Bu prosedür, arıtma gösteriyor ve in vitro antijen spesifik CD4 + T hücreleri, tüm periferik kan ve MHC sınıf II tetramers kullanarak görselleştirme genişleme. Tetramers tek bir antijen özgüllüğü ve tanımlanan MHC sınıf II kısıtlama ile T hücrelerinin doğrudan görselleştirme izin verir.
Major histokompatibilite kompleksi (MHC) sınıf II tetramers antijen spesifik CD4 + T hücrelerinin flow sitometri tarafından doğrudan görselleştirme izin verir. Bu yöntem son derece özel bir peptit yüklü MHC ve ilgili T-hücre reseptör arasındaki etkileşimi dayanıyor. MHC / peptid tek bir molekülün yakınlığı düşük olmasına rağmen, çapraz bağlama streptavidin ile MHC / peptid kompleksleri reaktifler boyama olarak kullanımını sağlamak, avidite etkileşimi artırır. CD4 + T hücreleri (~ 1 tek bir özgüllüğü 300.000) nispeten düşük frekanslarda bu testte in vitro amplifikasyon adımda bir algılama eşiğini artırmak için kullanır. Ficoll altında yatan periferik kan mononükleer hücreler temizlenir. CD4 + hücreler, daha sonra biotinlenmiş antikor kokteyli ve anti-biotin etiketli manyetik boncuklar kullanarak negatif seçimi ile ayrılır. CD4 hücre fraksiyonu yapışık hücrelere antijen hücreleri, CD4 + T hücrelerinin antijenik peptid ve IL-2 ekleyerek medya genişletilmiş biçimde sergileyen bir belge olarak kullanılması. Genişletilmiş hücreleri, bir saat 37 C'de inkübe ve daha sonra lekeli, anti-CD4, anti-CD3 ve anti-CD25 gibi yüzey antikorları kullanarak ilgili sınıf II tetramer ile boyandı. Etiketleme sonra, hücreler flow sitometri ile analiz edilebilir. Tetramer pozitif hücreler genellikle genişletilmiş CD4 + hücreler arasında ayrı bir nüfus oluşturmaktadır. Tetramer pozitif hücreler genellikle CD25 + ve genellikle CD4 yüksek. Arka plan tetramer boyanma seviyesi farklılık gösterebilir, çünkü pozitif boyanma sonuçları her zaman ilgisiz bir tetramer aynı hücrelerin boyanması göre olmalıdır. Bu temel testinin Çoklu değişiklikler olabilir. Tetramer pozitif hücrelerin daha fazla fenotipik analiz, ELISPOT veya çoğalması testleri dahil, ya da diğer ikincil testleri için sıralanır olabilir. Bazı gruplar aynı zamanda co-boyama tetramers ve anti-sitokin veya anti-FoxP3 antikorları kullanarak göstermiştir.
Bağışıklık CD4 + T hücrelerinin rolünü anlamak temelde önemli. Ancak, antijen spesifik CD4 + T hücreleri tespit ve geleneksel yöntemler kullanılarak izole etmek zor olabilir. Buna karşılık, CD4 + T hücreleri MHC sınıf II tetramers istenen antijen özgüllüğü ile doğrudan görselleştirme izin verir. Bu video, izolasyon, saflaştırma ve CD4 + T hücreleri ve sonraki görselleştirme kullanarak tetramers in vitro amplifikasyon göstermektedir. Sınıf II Tetramers çözünür biotinlenmiş sınıf I…
Dick Foley ve Leigh Kimball, film çekimi ve video prodüksiyon anahtar roller için teşekkür ederiz.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Class 2 Laminar flow biosafety cabinet | equipment | Thermo Forma | 1200 | Or equivalent |
50 mL conical Tube | equipment | VWR | 47747-182 | Or equivalent |
1X PBS (Ca/Mg free) | Reagent | HyClone | SH30028.02 | Or equivalent |
Ficoll-paque PLUS | Reagent | GE Healthcare | 17-1440-03 | foil wrapped to protect from light |
Pipet Aid XP | equipment | Drummond | 4-000-101 | Or equivalent |
10 mL pipet | equipment | Corning/Costar | CLS4492 | Or equivalent |
Aerosolve Canisters | equipment | Beckman | 359481 | with 50 mL inserts |
Centrifuge | equipment | Beckman | GS-6R | Or equivalent |
Transfer pipets | equipment | Samco | 202-20S | Or equivalent |
Pasteur pipets | equipment | VWR | 14672-200 | Or equivalent |
Hemolytic Buffer | Reagent | N/A | N/A | 8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA |
Trypan blue | Reagent | Sigma | T6146 | 0.2% in PBS |
Hemocytometer | equipment | VWR | 15170-208 | |
15 mL conical tube | equipment | VWR | 05-527-90 | Or equivalent |
Running Buffer | Reagent | N/A | N/A | PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA |
MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-091-155 | Or equivalent |
EasySep® Magnet | equipment | Stem Cell Technologies | 18000 | |
5 mL polypropylene tube | equipment | Falcon | 352063 | |
RPMI 1640 | Reagent | Invitrogen | 22400-089 | with 25 mM HEPES |
Pooled human serum | Reagent | N/A | N/A | drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered |
Pen Strep | Reagent | Invitrogen | 1570-063 | Or equivalent |
500mL 0.22 micron bottle top filter | equipment | Nalgene | 595-3320 | Or equivalent |
48-well plate | equipment | Costar | 3548 | Or equivalent |
37°C CO2 incubator | equipment | Sanyo Scientific | MCO-18AIC | Or equivalent |
20 mg/mL synthetic peptide | Reagent | N/A | N/A | Custom synthesis from any peptide vendor |
5 mL FACS tube | equipment | Falcon | 352008 | Polystyrene |
Peptide loaded class II tetramer (as described) | Reagent | N/A | N/A | Prepared by the BRI tetramer core |
Anti-CD3 | Reagent | BD pharmingen | 347344 | Or equivalent |
Anti-CD4 | Reagent | eBioscience | 17-0049-73 | Or equivalent |
Anti-CD25 | Reagent | eBioscience | 11-0259-73 | Or equivalent |
Facs Calibur Flow Cytometer | equipment | BD Biosciences | 342975 | Or equivalent |