Name: Rozwiązywanie praktycznych problemów związanych z mikrowgłębieniami opartymi na mikroskopii sił atomowych na eksplantatach ludzkiej chrząstki stawowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-28T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Poznaj metodę mikroindentacji AFM do badania właściwości mechanicznych ludzkiej chrząstki stawowej. Ten model in vitro umożliwia analizę postępu osteoartrozy i ocenę terapii na poziomie biomechanicznym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy chirurgom ortopedom z Oddziału Chirurgii Ortopedycznej Szpitala Uniwersyteckiego w Tybindze za dostarczenie próbek tkanek.

Kłykcie udowe pobrane od pacjentów poddawanych całkowitej endoprotezoplastyce stawu kolanowego w Szpitalu Uniwersyteckim w Tybindze, Niemcy, zostały użyte. Do badania włączono wyłącznie próbki chrząstki stawowej od pacjentów z patologiami zwyrodnieniowymi i pourazowymi stawów. Zgoda wydziałowej, instytucjonalnej, a także lokalnej komisji etycznej została uzyskana przed rozpoczęciem badania (Projekt nr 674/2016BO2). Przed udziałem w badaniu uzyskano pisemną świadomą zgodę od wszystkich pacjentów.
UWAGA: Schemat blokowy etapów eksperymentu w ich chronologicznej kolejności jest podany w Rysunek 1.
1. Przetwarzanie tkanek i wytwarzanie krążków chrzęstnych
<ol>
	<li>Przygotowanie tkanek
	<ol>
		<li>Po resekcji pooperacyjnej próbki chrząstki należy umieścić w pojemniku wypełnionym zmodyfikowanym podłożem Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionym 5% (v/v) penicyliny-streptomycyny. Upewnij się, że próbki są całkowicie zanurzone w podłożu. Czas między resekcją chirurgiczną a dalszym przetwarzaniem chrząstki nie powinien przekraczać 24 godzin. Upewnij się, że podczas całego procesu próbka jest całkowicie zanurzona w pożywce, aby uniknąć wysuszenia próbki.</li>
		<li>Odetnij chrząstkę od kości za pomocą skalpela.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generowanie krążków chrzęstnych
	<ol>
		<li>Wygeneruj krążki chrząstki o średnicy 4 mm za pomocą stempla do biopsji. 
		UWAGA: Ważne jest, aby wybrać i wyciąć obszary kłykcia, w których grubość warstwy chrząstki przekracza 1 mm. Może to być problematyczne, zwłaszcza w okolicach stref nośnych, gdzie warstwa chrząstki zazwyczaj traci swoją grubość w wyniku procesów zużycia lub zwyrodnienia.</li>
		<li>Umieść wcześniej wygenerowane krążki chrząstki o średnicy 4 mm na specjalnie zaprojektowanym urządzeniu tnącym i stabilnie zamocuj i przytrzymaj krążki chrząstki za pomocą szpatułki. Podczas umieszczania krążków chrząstki na urządzeniu tnącym należy zachować ostrożność. Próbki należy umieścić w taki sposób, aby najwyższa warstwa chrząstki (strefa powierzchowna chrząstki stawowej) nie była skierowana w stronę ostrza</li>
		<li>Przetnij krążki chrząstki żyletką. W ten sposób powstają próbki chrząstki w kształcie dysku o wymiarach 4 mm x 1 mm. Aby zapobiec wysuszeniu próbki, należy jak najszybciej wykonać cięcie tkanki.</li>
		<li>Zebrać każdy krążek za pomocą szpatułki i umieścić wytworzone krążki chrząstki w probówkach o pojemności 1,5 ml zawierających 1 ml DMEM uzupełnionego 5% (v/v) penicyliny-streptomycyny. Umieść około 15 krążków w jednej tubie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kriotomiczne cięcie krążków chrząstki (dla plastrów prostopadłych) 
	UWAGA: Ten krok jest opcjonalny i można go zastosować, jeśli pożądana jest wizualizacja rozkładu wzoru komórkowego w krążkach chrząstki w widoku bocznym. Może być stosowany jako metoda weryfikacji, ponieważ rozkład wzorca komórkowego jest cechą 3D chrząstki stawowej26. Można również zastosować przekrój optyczny i rekonstrukcje 3D całych krążków chrzęstnych za pomocą mikroskopu konfokalnego, eliminując tym samym konieczność cięcia próbek zgodnie z opisem w protokole.
	<ol>
		<li>Przykryj krążek chrząstki rozpuszczalnym w wodzie medium do osadzania i umieść go na jego krawędzi na pokrętle kriotomii (z powierzchnią krążka prostopadłą do powierzchni pokrętła). W urządzeniu do kriotomu podłoże zatapiające zamarza w niskich temperaturach.</li>
		<li>Za pomocą standardowego kriotomu należy przeciąć tkankę na boki o grubości 60 μm, aż do osiągnięcia środka krążka (tj. gdy kriosekcje osiągną długość 4 mm) i zebrać plastry. Dzieląc eksplantację dysku prostopadle, można uwidocznić wszystkie strefy chrząstki (powierzchowną, środkową i głęboką).</li>
		<li>Zebrać skrawki na szkiełku podstawowym i usunąć rozpuszczalne w wodzie podłoże do zatapiania, przemłukując trzykrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Sortowanie krążków chrzęstnych jako funkcja komórkowego wzorca przestrzennego
<ol>
	<li>Barwienie próbek chrząstki w kształcie dysku
	<ol>
		<li>Umieścić jeden krążek chrząstki (sekcja 1.2) w każdym dołku 96-dołkowej płytki i dodać 130 μl przepuszczalnego dla komórek barwnika fluorescencyjnego w rozcieńczeniu 1:1,000 do każdego dołka.</li>
		<li>Sprawdź wzrokowo całą płytę i upewnij się, że w każdej studzience znajduje się tylko jeden dysk. Inkubować płytkę przez 30 minut w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie wycinków chrząstki o grubości 60 μm
	<ol>
		<li>Delikatnie umieścić skrawki krążka chrzęstnego (sekcja 1.3) na szklanych szkiełkach mikroskopowych za pomocą kleszków.</li>
		<li>Przykryj skrawki chrząstki podłożem montażowym zawierającym jądrowe barwienie przeciwstawne DAPI i delikatnie umieść szkiełka nakrywkowe, które nadają się do mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
		<li>Uszczelnij krawędzie każdego szkiełka nakrywkowego zwykłym przezroczystym lakierem do paznokci i pozostaw do wyschnięcia na 3 minuty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sortowanie i obrazowanie chrząstek z góry i z boku 
	UWAGA: Każdy dysk musi być zbadany pod mikroskopem fluorescencyjnym. Celem tego kroku jest posortowanie krążków na podstawie ich dominującego wzorca komórkowego (pojedyncze struny, podwójne struny, małe klastry, duże skupiska lub rozproszone).
	<ol>
		<li>Umieść 96-dołkową płytkę na uchwycie płytki mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
		<li>Wybrać odpowiedni filtr fluorescencyjny Em 495 nm/Ex 515 nm (do obrazowania krążków chrząstki z góry z góry przygotowanego w sekcji 2.1.) lub Em 358 nm/Ex 461 nm (do obrazowania z boku skrawków chrząstki przygotowanego w sekcji 2.2) i obiektywu 10x. 
		UWAGA: Użycie obiektywu 10x pozwala na zbadanie całego obwodu krążka i wykluczenie próbek z niejednorodnym lub niewłaściwym zabarwieniem. Jednak użycie tylko widoku odgórnego może skutkować percepcją zmian w organizacji komórkowej w wyniku analizy głębszych warstw tkankowych, które stały się widoczne dla obserwacji odgórnej przez powierzchowną erozję. Na przykład rosnący ciąg biegnący wzdłuż arkad kolagenu może być postrzegany jako pojedyncza komórka lub rozproszone komórki (wzór dyfuzyjny)26. W związku z tym obie strony krążków muszą zostać sprawdzone, aby zapewnić prawidłowy wybór wzorca komórkowego.</li>
		<li>Określ wizualnie wzór komórkowy wyświetlany w każdym krążku chrząstki. Jest mało prawdopodobne, że dysk będzie miał tylko jeden typ wzorca komórkowego. W przypadku części krążka, w której układ chondrocytów nie pasuje do interesującego wzorca, należy przyjąć próbki tylko wtedy, gdy niepożądany wzór znajduje się na samym obrzeżach, gdzie nie odbywają się pomiary AFM (tj. do 0,5 mm od granicy krążka) i upewnić się, że nie przekracza on 10% całkowitej powierzchni krążka27, 28.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akwizycja obrazu całych krążków chrzęstnych
	<ol>
		<li>Wybierz obiektyw mikroskopu o powiększeniu 10x i umieść go pod wstępnie wybraną studzienką zawierającą pojedynczy krążek chrząstki. Ustaw ostrość na dysku, aby zobaczyć wzór komórkowy.</li>
		<li>Wybierz funkcję nawigatora, aby uzyskać przegląd całej studni. Użyj lewego przycisku myszy i przeciągnij, aby przejść do innej pozycji sceny. Za pomocą kółka myszy powiększaj i pomniejszaj. 
		UWAGA: W tym momencie podgląd studni z całą próbką można zobaczyć, klikając dwukrotnie kolejno na każdy obszar zainteresowania.</li>
		<li>Wybierz kwadrat, który obejmuje obszar zainteresowania do zeskanowania; w tym momencie wszystkie pojedyncze kafelki tworzące mozaikę staną się widoczne.</li>
		<li>Dostosuj ekspozycję/intensywność światła, aby komórki były wyraźnie widoczne z tła. W tym momencie jasność/kontrast obrazu został dostosowany dla wszystkich kafelków i nie można go już dostosować indywidualnie dla każdego kafelka. 
		UWAGA: Ponieważ komórki w pobliżu krawędzi dysku często emitują wyższy sygnał fluorescencji niż komórki w środku, należy dostosować ustawienia ekspozycji/natężenia światła.
		<ol>
			<li>Aby ocenić, czy czas ekspozycji jest odpowiedni dla danego kanału, sprawdź rozkład sygnału na histogramie. Korzystając z mechanizmu automatycznej ekspozycji zawartego w oprogramowaniu do obrazowania mikroskopu, zwizualizuj wszystkie komórki znajdujące się w dysku.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wybierz opcję Punkt mapy ostrości oprogramowania, a następnie wybierz każdy kafelek, klikając lewym przyciskiem myszy w jego środku.</li>
		<li>Wybierz opcję Mapa ostrości. Zostanie wyświetlone okno ze wszystkimi poprzednio wybranymi kafelkami. Kliknij dwukrotnie kafelek na liście, aby go wyświetlić i ustawić na nim odpowiednią ostrość.</li>
		<li>Kliknij przycisk Ustaw Z, aby zapisać plan ogniskowej i przejść do następnego kafelka. Po dostosowaniu planu ogniskowej dla każdego kafelka z osobna rozpocznij akwizycję obrazu, naciskając przycisk Rozpocznij skanowanie.
		<ol>
			<li>Jeśli skanowanie wyświetla ciemniejsze poziome i/lub pionowe paski, może to być spowodowane niewłaściwym i nierównomiernym oświetleniem pojedynczych klatek. Rozwiąż ten problem, korzystając z opcji Linked Shading wbudowanej w oprogramowanie przed właściwym skanowaniem.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zapisuj, eksportuj i poprawnie dodawaj adnotacje do obrazów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Biomechaniczne podejście eksplantatów chrząstki
<ol>
	<li>Przygotowanie próbki do pomiarów AFM
	<ol>
		<li>Utrwalić każdy wstępnie wybrany krążek chrząstki zawierający wzór komórkowy (sekcja 2) na szalkach Petriego za pomocą biokompatybilnego kleju. Dodaj wystarczającą ilość kleju do próbki po górnej, dolnej, lewej i prawej stronie dysku.</li>
		<li>Przykryj krążki 2,5 ml pożywki L-15 firmy Leibovitz bez L-glutaminy. Delikatnie nanieś pożywkę Leibowitza na próbki, aby uniknąć oderwania się próbki od powierzchni z powodu fal wytwarzanych przez podłoże.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ładowanie próbek do AFM
	<ol>
		<li>Umieścić szalkę Petriego w uchwycie na próbkę urządzenia AFM i włączyć podgrzewacz szalki Petriego ustawiony na 37 °C. Odczekać, aż szalka do hodowli tkankowej osiągnie żądaną temperaturę. Ma to na celu wykluczenie możliwych artefaktów spowodowanych zmianami temperatury.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kalibracja wspornika AFM
	<ol>
		<li>Zainicjuj konfigurację oprogramowania zgodnie z wcześniejszym opisem Danalache et al.29.</li>
		<li>Wybierz odpowiedni uchwyt wspornikowy pustaka szklanego do pomiarów cieczy i ostrożnie umieść go na głowicy AFM. Mechanizm blokujący zabezpiecza pustak szklany w głowicy AFM. Upewnij się, że powierzchnia odbijająca pustak szklanego jest prosta i równoległa do uchwytu AFM.</li>
		<li>Ostrożnie umieść wspornik na powierzchni uchwytu wspornika z pustaka szklanego. Sam wspornik powinien spoczywać na wypolerowanej płaszczyźnie optycznej, pośrodku pustaka szklanego.</li>
		<li>Ostrożnie umieść silikonową osłonę (membranę silikonową) na podstawie uchwytu wspornika, aby zapobiec kondensacji medium w głowicy AFM.</li>
		<li>Opuszczaj wspornik w krokach co 100 μm za pomocą funkcji silnika krokowego, aż zostanie całkowicie zanurzony w medium.</li>
		<li>Uruchom podejście skanera z parametrami podejścia opisanymi przez Danalache et al.29. Cofnąć wspornik o 100 μm po osiągnięciu dna szalki Petriego.</li>
		<li>Skalibruj wspornik, wykonując dokładnie te same czynności, i uruchom parametry opisane przez Danalache et al.29. Pod koniec kalibracji odchylenie pionowe jest zapisywane i wyświetlane w niutonowych (N) jednostkach siły, a nie w woltach (V) - jednostce pierwotnej rejestracji przez detektor fotodiody. W eksperymentach tutaj po kalibracji uzyskano nastawę 4,47 nN.</li>
		<li>Korzystając z funkcji silnika krokowego, cofnij wspornik do 1,000 μm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Identyfikacja pożądanego miejsca pomiaru chrząstki w AFM 
	UWAGA: Ze względu na grubość krążków chrząstki wynoszącą 1 mm, wspornik nie jest widoczny w polu widzenia podczas poruszania się po próbce.
	<ol>
		<li>Użyj kamery CCD mikroskopu, aby zidentyfikować wspornik. Wspornik AFM powinien być umieszczony w obszarze płytki Petriego wolnym od próbek.</li>
		<li>Rozpocznij podejście skanera z wspornikiem na czystym, wolnym od próbek obszarze szalki Petriego, używając tych samych parametrów opisanych przez Danalache et al.29.</li>
		<li>Dalej cofnij wspornik o 1.5 mm od spodu płyty za pomocą sterownika silnika krokowego. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia bezpośredniej kolizji między wspornikiem a próbką.</li>
		<li>Przełącz się z widoku jasnego pola na widok fluorescencji i wizualnie zidentyfikuj górną część dysku.</li>
		<li>Przesunąć uchwyt na próbkę AFM dokładnie o 2 mm w kierunku środka krążka. Ten punkt jest uważany za środek krążka chrząstki.</li>
		<li>Uruchomić podejście skanera i po osiągnięciu powierzchni krążka chrząstki cofnąć wspornik o 100 μm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiary krzywej siła-odległość
	<ol>
		<li>Skoncentruj się na komórkach umieszczonych w żądanym miejscu pomiaru. Kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć pomiary i generowanie krzywych siła-odległość w docelowym położeniu.</li>
		<li>Uzyskaj pięć krzywych siła-odległość w każdym miejscu pomiaru. Cofnąć wspornik o 500 μm i przesunąć wspornik do następnego miejsca pomiarowego. 
		UWAGA: Wycofanie wspornika jest kluczowym krokiem, ponieważ powierzchnia krążka chrzęstnego nie jest jednorodna i ma nierówności. Wysoki pagórek na powierzchni próbki może spowodować dramatyczne zderzenie, prowadzące do niepożądanego uszkodzenia końcówki wspornika/próbki. Zalecamy wybranie co najmniej pięciu różnych miejsc pomiarowych rozmieszczonych na powierzchni dysku i uzyskanie co najmniej pięciu krzywych siła-odległość w każdym miejscu.</li>
		<li>Sprawdź krzywe siła-odległość i zapisz je.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Estymacja modułów Younga za pomocą modelu dopasowania Hertza
	<ol>
		<li>Otwórz wygenerowane krzywe siła-odległość do analizy (plik .jpk) w oprogramowaniu do analizy danych za pomocą opcji Otwórz partię krzywych spektroskopowych.</li>
		<li>Wybierz model dopasowania Hertz, a następnie wybierz opcję Dopasowanie elastyczne.
		<ol>
			<li>Opcja dopasowania sprężystości automatycznie wykonuje następujące obliczenia na wybranej krzywej siła-odległość: oblicza linię bazową i odejmuje od całej krzywej, aby usunąć przesunięcie linii bazowej (linia bazowa jest przywracana do zera na osi y); określa punkt kontaktu, wykrywając punkt, w którym krzywa siła-odległość przecina linię siły zerowej (punkt kontaktu jest ustawiony na zero na osi x); oblicza separację końcówka-próbka (sygnał wysokości piezoelektrycznego uwzględnianie zginania wspornika jest odejmowane); i automatycznie dopasowuje krzywą siła-odległość do wybranego modelu. W razie potrzeby każdy z tych kroków można również wykonać niezależnie.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dostosuj przy użyciu następujących parametrów dopasowania: współczynnik Poissona 0,5 i odpowiedni promień końcówki wspornika. 
		UWAGA: W przypadku stosowania wspornika z kulistą końcówką wspornikową należy użyć modelu Hertz fit. Wspornik zastosowany w tym badaniu miał kulistą końcówkę o promieniu 5 μm. Zalecamy dopasowanie krzywej siła-odległość do momentu osiągnięcia maksymalnej przyłożonej siły (wartości zadanej).</li>
		<li>Sprawdź wizualnie dopasowanie krzywej siła-odległość, aby upewnić się, że jest poprawna. Ten krok należy wykonać dla każdej z analizowanych krzywych siła-odległość.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określanie głębokości wgłębienia 
	UWAGA: W zależności od używanego narzędzia do analizy danych proces ten może się różnić. Eksperymentator może łatwo odczytać głębokość wcięcia, wykonując szereg kroków, które są zawarte w programie do analizy danych.
	<ol>
		<li>Otwórz każdą z wygenerowanych krzywych siła-odległość w oprogramowaniu do analizy danych i wybierz model dopasowania Hertza jako proces analizy.</li>
		<li>Zastosuj opcję Odejmij odsunięcie linii bazowej, aby wyzerować oś odchylenia w pionie (oś y) i wybierz funkcję Przesunięcie + pochylenie.</li>
		<li>Użyj funkcji Znajdź punkt kontaktowy, aby automatycznie zidentyfikować punkt kontaktowy, który jest automatycznie ustawiany na współrzędną x równą zero.</li>
		<li>Odejmij odległość, biorąc pod uwagę wyłącznie ugięcie wspornika od surowej wysokości piezoelektrycznego podczas wcięcia, korzystając z funkcji pionowej pozycji końcówki.</li>
		<li>Wybierz opcję Dopasowanie sprężystości, aby wyświetlić przetworzoną krzywą siła-odległość, a następnie wybierz obszar wykresu tak, aby pokrywał się z najbardziej ujemną wartością na osi pionowego położenia końcówki (oś x).</li>
		<li>Przeczytaj i udokumentuj wcięcie z pola X Min w zakładce parametrów. Zapisz i udokumentuj wyniki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie statystyczne. Wybierz pozycję Nowy zestaw danych z menu rozwijanego.</li>
	<li>Otwórz zakładkę Widok zmiennych po wybraniu pliku DataSet. Zdefiniuj zmienne numeryczne dla każdej kategorii wzorca komórkowego: pojedyncze struny = SS, podwójne struny = DS, małe klastry = SC, duże klastry = BC, dyfuzja i moduły Younga.</li>
	<li>Na karcie widoku danych wprowadź zmierzone dane modułów Younga dla każdej z odpowiednich kategorii wzorca komórkowego. Analizuj rozkład danych, wybierając pozycję Analizuj na pasku menu, a następnie pozycję Eksploracyjna analiza danych.</li>
	<li>Wybierz Moduły Younga jako zmienną zależną i Wzorzec komórkowy jako listę czynników. Wykres skrzynkowy używany w sekcji wyników jest wyświetlany wśród wyników w pliku wyjściowym.</li>
	<li>Aby przeprowadzić analizę statystyczną, wybierz opcję Próbki zależne w sekcji testu nieparametrycznego na karcie paska menu analizy. Wybierz Moduły Younga jako Pola testowe i Wzorzec komórkowy jako Grupy na karcie pól. Naciśnij Uruchom. 
	UWAGA: Wyniki są wyświetlane w pliku wyjściowym. Do analizy statystycznej wykonywany jest test Friedmana.</li>
	<li>Uwzględnij wartości p testu nieparametrycznego na wykresie pudełkowym, który został utworzony w kroku 4.4. Zapisz wyniki, klikając Plik na pasku menu i wybierając Zapisz.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jako choroba postępująca i wieloczynnikowa, OA wywołuje zmiany strukturalne i funkcjonalne w chrząstce stawowej. W przebiegu OA upośledzenie cech mechanicznych towarzyszą zmiany strukturalne i biochemiczne na powierzchni chrząstki stawowej27,31. Najwcześniejszymi zdarzeniami patologicznymi występującymi w OA są utrata proteoglikanów sprzężona z przerwaniem sieci kolagenowej32,33,<sup class="xre...

Ze względu na stale zmniejszający się rozmiar urządzeń i systemów elektronicznych, szybki rozwój technologii i sprzętu opartego na mikro- i nano nabrał rozpędu. Jednym z takich urządzeń jest mikroskopia sił atomowych (AFM), która może skanować powierzchnie biologiczne i pobierać informacje topograficzne lub biomechaniczne zarówno w skali nano-, jak i mikrometrowej1,2. Wśród jego licznych funkcji, narzędzie to może być używane zarówno jako mikro-, jak i nano-wgłębnik w celu uzyskania informacji o właściwościach mechanicznych różnych systemów biologicznych3,4,5,6. Dane są zbierane przez fizyczny kontakt z powierzchnią za pomocą sondy mechanicznej, która może mieć nawet około 1 nm na końcu7. Wynikowe odkształcenie próbki jest następnie wyświetlane w oparciu o głębokość wcięcia końcówki wspornika i siłę przyłożoną do próbki8.
Choroba zwyrodnieniowa stawów (OA) jest długotrwałą chorobą zwyrodnieniową charakteryzującą się pogorszeniem stanu chrząstki stawowej w stawach i otaczających tkankach, co może prowadzić do całkowitego odsłonięcia powierzchni kości. Obciążenie związane z otwartym dostępem jest znaczne; Obecnie połowa wszystkich kobiet i jedna trzecia wszystkich mężczyzn w wieku 65 lat i więcej cierpi na OA9. Urazy, otyłość i wynikająca z nich zmieniona biomechanika stawu10 determinują zwyrodnienie chrząstki stawowej, które jest postrzegane jako powszechny efekt końcowy. Pionierskie badanie Ganza i wsp. zakładało, że wczesne etapy procesu OA mogą obejmować właściwości biomechaniczne chrząstki11, i od tego czasu naukowcy potwierdzili tę hipotezę12. Podobnie, ogólnie przyjmuje się, że właściwości biomechaniczne tkanki są funkcjonalnie koordynowane przez organizację ultrastrukturalną, a także przesłuchy komórka-komórka i komórka-macierz. Wszelkie zmiany mogą mieć dramatyczny wpływ na ogólne funkcjonowanie biomechaniczne tkanki13. Do tej pory rozpoznanie choroby zwyrodnieniowej stawów ma charakter kliniczny i opiera się na zwykłej radiografii filmowej14. Podejście to jest dwustronne: po pierwsze, brak zdefiniowanego progu odcięcia zwyrodnieniowego dla sformułowania diagnozy choroby zwyrodnieniowej stawów utrudnia określenie ilościowe choroby, a po drugie, metody obrazowania nie są czułe i standaryzowane oraz nie są w stanie wykryć zlokalizowanego uszkodzenia chrząstki15,16,17. W tym celu ocena właściwości mechanicznych chrząstki ma tę decydującą zaletę, że opisuje parametr, który zmienia się w przebiegu choroby zwyrodnieniowej stawów niezależnie od etiologii choroby i ma bezpośredni wpływ na funkcjonalność tkanek na bardzo wczesnym etapie. Przyrządy do wgłębień mierzą siłę, z jaką tkanka opiera się wgłębieniu. W rzeczywistości nie jest to nowa koncepcja; Najwcześniejsze badania pochodzą z lat 80. i 90. W tym okresie liczne badania sugerowały, że przyrządy do wgłębień przeznaczone do artroskopowych pomiarów chrząstki stawowej mogą być dobrze przystosowane do wykrywania zmian zwyrodnieniowych chrząstki. Jeszcze 30 lat temu niektóre badania były w stanie wykazać, że przyrządy do wgłębień były w stanie wykryć in vivo zmiany na powierzchni chrząstki podczas zwyrodnienia tkanki, przeprowadzając pomiary sztywności ściskającej podczas artroskopii18,19,20.
AFT, WCIĘCIE (AFM-IT) w chrząstce stawowej dostarcza informacji o kluczowej właściwości mechanicznej tkanki, a mianowicie sztywności. Jest to parametr mechaniczny, który opisuje zależność między przyłożonym, nieniszczącym obciążeniem a wynikowym odkształceniem obszaru tkanki z wcięciem 21. Wykazano, że AFM-IT jest w stanie określić ilościowo zależne od wieku modyfikacje sztywności w makroskopowo niedotkniętych sieciach kolagenowych, różnicując w ten sposób zmiany patologiczne związane z początkiem choroby zwyrodnieniowej stawów (stopień 0 w skali Outerbridge w chrząstce stawowej)22. Wcześniej wykazaliśmy, że AFM-ITs, na podstawie przestrzennej organizacji chondrocytów jako opartego na obrazie biomarkera wczesnej degeneracji chrząstki, pozwalają nie tylko na ilościowe określenie, ale także na faktyczne wskazanie najwcześniejszych zwyrodnieniowych zmian mechanicznych. Wyniki te zostały już potwierdzone przez innych23,24. W związku z tym AFM-IT pełni rolę interesującego narzędzia do diagnozowania i identyfikowania wczesnych zmian zwyrodnieniowych. Zmiany te można już zmierzyć na poziomie komórkowym, co pozwala lepiej zrozumieć proces patofizjologiczny choroby zwyrodnieniowej stawów.
W tym protokole demonstrujemy kompletną procedurę histologicznej i biomechanicznej oceny eksplantatów chrząstki stawowej, od przygotowania rodzimej chrząstki do pozyskiwania i przetwarzania danych AFM. Poprzez podejście krok po kroku pokazujemy, jak generować, klasyfikować i wizualnie klasyfikować tkankę chrząstki stawowej według różnych etapów zwyrodnienia za pomocą obrazowania 2D dużej mozaiki, a następnie wgłębień mikro-AFM.
Mimo że obecnie AFM-IT jest jednym z najbardziej czułych narzędzi do pomiaru zmian biomechanicznych w chrząstce7, jak każda inna technika instrumentalna, ma ograniczenia i praktyczne osobliwości25, które mogą prowadzić do błędnego pozyskiwania danych. W tym celu poddajemy analizie najczęstsze problemy, które pojawiają się podczas pomiarów AFM eksplantatów chrząstki i opisujemy, w miarę możliwości, jak je zminimalizować lub przezwyciężyć. Obejmują one topograficzne aspekty próbek i trudności w ich stabilizacji w środowisku zgodnym z AFM, fizyczne osobliwości powierzchni tkanki i wynikające z tego trudności w wykonywaniu pomiarów AFM na takich powierzchniach. Przedstawiono również przykłady błędnych krzywych siła-odległość, podkreślając warunki, które mogą je powodować. Omówiono również dodatkowe ograniczenia związane z geometrią końcówki wspornika i wykorzystaniem modelu Hertza do analizy danych.

<table><tbody><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy</td><td>1397-89-3</td><td></td></tr><tr><td>Głowica mikroskopu sił atomowych (AFM)&nbsp;</td><td>CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Niemcy</td><td>JPK00518</td><td></td></tr><tr><td>Biokompatybilny klej do próbek&nbsp;</td><td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Niemcy</td><td>H000033</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA</td><td>14948</td><td>Barwnik przepuszczalny przez błonę komórkową, stosowany do sortowania krążków chrząstki - obrazowanie w widoku z góry</td></tr><tr><td>Cantilever</td><td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Niemcy</td><td>SAA-SPH-5UM</td><td>Częstotliwość Nom: 30 KHz, k: 0,2 N / m, długość nom: 115 i mu; m, szerokość nom: 40&mu; m,&nbsp; geometria: prostokątna, cylindryczna końcówka z 5&mu; m promień końcowy</td></tr><tr><td>Urządzenie do czyszczenia chrząstki&nbsp;</td><td>Wykonane samodzielnie&nbsp;</td><td>Nie dotyczy</td><td>Urządzenie do cięcia z tworzywa sztucznego zawierające predefiniowane części kamery CDD 4mmx1mm</td></tr><tr><td>zintegrowanej z AFM</td><td>Imaging Source Europe GmbH, Brema, Niemcy</td> Kamera CDD <td>DFK 31BF03</td><td></td></tr><tr><td>zintegrowana z mikroskopem fluorescencyjnym</td><td>Leica Biosystems, Wetzlar, Niemcy</td><td>DFC3000G</td><td></td></tr><tr><td>Cryotome</td><td>Leica Biosystems, Wetzlar, Niemcy</td><td>CM3050S&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania danych dla AFM</td><td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Niemcy</td><td>nie dotyczy</td><td>wersji 5.0.86,&nbsp; można pobrać bezpłatnie z następującej strony internetowej https://customers.jpk.com</td></tr><tr><td>zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM) firmy Dulbecco&nbsp;</td><td>Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Niemcy</td><td>41966052</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny (Leica DMi8)</td><td>Leica Biosystems, Wetzlar, Niemcy</td><td>11889113</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na kantyflorę do pustaków szklanych</td><td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Niemcy</td><td>SP-90-05</td><td>Bardzo długi pustak szklany z kątowymi powierzchniami, zaprojektowany specjalnie do użytku z podgrzewaczem JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).</td></tr><tr><td>Mikroskop kontrastowy z odwróconymi fazami (zintegrowany z AFM)</td><td>AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Niemcy</td><td>L201306_03</td><td></td></tr><tr><td>pożywka L-15 firmy Leibovitz bez L-glutaminy&nbsp;</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy</td><td>F1315</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>CLS294775X50</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe Z DAPI</td><td>ibidi GmbH, Gr&auml; felfing, Niemcy</td><td>50011</td><td>Podłoże montażowe z jądrowym barwieniem przeciwstawnym DAPI (4&,6-diamidino-2-fenyloindole) do krążków chrząstek&nbsp; obrazowanie z boku</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewacz szalki Petriego związany z AFM (podgrzewacz szalek Petriego)</td> <td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Niemcy</td><td>T-05-0117</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>Feather Medical Products, Osaka, Japonia</td><td>2023-01</td><td></td></tr><tr><td>Spódnica silikonowa</td><td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Niemcy</td><td>nie dotyczy</td><td>Ochronna membrana silikonowa (D55x0,25), którą umieszcza się na podstawie podstawy bloku szklanego, aby zapobiec średniej kondensacji pary wodnej w głowicy AFM.</td></tr><tr><td>Program statystyczny - SPSS</td><td>IBM, Armonk, Nowy Jork, USA</td><td>SPSS Statistics 22</td><td>Wersja 280.0.0.0 (190)</td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli tkankowych&nbsp;</td><td>TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Szwajcaria</td><td>TPP93040</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Holandia</td><td>SA6255012</td><td>Rozpuszczalne w wodzie podłoże do zatapiania&nbsp;</td></tr></tbody></table>

rozwiązywanie praktycznych problemów związanych z mikrowgłębieniami opartymi na mikroskopii sił atomowych na eksplantatach ludzkiej chrząstki stawowej

Addressing Practical Issues in Atomic Force Microscopy-Based Micro-Indentation on Human Articular Cartilage Explants

Bez wątpienia, mikroskopia sił atomowych (AFM) jest obecnie jedną z najpotężniejszych i najbardziej użytecznych technik oceny mikro, a nawet nano-wskazówek w dziedzinie biologii. Jednak, podobnie jak w przypadku każdego innego podejścia mikroskopowego, mogą pojawić się wyzwania metodologiczne. W szczególności charakterystyka próbki, przygotowanie próbki, rodzaj przyrządu i sondy do wgłębień mogą prowadzić do niepożądanych artefaktów. W tym protokole ilustrujemy te pojawiające się problemy dotyczące zdrowych, a także eksplantatów chrząstki stawowej z chorobą zwyrodnieniową stawów. W tym celu najpierw pokazujemy krok po kroku, jak generować, klasyfikować i wizualnie klasyfikować krążki chrząstki stawowej ex vivo według różnych etapów zwyrodnienia za pomocą dużego obrazowania fluorescencyjnego 2D mozaiki eksplantatów całej tkanki. Główną zaletą modelu ex vivo jest to, że składa się on ze starej, rodzimej ludzkiej chrząstki, która umożliwia badanie zmian związanych z chorobą zwyrodnieniową stawów od wczesnego początku do progresji. Ponadto przedstawiono również typowe pułapki związane z przygotowaniem tkanek, a także samą procedurę AFM wraz z późniejszą analizą danych. Pokazujemy, jak podstawowe, ale kluczowe kroki, takie jak przygotowanie i przetwarzanie próbki, charakterystyka topograficzna próbki spowodowana zaawansowaną degeneracją oraz interakcja między próbką a końcówką, mogą wpłynąć na pozyskiwanie danych. Poddajemy również analizie najczęstsze problemy w AFM i opisujemy, w miarę możliwości, jak je przezwyciężyć. Wiedza o tych ograniczeniach ma ogromne znaczenie dla prawidłowego pozyskiwania, interpretacji i ostatecznie osadzenia wyników w szerokim kontekście naukowym.

Za pomocą wykonanego samodzielnie urządzenia tnącego udało nam się wypreparować i uzyskać małe (4 mm x 1 mm) krążki chrzęstne ze świeżych ludzkich kłykci zawierające pojedynczy przestrzenny wzór komórkowy30 w postaci pojedynczych sznurów (SS, Rysunek 2A), podwójnych sznurów (DS), małych skupisk (SC), dużych skupisk (BC; Rysunek 2A) oraz rozproszonych (Rysunek 2B). Reprezentatywny eksplant chrzęstny przedstawi...

Przedstawiamy krok po kroku podejście do identyfikacji i rozwiązywania najczęstszych problemów związanych z mikrowgłębieniami mikroskopii sił atomowych. Ilustrujemy pojawiające się problemy na rodzimych eksplantatach ludzkiej chrząstki stawowej, charakteryzujących się różnym stopniem zwyrodnienia spowodowanego chorobą zwyrodnieniową stawów.

Rozwiązywanie praktycznych problemów związanych z mikrowgłębieniami opartymi na mikroskopii sił atomowych na eksplantatach ludzkiej chrząstki stawowej

Without a doubt, atomic force microscopy (AFM) is currently one of the most powerful and useful techniques to assess micro and even nano-cues in the ...

Celem tego protokołu było stworzenie modelu in vitro do badania właściwości mechanicznych chrząstki stawowej podczas wystąpienia i progresji choroby zwyrodnieniowej stawów. Główną zaletą obecnej techniki jest to, że eksplantaty chrząstki są łatwe do wygenerowania i wysoce reprezentatywne dla chrząstki w wieku rodzimym. Model ten może być używany do analizy i monitorowania różnych podejść do choroby zwyrodnieniowej stawów, diagnostycznych i terapeutycznych na poziomie biomechanicznym.Na początek odetnij chrząstkę od kości za pomocą skalpela. Za pomocą stempla biopsyjnego wygeneruj dyski o średnicy czterech milimetrów. Umieść tarczę na specjalnie wykonanym urządzeniu tnącym.Za pomocą szpatułki przymocuj i ustabilizuj krążek chrząstki. Przetnij krążek chrząstki żyletką. Za pomocą szpatułki zbierz krążek i umieść go w 1,5-mililitrowej tubce.Aby pozostać w próbkach chrząstki, dodaj 130 mikrolitrów przepuszczalnego dla komórek barwnika fluorescencyjnego do każdego dołka 96-dołkowej płytki i rozprowadź krążek na płytce jako jeden krążek na studzienkę. Umieść 96-dołkową płytkę na uchwycie płytki mikroskopu fluorescencyjnego. Wybierz odpowiedni filtr fluorescencyjny i obiektyw.Umieść obiektyw pod wstępnie wybraną studzienką zawierającą pojedynczą chrząstkę. Ustaw ostrość na dysku, aby zobaczyć wzorzec komórkowy. Wybierz funkcję nawigatora, aby uzyskać przegląd całej studni.Użyj lewego przycisku myszy i przeciągnij go, aby przejść do innej pozycji sceny. Wybierz kwadrat obejmujący obszar zainteresowania, który ma zostać zeskanowany. Wybierz opcję punktu mapy ostrości oprogramowania, a następnie wybierz każdy pojedynczy kafelek, klikając lewym przyciskiem myszy w jego środku.Wybierz opcję mapa fokusu w wyświetlonym oknie ze wszystkimi wcześniej wybranymi kafelkami. Kliknij dwukrotnie kafelek, aby go wyświetlić i ustawić na nim odpowiednią ostrość. Następnie kliknij ustaw Z, aby zapisać plan ogniskowej i przejść do następnego kafelka.Po dostosowaniu planu ogniskowej dla każdej płytki z osobna rozpocznij akwizycję obrazu, naciskając przycisk rozpocznij skanowanie. Napraw każdy wstępnie wybrany krążek chrząstki zawierający wzór komórkowy na szalkach Petriego, dodając wystarczającą ilość biokompatybilnego kleju po górnej, dolnej, lewej i prawej stronie dysku. Przykryj krążki 2,5 mililitrem pożywki Leibovitz bez L-glutaminy.Umieścić szalkę Petriego w uchwycie na próbkę urządzenia AFM. Aby skalibrować wspornik AFM, umieść go na powierzchni wspornika pustaka szklanego tak, aby spoczywał na wypolerowanej płaszczyźnie optycznej pośrodku pustaka szklanego. Opuszczaj wspornik w krokach co 100 mikrometrów za pomocą funkcji silnika krokowego, aż zostanie całkowicie zanurzony w medium.Aby zidentyfikować pożądane miejsce pomiaru chrząstki, należy rozpocząć podejście skanera za pomocą wspornika na czystym obszarze wolnej próbki szalki Petriego. Następnie cofnij wspornik 1,5 milimetra od spodu płyty. Przełącz się z widoku jasnego pola na widok fluorescencji i wizualnie zidentyfikuj górną część dysku.Przesuń uchwyt próbki AFM dokładnie dwa milimetry w kierunku środka dysku. Uruchom podejście skanera, aby dotrzeć do powierzchni krążka chrząstki i cofnąć wspornik o 100 mikrometrów. Aby wygenerować krzywą odległości siły, skoncentruj się na komórkach znajdujących się w żądanym miejscu pomiaru.Kliknij przycisk uruchamiania, aby rozpocząć pomiary i uzyskać pięć krzywych odległości siły w każdym miejscu pomiaru. Zapisz krzywe po ich sprawdzeniu. Aby oszacować moduły Younga, korzystając z opcji otwórz partię krzywych spektroskopiowych, otwórz wygenerowane krzywe odległości siły, które mają być analizowane.Wybierz model Hertz-fit, a następnie opcję dopasowania elastycznego. Następnie zwizualizuj i udokumentuj moduł Younga. Dostosuj za pomocą współczynnika Poissona wynoszącego 0,5 i odpowiedniego promienia końcówki wspornika.Następnie sprawdź wzrokowo dopasowanie krzywej odległości siły, aby zapewnić poprawność. Aby określić głębokość wcięcia, otwórz każdą z wygenerowanych krzywych odległości siły w oprogramowaniu do analizy danych i wybierz model dopasowania Hertza jako proces analizy. Zastosuj opcję odejmij odsunięcie linii bazowej, aby wyzerować pionową oś odchylenia i wybierz funkcję odsunięcia plus pochylenie.Użyj funkcji znajdź punkt kontaktowy, aby automatycznie zidentyfikować punkt kontaktowy. Korzystając z funkcji pionowego położenia końcówki, odejmij odległość, uwzględniając wyłącznie ugięcie wspornika od surowej wysokości piezoelektrycznego podczas wcięcia. Wybierz opcję dopasowania sprężystości, aby wyświetlić przetworzoną krzywą odległości siły.Następnie wybierz obszar wykresu tak, aby pokrywał się z najbardziej ujemną wartością na pionowej osi położenia końcówki. Na karcie parametrów w polu XMIN odczytaj i udokumentuj wcięcie. Krążki zawierające pojedyncze struny wykazały wyższe wartości sztywności z medianą 2,6 kilo paskala, co jest reprezentatywne dla bezkompromisowych, zdrowych obszarów chrząstki.Wraz z wystąpieniem i progresją choroby zwyrodnieniowej stawów, pomiary AFM wykazały silny stopniowy spadek sztywności o 42% w podwójnych strunach, 77% w małych skupiskach i ostatecznie o 88% w zaawansowanych stadiach reprezentowanych przez duże skupiska. Krążki zawierające wzór dyfuzyjny wykazywały podwyższoną elastyczność z istotną zmianą pojedynczych wartości modułu Younga. Dla wszystkich krążków chrzęstnych z przypisaną dominującą organizacją wzorca komórkowego stwierdzono, że głębokość wgłębienia związana z zastosowaną wartością zadaną jest odwrotnie proporcjonalna do sztywności.Artefakty widoczne w wygenerowanych krzywych odległości siły wskazują albo na nieoptymalny kontakt między wspornikiem AFM a powierzchnią chrząstki, albo na niewłaściwe utrwalenie próbki na szalce Petriego. Nasze eksplantaty chrząstki mogą być dalej przetwarzane i analizowane przy użyciu różnych technik biologii molekularnej, takich jak analiza białek za pomocą elizy, znakowanie immunologiczne, modowanie zachodnie lub analiza genów za pomocą PCR. Metoda ta może być wykorzystana do zbadania bezpośredniego wpływu nowych terapii na chrzęstność stawową i może pomóc naukowcom w uzyskaniu ważnych informacji na temat mechanizmów choroby zwyrodnieniowej stawów.

addressing-practical-issues-atomic-force-microscopy-based-micro

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Biomechanika tkanek jest ważna dla utrzymania kształtu i funkcji komórki oraz dla określenia fenotypu. W niniejszym raporcie przedstawiono nieniszczące protokoły mechaniczne do charakteryzowania elastycznych i lepkosprężystych właściwości ludzkich tkanek miękkich, które można bezpośrednio zastosować do podłoży inżynierii tkankowej, aby umożliwić ścisłe dopasowanie materiałów inżynieryjnych do tkanek natywnych.

Charakterystyka biomechaniczna tkanek miękkich człowieka za pomocą prób wgnieceń i rozciągania

Proponujemy protokół do badania transportu naładowanych i nienaładowanych cząsteczek przez chrząstkę stawową za pomocą niedawno opracowanych metod eksperymentalnych i numerycznych.

Eksperymentalny protokół elementów skończonych do badania transportu neutralnych i naładowanych substancji rozpuszczonych przez chrząstkę stawową

Przedstawiamy metodę oceny przestrzennego zasięgu uszkodzenia/śmierci komórek na powierzchni stawowej nienaruszonych stawów mysich po zastosowaniu kontrolowanych obciążeń mechanicznych lub uderzeń. Metoda ta może być wykorzystana do zbadania, w jaki sposób choroba zwyrodnieniowa stawów, czynniki genetyczne i/lub różne schematy obciążenia wpływają na podatność chondrocytów in situ.

Wizualizacja i analiza w czasie rzeczywistym uszkodzeń chondrocytów spowodowanych obciążeniem mechanicznym w całkowicie nienaruszonych eksplantatach chrząstki myszy

Sondowanie podczas operacji artroskopii jest zwykle wykonywane w celu oceny stanu tkanek miękkich, ale to podejście zawsze było subiektywne i jakościowe. W niniejszym raporcie opisano urządzenie pomiarowe, które może mierzyć ilościowo opór tkanek miękkich za pomocą trójosiowego czujnika siły podczas artroskopii.

Urządzenie pomiarowe do ilościowego pomiaru właściwości mechanicznych tkanek miękkich podczas artroskopii

Prezentujemy metodę badania wczesnych zmian zwyrodnieniowych stawów na poziomie komórkowym w chrząstce stawowej za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM).

Zastosowanie mikroskopii sił atomowych do wykrywania wczesnej choroby zwyrodnieniowej stawów

Ten protokół opisuje przygotowanie, badania biotribologiczne i analizę cylindrów kostno-chrzęstnych ślizgających się po metalowym materiale implantu. Miarami wyników zawartymi w tym protokole są aktywność metaboliczna, ekspresja genów i histologia.

Badania biotribologiczne i analiza chrząstki stawowej ślizgającej się po metalu pod implanty

Prezentujemy metodę wstrzykiwania komórek za pomocą technologii strumienia wody bez użycia igieł w połączeniu z kontynuacją badań po porodzie pod kątem żywotności komórek, proliferacji i pomiarów elastyczności.

Iniekcja komórek zrębu tkanki tłuszczowej pochodzącej z tkanki tłuszczowej świń za pomocą technologii strumienia wody

Ilościowe określenie powierzchni styku i siły wywieranej przez końcówkę sondy mikroskopu sił atomowych (AFM) na powierzchnię próbki umożliwia określenie właściwości mechanicznych w nanoskali. Omówiono najlepsze praktyki w zakresie wdrażania nanotwardości opartej na wspornikach AFM w powietrzu lub płynie na miękkich i twardych próbkach w celu pomiaru modułu sprężystości lub innych właściwości nanomechanicznych.

Mikroskopia sił atomowych Nanotwardość oparta na wspornikach: pomiary właściwości mechanicznych w nanoskali w powietrzu i płynie

W tym protokole pokazujemy, jak przygotować tkankę aksolotla do mikroskopii sił atomowych (AFM) i wykonać pomiary wgłębień w nienaruszonej i regenerującej się chrząstce kończyny.

Pomiary mikroskopii sił atomowych chrząstki w nienaruszonych i regenerujących się kończynach aksolotla

Ten protokół wizualizuje, jak przygotować kriosekcje mysiej tkanki płucnej, przeprowadzić eksperymenty z mapą siły pod mikroskopią sił atomowych i przeanalizować dane w celu określenia modułu Younga natywnej mysiej błony podstawnej płuc.

Wyodrębnianie modułu Younga natywnych mysich błon podstawnych płuc z map sił pochodnych mikroskopii sił atomowych

Proponujemy protokół oceny regeneracji kości na różnych poziomach hierarchicznych. To podejście multimodalne umożliwia analizę strukturalną na różnych skalach długości, skutecznie rozwiązując wyzwania związane z przygotowaniem próbek. Zapewnia również wiarygodny sposób oceny skuteczności biomateriałów w wspieraniu regeneracji kości.

Podejście multimodalne do oceny regeneracji kości i wydajności rusztowania

Poznaj metodę mikroindentacji AFM do badania właściwości mechanicznych ludzkiej chrząstki stawowej. Ten model in vitro umożliwia analizę postępu osteoartrozy i ocenę terapii na poziomie biomechanicznym.

Rozwiązywanie praktycznych problemów związanych z mikrowgłębieniami opartymi na mikroskopii sił atomowych na eksplantatach ludzkiej chrząstki stawowej (Wideo) | JoVE Journal

Rozwiązywanie praktycznych problemów związanych z mikrowgłębieniami opartymi na mikroskopii sił atomowych na eksplantatach ludzkiej chrząstki stawowej

Przeglądaj więcej filmów