Rozwiązywanie praktycznych problemów związanych z mikrowgłębieniami opartymi na mikroskopii sił atomowych na eksplantatach ludzkiej chrząstki stawowej

Celem tego protokołu było stworzenie modelu in vitro do badania właściwości mechanicznych chrząstki stawowej podczas wystąpienia i progresji choroby zwyrodnieniowej stawów. Główną zaletą obecnej techniki jest to, że eksplantaty chrząstki są łatwe do wygenerowania i wysoce reprezentatywne dla chrząstki w wieku rodzimym. Model ten może być używany do analizy i monitorowania różnych podejść do choroby zwyrodnieniowej stawów, diagnostycznych i terapeutycznych na poziomie biomechanicznym.

Na początek odetnij chrząstkę od kości za pomocą skalpela. Za pomocą stempla biopsyjnego wygeneruj dyski o średnicy czterech milimetrów. Umieść tarczę na specjalnie wykonanym urządzeniu tnącym.

Za pomocą szpatułki przymocuj i ustabilizuj krążek chrząstki. Przetnij krążek chrząstki żyletką. Za pomocą szpatułki zbierz krążek i umieść go w 1,5-mililitrowej tubce.

Aby pozostać w próbkach chrząstki, dodaj 130 mikrolitrów przepuszczalnego dla komórek barwnika fluorescencyjnego do każdego dołka 96-dołkowej płytki i rozprowadź krążek na płytce jako jeden krążek na studzienkę. Umieść 96-dołkową płytkę na uchwycie płytki mikroskopu fluorescencyjnego. Wybierz odpowiedni filtr fluorescencyjny i obiektyw.

Umieść obiektyw pod wstępnie wybraną studzienką zawierającą pojedynczą chrząstkę. Ustaw ostrość na dysku, aby zobaczyć wzorzec komórkowy. Wybierz funkcję nawigatora, aby uzyskać przegląd całej studni.

Użyj lewego przycisku myszy i przeciągnij go, aby przejść do innej pozycji sceny. Wybierz kwadrat obejmujący obszar zainteresowania, który ma zostać zeskanowany. Wybierz opcję punktu mapy ostrości oprogramowania, a następnie wybierz każdy pojedynczy kafelek, klikając lewym przyciskiem myszy w jego środku.

Wybierz opcję mapa fokusu w wyświetlonym oknie ze wszystkimi wcześniej wybranymi kafelkami. Kliknij dwukrotnie kafelek, aby go wyświetlić i ustawić na nim odpowiednią ostrość. Następnie kliknij ustaw Z, aby zapisać plan ogniskowej i przejść do następnego kafelka.

Po dostosowaniu planu ogniskowej dla każdej płytki z osobna rozpocznij akwizycję obrazu, naciskając przycisk rozpocznij skanowanie. Napraw każdy wstępnie wybrany krążek chrząstki zawierający wzór komórkowy na szalkach Petriego, dodając wystarczającą ilość biokompatybilnego kleju po górnej, dolnej, lewej i prawej stronie dysku. Przykryj krążki 2,5 mililitrem pożywki Leibovitz bez L-glutaminy.

Umieścić szalkę Petriego w uchwycie na próbkę urządzenia AFM. Aby skalibrować wspornik AFM, umieść go na powierzchni wspornika pustaka szklanego tak, aby spoczywał na wypolerowanej płaszczyźnie optycznej pośrodku pustaka szklanego. Opuszczaj wspornik w krokach co 100 mikrometrów za pomocą funkcji silnika krokowego, aż zostanie całkowicie zanurzony w medium.

Aby zidentyfikować pożądane miejsce pomiaru chrząstki, należy rozpocząć podejście skanera za pomocą wspornika na czystym obszarze wolnej próbki szalki Petriego. Następnie cofnij wspornik 1,5 milimetra od spodu płyty. Przełącz się z widoku jasnego pola na widok fluorescencji i wizualnie zidentyfikuj górną część dysku.

Przesuń uchwyt próbki AFM dokładnie dwa milimetry w kierunku środka dysku. Uruchom podejście skanera, aby dotrzeć do powierzchni krążka chrząstki i cofnąć wspornik o 100 mikrometrów. Aby wygenerować krzywą odległości siły, skoncentruj się na komórkach znajdujących się w żądanym miejscu pomiaru.

Kliknij przycisk uruchamiania, aby rozpocząć pomiary i uzyskać pięć krzywych odległości siły w każdym miejscu pomiaru. Zapisz krzywe po ich sprawdzeniu. Aby oszacować moduły Younga, korzystając z opcji otwórz partię krzywych spektroskopiowych, otwórz wygenerowane krzywe odległości siły, które mają być analizowane.

Wybierz model Hertz-fit, a następnie opcję dopasowania elastycznego. Następnie zwizualizuj i udokumentuj moduł Younga. Dostosuj za pomocą współczynnika Poissona wynoszącego 0,5 i odpowiedniego promienia końcówki wspornika.

Następnie sprawdź wzrokowo dopasowanie krzywej odległości siły, aby zapewnić poprawność. Aby określić głębokość wcięcia, otwórz każdą z wygenerowanych krzywych odległości siły w oprogramowaniu do analizy danych i wybierz model dopasowania Hertza jako proces analizy. Zastosuj opcję odejmij odsunięcie linii bazowej, aby wyzerować pionową oś odchylenia i wybierz funkcję odsunięcia plus pochylenie.

Użyj funkcji znajdź punkt kontaktowy, aby automatycznie zidentyfikować punkt kontaktowy. Korzystając z funkcji pionowego położenia końcówki, odejmij odległość, uwzględniając wyłącznie ugięcie wspornika od surowej wysokości piezoelektrycznego podczas wcięcia. Wybierz opcję dopasowania sprężystości, aby wyświetlić przetworzoną krzywą odległości siły.

Następnie wybierz obszar wykresu tak, aby pokrywał się z najbardziej ujemną wartością na pionowej osi położenia końcówki. Na karcie parametrów w polu XMIN odczytaj i udokumentuj wcięcie. Krążki zawierające pojedyncze struny wykazały wyższe wartości sztywności z medianą 2,6 kilo paskala, co jest reprezentatywne dla bezkompromisowych, zdrowych obszarów chrząstki.

Wraz z wystąpieniem i progresją choroby zwyrodnieniowej stawów, pomiary AFM wykazały silny stopniowy spadek sztywności o 42% w podwójnych strunach, 77% w małych skupiskach i ostatecznie o 88% w zaawansowanych stadiach reprezentowanych przez duże skupiska. Krążki zawierające wzór dyfuzyjny wykazywały podwyższoną elastyczność z istotną zmianą pojedynczych wartości modułu Younga. Dla wszystkich krążków chrzęstnych z przypisaną dominującą organizacją wzorca komórkowego stwierdzono, że głębokość wgłębienia związana z zastosowaną wartością zadaną jest odwrotnie proporcjonalna do sztywności.

Artefakty widoczne w wygenerowanych krzywych odległości siły wskazują albo na nieoptymalny kontakt między wspornikiem AFM a powierzchnią chrząstki, albo na niewłaściwe utrwalenie próbki na szalce Petriego. Nasze eksplantaty chrząstki mogą być dalej przetwarzane i analizowane przy użyciu różnych technik biologii molekularnej, takich jak analiza białek za pomocą elizy, znakowanie immunologiczne, modowanie zachodnie lub analiza genów za pomocą PCR. Metoda ta może być wykorzystana do zbadania bezpośredniego wpływu nowych terapii na chrzęstność stawową i może pomóc naukowcom w uzyskaniu ważnych informacji na temat mechanizmów choroby zwyrodnieniowej stawów.