Oparta na mikroelektrodach ocena sieci neuronalnych w wycinkach rdzenia kręgowego myszy

Weź układ mikroelektrod lub MEA, dobrze zawierającyCSF. Umieść plaster rdzenia kręgowego myszy w studni i zabezpiecz go obciążoną siatką.

Umieść studzienkę MEA w systemie nagrywania. Pod mikroskopem zapewnij maksymalny kontakt między elektrodami MEA a powierzchownym rogiem grzbietowym lub SDH, regionem bogatym w interneurony.

Utrzymuj ciągły przepływ płynu mózgowo-rdzeniowego, aby zrównoważyć tkankę.

Neurony komunikują się poprzez potencjały czynnościowe. Napływ jonów sodu depolaryzuje błonę, a następnie odpływ jonów potasu, co powoduje repolaryzację. Błona na krótko ulega hiperpolaryzacji, zapobiegając nowemu potencjałowi czynnościowemu, dopóki potencjał spoczynkowy nie zostanie przywrócony.

Rejestruj spontaniczną aktywność neuronalną z elektrod MEA. Sygnały współwystępujące na wielu elektrodach wskazują na sieć neuronów połączonych synaptycznie.

Wprowadź inhibitor kanału potasowego, aby przedłużyć depolaryzację, która prowadzi do zwiększenia częstotliwości potencjału czynnościowego i synchronicznej aktywności rytmicznej w całej sieci.

Więcej elektrod wykazujących zbieżne sygnały wskazuje na aktywność synchroniczną, w której pośredniczy inhibitor.

Aby rozpocząć rejestrację aktywności rogu grzbietowego, przenieś wycinek z inkubatora do studzienki MEA za pomocą pipety Pasteura z dużą końcówką wypełnionej sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym i dodaj dodatkowy sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy.

Użyj cienkiego pędzla z krótkimi włosami, aby umieścić plasterek nad 60-elektrodowym układem nagrywającym. Następnie umieść obciążoną siatkę na tkance, aby utrzymać ją na miejscu i zapewnić dobry kontakt z elektrodami MEA.

Umieść MEA w głowicy nagrywającej stage. Sprawdź położenie tkanki nad elektrodami za pomocą odwróconego mikroskopu, aby potwierdzić, że jak najwięcej elektrod znajduje się pod powierzchniową DH. Upewnij się, że co najmniej dwie do sześciu elektrod nie stykają się z plasterkiem.

Po podłączeniu kamery do urządzenia należy wykonać zdjęcie referencyjne przekroju względem MEA do wykorzystania podczas analizy. Następnie naciśnij Start DAQ w oprogramowaniu do nagrywania i upewnij się, że wszystkie elektrody otrzymują wyraźny sygnał.

Następnie podłącz przewody wlotowe i wylotowe perfuzji do studni MEA wypełnionej sztucznym płynem rdzeniowo-rdzeniowym i włącz system perfuzyjny. Sprawdź natężenie przepływu i upewnij się, że odpływ jest wystarczający, aby zapobiec przepełnieniu superbezpiecznika. Po zrównoważeniu tkanki przez pięć minut zapisuj surowe dane wyjściowe przez pięć minut.

Przenieś linię wlotową perfuzji ze sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego do roztworu 4-aminopirydyny i odczekaj 12 minut, aż rytmiczna aktywność indukowana 4-aminopirydyną osiągnie stan ustalony. Następnie nagraj pięć minut aktywności indukowanej przez 4-aminopirydynę i przygotuj się na kolejne nagrania w celu przetestowania leków lub sprawdzenia stabilności 4-aminopirydyny.