Rozwiązywanie praktycznych problemów związanych z mikrowgłębieniami opartymi na mikroskopii sił atomowych na eksplantatach ludzkiej chrząstki stawowej
28 października 2022
Przedstawiamy krok po kroku podejście do identyfikacji i rozwiązywania najczęstszych problemów związanych z mikrowgłębieniami mikroskopii sił atomowych. Ilustrujemy pojawiające się problemy na rodzimych eksplantatach ludzkiej chrząstki stawowej, charakteryzujących się różnym stopniem zwyrodnienia spowodowanego chorobą zwyrodnieniową stawów.
Celem tego protokołu było stworzenie modelu in vitro do badania właściwości mechanicznych chrząstki stawowej podczas wystąpienia i progresji choroby zwyrodnieniowej stawów. Główną zaletą obecnej techniki jest to, że eksplantaty chrząstki są łatwe do wygenerowania i wysoce reprezentatywne dla chrząstki w wieku rodzimym. Model ten może być używany do analizy i monitorowania różnych podejść do choroby zwyrodnieniowej stawów, diagnostycznych i terapeutycznych na poziomie biomechanicznym.
Na początek odetnij chrząstkę od kości za pomocą skalpela. Za pomocą stempla biopsyjnego wygeneruj dyski o średnicy czterech milimetrów. Umieść tarczę na specjalnie wykonanym urządzeniu tnącym.
Za pomocą szpatułki przymocuj i ustabilizuj krążek chrząstki. Przetnij krążek chrząstki żyletką. Za pomocą szpatułki zbierz krążek i umieść go w 1,5-mililitrowej tubce.
Aby pozostać w próbkach chrząstki, dodaj 130 mikrolitrów przepuszczalnego dla komórek barwnika fluorescencyjnego do każdego dołka 96-dołkowej płytki i rozprowadź krążek na płytce jako jeden krążek na studzienkę. Umieść 96-dołkową płytkę na uchwycie płytki mikroskopu fluorescencyjnego. Wybierz odpowiedni filtr fluorescencyjny i obiektyw.
Umieść obiektyw pod wstępnie wybraną studzienką zawierającą pojedynczą chrząstkę. Ustaw ostrość na dysku, aby zobaczyć wzorzec komórkowy. Wybierz funkcję nawigatora, aby uzyskać przegląd całej studni.
Użyj lewego przycisku myszy i przeciągnij go, aby przejść do innej pozycji sceny. Wybierz kwadrat obejmujący obszar zainteresowania, który ma zostać zeskanowany. Wybierz opcję punktu mapy ostrości oprogramowania, a następnie wybierz każdy pojedynczy kafelek, klikając lewym przyciskiem myszy w jego środku.
Wybierz opcję mapa fokusu w wyświetlonym oknie ze wszystkimi wcześniej wybranymi kafelkami. Kliknij dwukrotnie kafelek, aby go wyświetlić i ustawić na nim odpowiednią ostrość. Następnie kliknij ustaw Z, aby zapisać plan ogniskowej i przejść do następnego kafelka.
Po dostosowaniu planu ogniskowej dla każdej płytki z osobna rozpocznij akwizycję obrazu, naciskając przycisk rozpocznij skanowanie. Napraw każdy wstępnie wybrany krążek chrząstki zawierający wzór komórkowy na szalkach Petriego, dodając wystarczającą ilość biokompatybilnego kleju po górnej, dolnej, lewej i prawej stronie dysku. Przykryj krążki 2,5 mililitrem pożywki Leibovitz bez L-glutaminy.
Umieścić szalkę Petriego w uchwycie na próbkę urządzenia AFM. Aby skalibrować wspornik AFM, umieść go na powierzchni wspornika pustaka szklanego tak, aby spoczywał na wypolerowanej płaszczyźnie optycznej pośrodku pustaka szklanego. Opuszczaj wspornik w krokach co 100 mikrometrów za pomocą funkcji silnika krokowego, aż zostanie całkowicie zanurzony w medium.
Aby zidentyfikować pożądane miejsce pomiaru chrząstki, należy rozpocząć podejście skanera za pomocą wspornika na czystym obszarze wolnej próbki szalki Petriego. Następnie cofnij wspornik 1,5 milimetra od spodu płyty. Przełącz się z widoku jasnego pola na widok fluorescencji i wizualnie zidentyfikuj górną część dysku.
Przesuń uchwyt próbki AFM dokładnie dwa milimetry w kierunku środka dysku. Uruchom podejście skanera, aby dotrzeć do powierzchni krążka chrząstki i cofnąć wspornik o 100 mikrometrów. Aby wygenerować krzywą odległości siły, skoncentruj się na komórkach znajdujących się w żądanym miejscu pomiaru.
Kliknij przycisk uruchamiania, aby rozpocząć pomiary i uzyskać pięć krzywych odległości siły w każdym miejscu pomiaru. Zapisz krzywe po ich sprawdzeniu. Aby oszacować moduły Younga, korzystając z opcji otwórz partię krzywych spektroskopiowych, otwórz wygenerowane krzywe odległości siły, które mają być analizowane.
Wybierz model Hertz-fit, a następnie opcję dopasowania elastycznego. Następnie zwizualizuj i udokumentuj moduł Younga. Dostosuj za pomocą współczynnika Poissona wynoszącego 0,5 i odpowiedniego promienia końcówki wspornika.
Następnie sprawdź wzrokowo dopasowanie krzywej odległości siły, aby zapewnić poprawność. Aby określić głębokość wcięcia, otwórz każdą z wygenerowanych krzywych odległości siły w oprogramowaniu do analizy danych i wybierz model dopasowania Hertza jako proces analizy. Zastosuj opcję odejmij odsunięcie linii bazowej, aby wyzerować pionową oś odchylenia i wybierz funkcję odsunięcia plus pochylenie.
Użyj funkcji znajdź punkt kontaktowy, aby automatycznie zidentyfikować punkt kontaktowy. Korzystając z funkcji pionowego położenia końcówki, odejmij odległość, uwzględniając wyłącznie ugięcie wspornika od surowej wysokości piezoelektrycznego podczas wcięcia. Wybierz opcję dopasowania sprężystości, aby wyświetlić przetworzoną krzywą odległości siły.
Następnie wybierz obszar wykresu tak, aby pokrywał się z najbardziej ujemną wartością na pionowej osi położenia końcówki. Na karcie parametrów w polu XMIN odczytaj i udokumentuj wcięcie. Krążki zawierające pojedyncze struny wykazały wyższe wartości sztywności z medianą 2,6 kilo paskala, co jest reprezentatywne dla bezkompromisowych, zdrowych obszarów chrząstki.
Wraz z wystąpieniem i progresją choroby zwyrodnieniowej stawów, pomiary AFM wykazały silny stopniowy spadek sztywności o 42% w podwójnych strunach, 77% w małych skupiskach i ostatecznie o 88% w zaawansowanych stadiach reprezentowanych przez duże skupiska. Krążki zawierające wzór dyfuzyjny wykazywały podwyższoną elastyczność z istotną zmianą pojedynczych wartości modułu Younga. Dla wszystkich krążków chrzęstnych z przypisaną dominującą organizacją wzorca komórkowego stwierdzono, że głębokość wgłębienia związana z zastosowaną wartością zadaną jest odwrotnie proporcjonalna do sztywności.
Artefakty widoczne w wygenerowanych krzywych odległości siły wskazują albo na nieoptymalny kontakt między wspornikiem AFM a powierzchnią chrząstki, albo na niewłaściwe utrwalenie próbki na szalce Petriego. Nasze eksplantaty chrząstki mogą być dalej przetwarzane i analizowane przy użyciu różnych technik biologii molekularnej, takich jak analiza białek za pomocą elizy, znakowanie immunologiczne, modowanie zachodnie lub analiza genów za pomocą PCR. Metoda ta może być wykorzystana do zbadania bezpośredniego wpływu nowych terapii na chrzęstność stawową i może pomóc naukowcom w uzyskaniu ważnych informacji na temat mechanizmów choroby zwyrodnieniowej stawów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół stworzenia modelu in vitro do badania właściwości mechanicznych chrząstki stawowej podczas postępu choroby zwyrodnieniowej stawów. Metoda koncentruje się na użyciu natywnych eksplantów chrząstki ludzkiej, które są łatwe do wygenerowania i reprezentatywne dla zmian związanych z wiekiem.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia
- Biomechaika
Tło
- Choroba zwyrodnieniowa stawów jest chorobą zwyrodnieniową stawów, która atakuje chrząstkę.
- Zrozumienie mechaniki chrząstki jest kluczowe dla opracowywania strategii terapeutycznych.
- Obecne modele mogą nie dokładnie reprezentować właściwości natywnej chrząstki.
- To badanie ma na celu wypełnienie tych luk za pomocą nowego podejścia in vitro.
Cel badania
- Stworzyć niezawodny model in vitro do badania mechaniki chrząstki.
- Ułatwić analizę postępu choroby zwyrodnieniowej stawów.
- Oceniać podejścia diagnostyczne i terapeutyczne na poziomie biomechanicznym.
Stosowane metody
- Chrząstka jest odcięta od kości za pomocą skapula.
- Generowane są krążki o średnicy czterech milimetrów za pomocą wykrawacza do biopsji.
- Krążki są umieszczane na specjalnym urządzeniu do cięcia w celu dalszej analizy.
- Mikrowciska mikroskopii sił atomowych są zastosowane do oceny właściwości mechanicznych.
Główne wyniki
- Protokół z powodzeniem generuje eksplanty chrząstki, które naśladują warunki naturalne.
- Właściwości mechaniczne chrząstki mogą być skutecznie monitorowane.
- Identyfikowane i rozwiązywane są wszelkie problemy związane z techniką.
- Ten model zapewnia wgląd w diagnostykę i terapię choroby zwyrodnieniowej stawów.
Wnioski
- Model in vitro jest cennym narzędziem do badania choroby zwyrodnieniowej stawów.
- Pozwalla na badanie mechaniki chrząstki w kontrolowanym środowisku.
- Przyszłe badania mogą się opierać na tym modelu do badania interwencji terapeutycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Atomic force microscopy (AFM)-based micro-indentation on human articular cartilage explants enables precise biomechanical profiling critical for early osteoarthritis research. Addressing practical artifacts in AFM workflows enhances predictive confidence in mechanical property measurements, supporting robust target validation and mechanistic de-risking at the discovery stage. This capability strengthens translational continuity from discovery through preclinical evaluation of disease-modifying interventions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of cartilage mechanical properties across disease stages.
- Supports functional target validation by linking biomechanical changes to osteoarthritis progression.
- Facilitates mechanistic de-risking by identifying artifacts and ensuring data integrity.
- Improves predictive confidence for early-stage portfolio triage decisions.
Screening & Assay Development
- Establishes validated ex vivo systems for reproducible biomechanical assays.
- Standardizes sample preparation and AFM protocols to minimize measurement artifacts.
- Delivers quantitative Young's modulus and indentation depth outputs for compound evaluation.
- Enables reliable screening of therapeutic candidates targeting cartilage integrity.
Translational & Preclinical Research
- Aligns biomechanical readouts with disease-relevant human tissue models.
- Provides continuity from discovery-stage findings to preclinical validation of therapeutic impact.
- Supports risk-adjusted advancement by clarifying mechanical endpoints in osteoarthritis models.
- Facilitates integration with molecular analyses for comprehensive biomarker strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This AFM-based micro-indentation protocol fits within the early discovery to preclinical continuum, enabling hypothesis testing, target validation, and translational research in osteoarthritis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven assessment of cartilage degeneration mechanisms.
- Screening: Provides reproducible, quantitative biomechanical outputs for assay readiness.
- Analytics: Delivers force-distance curves, Young's modulus, and indentation depth for robust statistical comparison.
- Translational Research: Bridges ex vivo findings to preclinical evaluation of therapeutic interventions.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, reusable workflow for cartilage biomechanics across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cartilage research.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of biomechanical assays.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes capital allocation in osteoarthritis portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of disease-modifying candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation and biomechanical data analysis.
- Demands access to calibrated AFM instrumentation and fluorescence imaging platforms.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of sample preparation and data processing.
- May require adaptation for different cartilage sources or disease models.
- Attention to sample-tip interaction and fixation is critical to avoid measurement artifacts.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:42
Tissue Processing and Generation of Cartilage Discs
1:14
Cartilage Disc Staining and Sorting
2:43
Biomechanical Approach of Cartilage Explants
6:11
Results: AFM Measurements of Cartilage Discs Based on Cellular Pattern Organization
7:25
Conclusion
