Wspomagany programowo pomiar ilościowy grubości kości podchrzęstnej choroby zwyrodnieniowej stawów
18 marca 2022
Ten artykuł metodologiczny przedstawia wspomagany oprogramowaniem protokół pomiaru ilościowego do ilościowego określenia histologicznej grubości kości podchrzęstnej w mysich stawach kolanowych z chorobą zwyrodnieniową stawów kolanowych i normalnych stawach kolanowych jako kontrolnych. Protokół ten jest bardzo wrażliwy na subtelne zgrubienia i nadaje się do wykrywania wczesnych zmian podchrzęstnych w chorobie zwyrodnieniowej stawów.
Pogrubienie kości podchrzęstnej lub stwardnienie rozsiane jest jedną z cech charakterystycznych choroby zwyrodnieniowej stawów, zarówno u modeli zwierzęcych, jak i u ludzi. Obecnie nasilenie histologicznego pogrubienia kości podchrzęstnej określa się głównie na podstawie oceny wizualnej opartej na półilościowych systemach klasyfikacji. Badanie to ma na celu opracowanie powtarzalnego i łatwego do wykonania protokołu ilościowego pomiaru grubości kości podchrzęstnej w mysim modelu choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego wywołanej destabilizacją łąkotki przyśrodkowej.
Stworzyliśmy mysi model choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego poprzez chirurgiczną destabilizację łąkotki przyśrodkowej, która jest wykonywana pod mikroskopem operacyjnym i w stanie sterylnym. Proces histologiczny stawów kolanowych myszy obejmuje utrwalanie tkanek, odwapnienie, przycinanie, przetwarzanie, osadzanie, cięcie i barwienie, a następnie obrazowanie mikroskopowe. Obraz na ekranie przedstawia chorobę zwyrodnieniową stawu kolanowego myszy ze zmianami w chrząstce stawowej, tworzeniem osteofitów i pogrubieniem kości podchrzęstnej Ilościowy pomiar kości podchrzęstnej choroby zwyrodnieniowej stawów za pomocą oprogramowania ImageJ.
Pobierz ImageJ z imagej.nih.gov/ij. Otwórz plik ImageJ. Kliknij kartę Plik, a następnie kliknij opcję Otwórz, aby otworzyć obraz histologiczny.
Znajdź adres katalogu plików, wybierz plik obrazu i kliknij przycisk Otwórz. Użyj narzędzia Linia prosta, aby naszkicować jedną jednostkę długości, mikrometr, a następnie kliknij Analizuj, a następnie Ustaw skalę. Ustaw znaną odległość i współczynnik proporcji pikseli na jeden, a następnie kliknij przycisk OK.ImageJ może przekonwertować długość piksela na jednostkę długości, mikrometr.
Ustaw mierzony współczynnik na obszar. Kliknij Analizuj, a następnie Ustaw pomiar i zaznacz pole Obszar i Ogranicz do progu w nowym oknie. Ten krok ustawia ImageJ tak, aby mierzył obszar parametrów w wybranym progu.
Zdefiniowany całkowity obszar zainteresowania kości podchrzęstnej, jak pokazano w radiu, który obejmuje podchrzęstną płytkę korową i część leżącej poniżej kości beleczkowej przylegającej do płytki korowej. Naszkicuj kontur całkowitego obszaru kości podchrzęstnej za pomocą narzędzia do zaznaczania pod głównym oknem obrazu. Narzędzia wyboru wyznaczają systemowi próg, który pozwala ograniczyć pomiar po wybraniu progu.
Kliknij przycisk Analizuj, a następnie Zmierz. Otworzy się okno wyników z pomiarem powierzchni. Kliknij przycisk Edytuj, a następnie Wyczyść na zewnątrz, aby wykluczyć obszar poza całkowitym obszarem kości podchrzęstnej.
Po kliknięciu opcji Wyczyść na zewnątrz widoczny jest tylko całkowity obszar kości podchrzęstnej. Kliknij Obraz, następnie Dostosuj, a następnie Próg koloru, aby otworzyć okno koloru progu. Kliknij opcję Oryginał u dołu okna koloru progu, aby przywrócić obraz do oryginalnego stanu.
Użyj narzędzi do zaznaczania, aby narysować małe pole w obszarze substancji kostnej. Kliknij opcję próbki u dołu okna, aby zdefiniować obszar substancji kostnej. Wybrany obszar substancji kostnej zmieni kolor na czerwony.
Kliknij przycisk Wybierz u dołu okna koloru progu, aby utworzyć próg pomiaru obszaru. Kliknij Analizuj, a następnie Zmierz w menu głównym ImageJ. Wynik pomiaru obszaru substancji kostnej pojawi się w oknie wyników.
Zapisz dane dotyczące całkowitej powierzchni kości podchrzęstnej i powierzchni substancji kostnej. Zmienność między obserwatorami i wewnątrzobserwatorami oraz odtwarzalność określono za pomocą analizy współczynników korelacji Pearsona. Istotność różnic między badanymi grupami określono za pomocą testu t-Studenta lub jednoczynnikowego testu ANOVA, a następnie testu post-hoc.
Ten rysunek przedstawia górny i dolny panel. Górny panel pokazuje mikrofotografie obrazów histologicznych z grup Sham i DMM do wizualnej oceny kości podchrzęstnej opartej na szacunkach. Dolne panele pokazują mikrofotografie obrazów histologicznych z grup Sham i DMM do wspomaganego ImageJ, ilościowego pomiaru kości podchrzęstnej.
Pola obrysowane przerywaną żółtą linią wykonaną za pomocą programu Adobe Illustrator definiują całkowity obszar zainteresowania kości podchrzęstnej. Obszar substancji kostnej w polach jest podświetlony na pomarańczowo. Niezwykłe pogrubienie kości podchrzęstnej w kłykciu przyśrodkowym kości udowej i plateau piszczelowym przyśrodkowym można określić ilościowo za pomocą oprogramowania ImageJ.
Na tym rysunku testy zmienności między obserwatorami wskazują na wysoką odtwarzalność między obserwatorami zarówno dla pierwszego, jak i drugiego pomiaru grubości kości podchrzęstnej w przyśrodkowej płaskowyżu piszczelowym i obszarach przyśrodkowego kłykcia kości udowej będących przedmiotem zainteresowania. Na tym rysunku testy zmienności wewnątrzobserwacyjnej wskazują na wysoką odtwarzalność między pierwszym a drugim pomiarem grubości kości podchrzęstnej w obszarze plateau kości piszczelowej przyśrodkowej i kłykcia przyśrodkowego kości udowej. Tabela 1 przedstawia analizę porównawczą odtwarzalności między oceną wizualną a ilościowym pomiarem grubości kości podchrzęstnej wspomaganym przez ImageJ.
Test współczynnika korelacji sugeruje, że pomiar ilościowy był stosunkowo bardziej powtarzalny niż wizualny system oceniania. Rysunek ten przedstawia porównawczą analizę wrażliwości oceny wizualnej i ilościowego pomiaru grubości kości podchrzęstnej wspomaganego przez ImageJ w kłykciu przyśrodkowym kości udowej i płaskowyżu przyśrodkowej kości piszczelowej. Obrazy histologiczne do wizualnej oceny szacunków podzielono na trzy grupy.
Ilościowa wartość grubości kości podchrzęstnej ze wszystkich trzech obserwatorów dla obrazów DMM z zerowym wynikiem wizualnym była znacznie wyższa niż w przypadku obrazów Pozorów z zerowym wynikiem wizualnym, co wskazuje, że pomiar ilościowy jest bardziej czuły niż ocena wizualna na łagodne pogrubienie kości podchrrzęstnej. Nowo opracowany protokół ilościowego pomiaru grubości kości podchrzęstnej choroby zwyrodnieniowej stawów jest bardziej wrażliwy na łagodne zmiany podchrzęstne niż szeroko stosowane systemy oceny wizualnej. Protokół ten może być stosowany do wykrywania wczesnych zmian podchrzęstnych w chorobie zwyrodnieniowej stawów oraz do oceny skuteczności in vivo leczenia choroby zwyrodnieniowej stawów w połączeniu z klasyfikacją chrząstki w chorobie zwyrodnieniowej stawów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł metodologiczny przedstawia protokół ilościowych pomiarów wspomaganych programowo w celu określenia histologicznej grubości kości podchrzęstnej w stawach kolanowych myszy z chorobą zwyrodnieniową oraz w prawidłowych stawach kolanowych służących jako kontrola. Protokół został zaprojektowany tak, aby wykazywać wysoką czułość na subtelne pogrubienia, co czyni go odpowiednim do wykrywania wczesnych zmian zwyrodnieniowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Badania nad chorobą zwyrodnieniową stawów
- Histologia
Wstęp
- Pogrubienie kości podchrzęstnej jest charakterystyczną cechą choroby zwyrodnieniowej stawów.
- Obecne metody opierają się na ocenie wizualnej i gradingu półilościowym.
- W celu dokładnego pomiaru niezbędny jest powtarzalny protokół.
- W badaniu wykorzystano model mysi indukowany poprzez destabilizację rogu przyśrodkowego łąkotki.
Cel badania
- Opracowanie protokołu pomiaru ilościowego grubości kości podchrzęstnej.
- Zwiększenie czułości wykrywania wczesnych zmian chorobowych w przebiegu choroby zwyrodnieniowej stawów.
- Zapewnienie standaryzowanej metody dla przyszłych badań.
Zastosowane metody
- Chirurgiczna destabilizacja łąkotki przyśrodkowej u myszy.
- Procesy histologiczne, w tym utrwalanie, dekalcyfikacja i barwienie.
- Obrazowanie mikroskopowe do analizy.
- Pomiary ilościowe z wykorzystaniem oprogramowania ImageJ.
Główne wyniki
- Pomyślne stworzenie modelu mysiego dla choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego.
- Wykazanie zmian w chrząstce stawowej oraz tworzenia osteofitów.
- Osiągnięcie ilościowej oceny pogrubienia kości podchrzęstnej.
- Protokół wykazuje wysoką czułość na zmiany grubości kości.
Wnioski
- Opracowany protokół umożliwia dokładny pomiar grubości kości podchrzestnej.
- Metoda ta może zwiększyć zrozumienie postępu choroby zwyrodnieniowej stawów.
- W przyszłych badaniach protokół ten może zostać wykorzystany do dalszych analiz w zakresie choroby zwyrodnieniowej stawów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla sektora przemysłowego
Ilościowy pomiar grubości kości podchrzęstnej wypełnia krytyczną lukę w walidacji celów terapeutycznych w chorobie zwyrodnieniowej stawów, zastępując subiektywną ocenę wizualną powtarzalną analizą wspomaganą programowo. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych, umożliwiając wykrycie wczesnych, subtelnych zmian strukturalnych, które poprzedzają wyraźną degradację chrząstki. Metoda ta wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego w terapii OA, dostarczając zestandaryzowanego, przekładalnego biomarkera dla szlaków przebudowy kości.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych ukierunkowanych na szlaki przebudowy kości podchrzestnej w chorobie zwyrodnieniowej stawów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ilościowe, powtarzalne wyniki niezbędne do funkcjonalnej walidacji celów w mysich modelach OA.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez wykrywanie niewielkiego pogrubienia kości, niewidocznego w systemach oceny wizualnej.
Przesiewanie i rozwój testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane próbki histologiczne do standaryzowanej analizy wysokoprzepustowej z wykorzystaniem programu ImageJ.
- Wyniki ilościowe: Generuje ciągłe, niezależne od progu pomiary powierzchni kości podchrzęstnej na potrzeby przesiewu związków.
- Skalowalność: Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy w badaniach nad OA dzięki spójnym definicjom obszarów zainteresowania w obrębie przyśrodkowego kłykcia uda oraz plateau piszczeli.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Jest zgodne z patologią OA u ludzi, w której stwardnienie podchrzestne jest cechą charakterystyczną postępu choroby.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etapy odkryć i procesy przedkliniczne, dostarczając biomarkera kompatybilnego z gradingiem chrząstki.
- Decyzje dostosowane do ryzyka: Wspiera kryteria go/no-go w oparciu o ilościowe zmiany grubości kości w badaniach nad skutecznością leczenia.
Integracja potoków i przepływów pracy
Protokół wpisuje się w kontinuum badań nad chorobą zwyrodnieniową stawów, od walidacji celu, poprzez optymalizację związków wiodących, aż po przedkliniczną ocenę skuteczności, szczególnie w przypadkach, gdy głównym mechanizmem jest przebudowa kości.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących celów terapeutycznych zaangażowanych w stwardnienie kości podchrzestnej oraz mechanotransdukcję.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy, powtarzalne wyniki ilościowe do oceny wpływu związków na grubość kości.
- Analityka: Umożliwia statystyczne porównanie grubości kości między grupami przy użyciu korelacji Pearsona oraz testu t/ANOVA zgodnie z opisem.
- Badania translacyjne: Łączy z walidacją przedkliniczną, oferując biomarker odzwierciedlający kliniczne wskaźniki progresji OA.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalny schemat analizy histologicznej, który można zastosować w wielu modelach OA i różnych ramionach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności w ocenie fenotypu kostnego.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje pomiary pomiędzy różnymi obserwatorami i sesjami, zapewniając niską zmienność wewnątrz- i międzygrupową.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) dzięki wykrywaniu wczesnych zmian strukturalnych, które są pomijane w półilościowej ocenie.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia dostosowanie postępów prac do poziomu ryzyka w oparciu o czułe, ilościowe punkty końcowe przebudowy kości.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w przygotowaniu histologicznym oraz analizie progowej w programie ImageJ.
- Metoda zależy od skalibrowanej mikroskopii oraz spójnego definiowania obszarów zainteresowania.
- Powtarzalność wymaga standaryzacji protokołów pomiarowych pomiędzy zespołami.
- Przy adaptacji należy uwzględnić specyficzną dla modelu anatomię kości oraz protokoły barwienia.
- Ograniczenie praktyczne: ręczne obrysowywanie może wprowadzić zmienność, jeśli definicje obszarów zainteresowania nie zostaną ściśle ustandaryzowane.
