecinając żebra bocznie do mostka. Usuń brzuszną klatkę piersiową, obie łopatki oraz kończyny dolne i miednicę. Przenieś kręgosłup i preparację żeber do kąpieli preparacyjnej zawierającej lodowatą sacharozę sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy.

Przypnij wszystkie cztery rogi preparatu, umieszczając szpilki przez mięśnie dolnej części pleców i dołączone górne żebra. Usuń wszystkie mięśnie i tkankę łączną pokrywającą brzuszną powierzchnię kręgów z rongeurs i zidentyfikuj obszar kręgowy nad powiększeniem lędźwiowo-krzyżowym, który leży w przybliżeniu poniżej trzonów kręgów T12-L2. Usuń trzon kręgu ogonowego do obszaru powiększenia lędźwiowo-krzyżowego, aby uzyskać dostęp do rdzenia kręgowego znajdującego się na kanale kręgowym.

Za pomocą zakrzywionych nożyczek sprężynowych przetnij obustronnie szypułki kręgów, jednocześnie podnosząc i ciągnąc trzon kręgu rostralnie, aby oddzielić brzuszne i grzbietowe aspekty kręgów i odsłonić rdzeń kręgowy. Po usunięciu trzonów kręgów w celu odsłonięcia powiększenia odcinka lędźwiowo-krzyżowego, ostrożnie usuń pozostałe korzenie, które zakotwiczają rdzeń kręgowy, za pomocą nożyczek sprężynowych, aż rdzeń będzie swobodnie unosił się na wodzie. Odizoluj rdzeń kręgowy za pomocą nacięć rostralnych i ogonowych powyżej i poniżej powiększenia lędźwiowo-krzyżowego, aby docelowy obszar rdzenia unosił się swobodnie.

W przypadku plastrów poprzecznych podnieś i umieść odcinek lędźwiowo-krzyżowy dołączoną trasą na wstępnie przyciętym bloku styropianowym z płytkim kanałem wyciętym pośrodku. Następnie za pomocą kleju cyjanoakrylowego przymocuj blok i sznurek do platformy sekcyjnej i umieść je w kąpieli tnącej zawierającej lodowatą sztuczną zawiesinę CSF z sacharozą. Po uzyskaniu plastrów o grubości 300 mikrometrów przenieś je do komory inkubacyjnej na granicy powietrza zawierającej natleniony sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy i pozwól plasterkom zrównoważyć się przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.

Aby rozpocząć rejestrację aktywności rogu grzbietowego, przenieś wycinek z inkubatora do studzienki MEA za pomocą pipety Pasteura z dużą końcówką wypełnioną sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym i dodaj dodatkowy sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy. Użyj cienkiego pędzla do malowania krótkimi włosami, aby umieścić plasterek nad matrycą zapisu z 60 elektrodami. Następnie umieść obciążoną szyję na tkance, aby utrzymać ją na miejscu i zapewnić dobry kontakt z elektrodami MEA.

Umieść MEA w głowicy nagrywającej stage. Sprawdź położenie tkanki nad elektrodami za pomocą odwróconego mikroskopu, aby potwierdzić, że jak najwięcej elektrod znajduje się pod powierzchniową DH. Upewnij się, że co najmniej dwie do sześciu elektrod nie stykają się z plasterkiem. Po podłączeniu kamery do urządzenia należy wykonać zdjęcie referencyjne przekroju względem MEA do wykorzystania podczas analizy.

Następnie naciśnij start DAQ w oprogramowaniu do nagrywania i upewnij się, że wszystkie elektrody otrzymują wyraźny sygnał. Następnie podłącz przewody wlotowe i wylotowe perfuzji do studni MEA wypełnionej sztucznym płynem płynu mózgowo-rdzeniowego i włącz system perfuzyjny. Sprawdź natężenie przepływu i upewnij się, że odpływ jest wystarczający, aby zapobiec przepełnieniu superbezpiecznika.

Po zrównoważeniu tkanki przez pięć minut zapisuj surowe dane wyjściowe przez pięć minut. Przesunąć linię wlotową perfuzji ze sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego do roztworu 4-aminopirydyny i odczekać 12 minut, aż rytmiczna aktywność indukowana 4-aminopirydyną osiągnie stan ustalony. Następnie zapisz pięć minut aktywności indukowanej 4-aminopirydyną i przygotuj się na kolejne nagrania w celu przetestowania leków lub sprawdzenia stabilności 4-aminopirydyny.

Po każdej sesji nagraniowej spłucz linie sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym. Po usunięciu MEA ze stopnia głowy i usunięciu siatki i tkanki z MEA, należy przepłukać MEA i siatkę sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym i powtórzyć cały proces z nowym plastrem. Otwórz oprogramowanie analityczne i załaduj gotowy układ analizy.

Otwórz interesujący Cię plik i odznacz elektrodę odniesienia oraz wszelkie elektrody uznane za nadmiernie hałaśliwe. Ustaw okno czasowe dla analizy. Następnie przejdź do zakładki filtra międzykanałowego.

Wybierz złożone elektrody referencyjne i referencyjne na podstawie wykonanego obrazu i notatek wykonanych podczas eksperymentu, a przed kontynuowaniem naciśnij przycisk Eksploruj. Przejdź do karty Filtr EAP i zastosuj górnoprzepustowy filtr Butterwortha drugiego rzędu, aby usunąć aktywność LFP. Przejdź do karty Filtr LFP i zastosuj filtr Butterwortha z przepustem pasma drugiego rzędu, aby usunąć aktywność EAP.

Na karcie detektora EAP upewnij się, że wybrałeś automatyczny próg, zaznacz pola zbocza narastającego i opadającego i ustaw czas martwy na trzy milisekundy. Aby ustawić progi dodatnie i ujemne, sprawdź dane, wracając do ekranu analizatora danych pierwotnych, przesuwając znacznik czasu, wracając do karty detektora EAP i naciskając przycisk eksploruj. Powtarzaj proces, aż ustawiony próg wykrywania przechwyci EAP bez wychwytywania szumu lub aktywności niefizjologicznej.

Na karcie detektora LFP upewnij się, że wybrałeś próg ręczny, zaznacz pola zbocza narastającego i opadającego oraz ustaw czas martwy na trzy milisekundy. Ustaw próg dla jednej elektrody, a gdy wszystko jest w porządku, wybierz opcję Zastosuj do wszystkich, a następnie naciśnij przycisk Rozpocznij analizę. Kąpielowe zastosowanie tetrodotoksyny tetrodotoksyny z bramką napięciową antagonisty kanału sodowego zniosło zarówno aktywność EAP, jak i LFP, potwierdzając zależność tych sygnałów od skoków.

Stabilność parametrów aktywności indukowanej 4-aminopirydyną scharakteryzowano dla EAP lub LFP. Wszystkie charakterystyki aktywności oraz zbieżność aktywności LFP były stabilne w oparciu o podobieństwo aktywności indukowanej 4-aminopirydyną po 12 minutach od podania 4-aminopirydyny i 15 minut później. EAP lub LFP charakteryzowały się wzrostem liczby zdarzeń zbiegających się wykrytych w wielu elektrodach.

Liczba połączonych sąsiednich elektrod oraz siła połączeń między sąsiednimi elektrodami a LFP po stymulacji 4-aminopirydyną, a następnie względna stabilność. Orientacja plastra jest ważnym czynnikiem w przypadku preparatów in vitro. Stymulacja 4-aminopirydyną indukowała podobną rytmiczną aktywność w SDH niezależnie od orientacji plastru.

Wreszcie, aby rzucić więcej światła na znaczenie aktywacji sieci DH 4-aminopirydyną, zastosowano w kąpieli sztuczny roztwór płynu mózgowo-rdzeniowego o podwyższonym poziomie potasu i wykazano, że wywołuje on podobną odpowiedź DH na stymulację 4-aminopirydyną. Kluczowymi krokami w protokole jest przygotowanie tkanek i umieszczenie skrawków, zapewniając, że tkanka jest zdrowa poprzez staranne, ale terminowe preparowanie, a także delikatne optymalne ułożenie tkanki na MEA, co pomoże w uzyskaniu wysokiej jakości wyników.