قياس جدار الخلية النباتية ملحق (زحف) المستحثة بواسطة الرقم الهيدروجيني حمضي والفا Expansin

Summary

ندلل على استخدام القوة التمدد المستمر لقياس المدى الطويل التمديد (الزحف) من العينات النباتية جدار الخلية الناجم عن مخازن الحمضية والبروتين expansin.

Abstract

تزايد جدران الخلايا النباتية المعرض بشكل مميز خاصية تعرف باسم "النمو حامض ، ونعني أنها أكثر الموسعة في انخفاض الرقم الهيدروجيني (<5) ^1. وأوكسين هرمون يحفز النبات بسرعة استطالة خلية في ينبع الشباب والأنسجة مماثلة على الأقل في جزء من آلية النمو حمض ^{2 ، 3.} أوكسين ينشط H ⁺ مضخة في غشاء البلازما ، مما يسبب تحمض الخلية حل الجدار. الجدار تحمض ينشط expansins ، والتي هي الخلية الذاتية الجدار تخفيف البروتينات ⁴ ، مما تسبب في جدار الخلية الاستسلام لالتوترات الناجمة عن ضغوط الجدار تورم الخلية. ونتيجة لذلك ، تبدأ لتكبير الخلية بسرعة. يقاس بسهولة هذه الظاهرة "النمو حمض" في عزلة (غير الحية) العينات جدار الخلية. قدرة على الخضوع لجدران الخلايا الحمضية الناجمة عن تمديد ليست مجرد نتيجة لهذا الترتيب الهيكلي للجدار الخلية السكريات (مثل pectins) ، ولكنها تعتمد على نشاط expansins ^5. Expansins لم يكن لديك أي نشاط معروف الأنزيمية والطريقة الوحيدة لفحص لنشاط expansin هو قياس الحث على تمديد جدار الخلية. هذا التقرير تفاصيل الفيديو مصادر وتقنيات التحضير للحصول على مواد الجدار مناسبة لفحوصات expansin ويمضي لتظهر حمض بفعل التمديد وexpansin بفعل التمديد لعينات من جدار المعدة من خيار hypocotyls المتنامية.

للحصول على عينات مناسبة جدار الخلية ، وتزرع شتلات الخيار في الظلام ، وقطع hypocotyls والمجمدة في -80 درجة مئوية. ومتآكل hypocotyls المجمدة ، بالارض ، وفرضت بعد ذلك في توتر دائم في كفيت خاص لقياس التمدد. لقياس حمض بفعل التمديد ، يتم تخزينها في البداية على الجدران محايد الرقم الهيدروجيني ، مما أدى إلى انخفاض في النشاط expansins التي تشكل عناصر من جدران الخلايا الأصلية. عند تبادل عازلة لدرجة الحموضة الحمضية ، ويتم تنشيط expansins وجدران الخلايا تمتد بسرعة. نظهر أيضا نشاط expansin في إعادة فحص. لهذا الجزء ، ونحن استخدام المعالجة الحرارية قصيرة لتفسد expansins الأصلي في عينات من جدار الخلية. هذه الجدران الخلية المعطل لا تمتد حتى في المخزن الحمضية ، ولكن إضافة إلى expansins جدران الخلايا بسرعة استعادة قدرتها على توسيع نطاق.

Protocol

الجزء 1 : زراعة وتخزين المواد النباتية المناسبة

1. في تجربتنا ، hypocotyls الشباب من شتلات الخيار etiolated بمثابة مصدرا مريحا للمواد الجدار الخلوي لهذه التجارب. وزرعت بذور الخيار على الورق الرطب في ضوء مربع واقية ، والتي تبقي في خزانة في غرفة مظلمة درجة حرارة ثابتة وضعت في 26 درجة مئوية. درجة الحرارة بالضبط ليست حرجة ، وعلى ما بين 22 درجة و 30 درجة مئوية وينبغي أن يكون على ما يرام ، ولكن درجة الحرارة سيحدد مدى سرعة الوصول الى مرحلة الشتلات المناسبة للتنمية. الأكثر دفئا وحرارة ، وأسرع وتطوير الشتلات. نحن عادة استخدام الشتلات عندما نمت إلى حوالي 5 سم في الطول ، الذي تم التوصل 3-4 أيام بعد البذر. فمن المهم أن تكون الشتلات نمت في الظلام ، وحتى كميات صغيرة من الضوء تؤثر على معدل التنمية الشتلات وخصائص جدار الخلية التي نقيس مع هذه التقنية. في يوم 3 يمكنك ملاعبة في المربع ، وذلك باستخدام الضوء الأخضر الباهت تصفيتها ، للاطمئنان على وضع الغرسات.
2. تقطع الشتلات بسرعة ومعبأة في علب بلاستيكية صغيرة ، 100-150 شتلة في المربع ، وتخزينها في -80 ° C. عند هذه الدرجة التي لا تزال مفيدة لعدة اسابيع.

الجزء 2 : تحضير عينات جدار الخلية

1. يتم نقل مجموعات صغيرة (8-10) من الشتلات خفض المجمدة من الفريزر إلى حاوية تحتوي على كتلة عازلة المجمد -80.
2. غير متآكل إهاب تغطي التحتفلقي مع السامور. يتم ذلك عن طريق الرسم مرارا التحتفلقي بين الإبهام والسبابة ، والتي هي المغلفة مع الطين سميكة من مسحوق السامور الرطب. فإنه يأخذ القليل الخبرة في معرفة المبلغ الصحيح من الضغط لاستخدام : الكثير من الضغط وطبقة البشرة يبدأ تكون تمزيقه وممزقة ، والضغط قليلا جدا ، ولن يكون permeabilized إهاب. واحد أيضا على العمل بسرعة لأنه كما يذوب في التحتفلقي المجمدة ، يصبح رخو ويصعب السيطرة عليها.
3. وانخفض التحتفلقي متآكل في الماء المثلج لإزالة معظم السامور التمسك ثم تخزينها على الماء المثلج بينما أعد hypocotyls المتبقية بطريقة مماثلة.
4. يتم قطع hypocotyls إلى الطول المطلوب ، وعادة 1،2 سم ، مع واحدة جديدة شفرة حلاقة وارتفع محاذاة ثم على شريحة زجاجية.
5. الآن نحن بحاجة إلى تسطيح الجدران لإزالة الخلايا والنسغ لتسهيل لقط. يتم وضع شريحة زجاجية الثاني على رأس مجموعة من عينات 80-10 ، وتشكيل لبيع الشطائر. يتم وضع الوزن (400-500 ز) على أعلى شريحة زجاجية لمدة 5 دقائق. لوزن نستخدمها بشكل روتيني دورق يحتوي على كمية مناسبة من الماء.
6. خطوة اختيارية : اعتمادا على هذه التجربة ، قد يكون المعطل لhypocotyls مع المعالجة الحرارية وجيزة عند هذه النقطة. للقيام بذلك ونحن ربط الشرائح الزجاجية مع زوج من الأربطة المطاطية ، وضعت في وعاء التجميع مع 100 مل من غير المتأينة المياه في درجة حرارة الغرفة ووضعه في فرن الميكروويف بكل طاقته. مع المايكرويف لدينا تبدأ المياه في الغليان بنحو 50 ق ونتوقف في الميكروويف 15 ق بعد الغليان يبدأ. يتم سكب الماء الساخن بسرعة خارج والاستعاضة بالماء البارد لوقف تمسخ. قد تضطر لتغيير هذه التوقيتات ، والميكروويف الخاص بك قد تكون مختلفة من بلدنا. التدفئة المفرطة مع العينات تصبح ضعيفة وكسر بسهولة. مع التدفئة كافية ليس المعطل في expansin الذاتية وعينات الجدار لا تزال تحتفظ ببعض القدرة على الاستجابة للدرجة الحموضة الحمضية.

الجزء 3 : إعداد التمدد

1. وفرضت الآن عينات الجدار في قوة التمدد المستمر. هذا هو جهاز مخصص الصنع التي تتكون من كفيت زجاجي لعقد نهاية القاعدية من العينة الجدار والمشبك المنقولة تعلق على نهاية قمية من العينة. هي التي شنت المشبك المنقولة في نهاية قضيب الذي يمر عبر فتح ملفات من جهاز استشعار الموقف ، وهو LVDT أو 'التفاضلية الخطية محول متغير" ، التي يكشف إلكترونيا الموقف من اسطوانة معدنية صغيرة ، أو "الأساسية" ، وهذا هو تعلق على قضيب. ويرتبط في نهاية العلوي من قضيب إلى ذراع مع موازن للتعديل. هذه الرافعة تمارس ضبط مبلغ القوة الصاعدة على عينة الجدار. يتم ضبط القوة عن طريق إضافة أو إزالة المعادن معايرة الأوزان إلى نهاية بكثير من ذراع.
2. العودة إلى نموذج الجدار -- يتم انتقاؤها نهاية القاعدية من العينة التحتفلقي مع ملقط غرامة ويوضع ~ 2-3 ملم من قمية في نهاية بين فكي المفتوحة للالمشبك المنقولة. هذا هو المشبك المشبك التمساح بنابض الذي المعدنية المغلفة بالبلاستيك الفكين لمنع الاتصال المباشر بين سطح المعدن وحل مؤقت أو العينة الجدار. في أيونات معدنية لدينا تجربة يمكن أن تتسرب من المشبك وتحول دون قدرة الجدار على أن تقدم ، وهكذا نحافظ على المعدن مغطاة.
3. عقد التجمع المشبك المنقولة في يد واحدة ، يتم الآن ناور نهاية القاعدية للعينة في الجدار بين القطع يتوقف اثنين من زجاجي كفيت وكفيت ويتم جلب القطع معا ومشدود ضيقة ، وبالتالي تأمين نهاية الجزء السفلي من الجدار في عينة كفيت.
4. الآن التجميع المشبك المنقولة صدر بلطف ، والسماح بنقل القوة الكاملة للثقل العينة الجدار. نستخدم عادة ثقلا موازنا ما مجموعه 20 غراما للحصول على عينات من جدار المعدة hypocotyls الخيار. قد الجدار مواد أخرى أو تجارب تتطلب أوزان مختلفة.
5. يتم تعبئة كفيت مع العازلة (200 UL) وموقف كفيت تحركت صعودا أو هبوطا مع المسمار التعديل ، بحيث يتم جلب المشبك المنقولة إلى انخفاض نهاية LVDT نطاق القياس. يرتبط LVDT لدينا إلى وحدة جمع البيانات من الحواسيب الصغيرة ، وهكذا نحن نراقب الموقف عن طريق الكمبيوتر LVDT. لدينا ثمانية مجالس LVDT متصلة بالتوازي مع جهاز كمبيوتر واحد ، مما يسمح لنا لتشغيل الجدار 8 عينات في وقت واحد. الكمبيوتر يسجل موقف كل من المجالس مرة واحدة كل ثانية. LVDT 30

الجزء 4 : قياس استجابة لتمديد حامضي أو expansin -- نتائج الممثل

1. يضاف [التجربة الأولى] للحصول على قياس حمض بفعل التمديد ، ونحن نبدأ مع عينات الجدار الأصلي (الذي هو ، وليس المعطل مع الحرارة) ، وعازلة محايدة لكفيت. عينات الجدار تمتد لبضع دقائق ، وذلك استجابة للتوتر وأضاف ، ولكن التمديد يضمحل إلى انخفاض معدل بعد بضع دقائق. جهاز الكمبيوتر لدينا يتيح لنا مراقبة إما التغيير في طول العينة (أي تغيير في موقف الشبك المنقولة ، بعد بدء التجربة) أو يمكننا رصد المشتقة الوقت للموقف ، وبعبارة أخرى فإن معدل التمديد . معدل التمديد لتستقر قيمة منخفضة مع مرور الوقت.
2. بعد 20 دقيقة ~ ، تتم إزالة عازلة محايدة. نستخدم أنابيب معدنية رقيقة ، مصنوعة من إبرة الحقن قياس كبير ، متصلا مضخة فراغ لإزالة العازلة بسرعة ، مع الحد الأدنى من الإزعاج للجدار أو التجميع الميكانيكية. ثم يتم إضافة الحمضية العازلة ، وأحيانا مع 1-2 التبادل السريع لتأمين تبادل كاملة لالعازلة الحمضية. ثم علينا الجلوس ومشاهدة استجابة من الجدار. عادة لا يمكننا الكشف عن معدل أسرع من التمديد في بضع دقائق. بعد 60 دقيقة لدينا عادة ما يكفي من المعلومات لتقييم مدى استجابة التمديد ، رغم أنه في بعض الحالات القياسات قد تمتد إلى فترات أطول.
3. يضاف [التجربة الثانية] للحصول على قياس expansin التي يسببها جدار الخلية التمديد ، ونحن نبدأ مع عينات الجدار المعطل للحرارة وعازلة للكفيت الحمضية. كما في التجربة الأولى ، فإن معدل تمديد جدار الخلية يستقر تدريجيا إلى قيمة منخفضة بسبب عدم وجود expansin الوظيفية.
4. بعد 20 دقيقة ~ ، إضافة إلى البروتين expansin كفيت ل 'التشويك' مع العازلة في 10-20 ماي كفيت مع التوصل إلى حل expansin. وexpansin تخترق بسرعة العينة وجدار الخلية في غضون بضع دقائق ونحن نرى أن معدل التمديد قد ازداد. يمكن أن يتبع هذا الرد تمديد لمدة ساعة أو أكثر.

الشكل 1 : مخطط لإعداد إجراءات لتقييم جدران الخلايا التي يسببها أو حمض expansin بفعل امتداد الجدار.

Discussion

لهذه المظاهرة كنا جدران الخلايا من hypocotyls الخيار لأنها أثبتت أن تكون مصدرا موثوقا للعينات الجدار التي يسهل التعامل معها والتي تستجيب مع حساسية جيدة. كان لدينا أيضا نجاحا جيدا مع جدران من الشتلات الأخرى ، فضلا عن بعض المواد من السوبر ماركت ، مثل أوراق السبانخ الشباب وسيقان الكرفس. أساسا ، لينة الشباب ، والأنسجة النباتات التي تنمو بسرعة ومن المرجح أن يكون قياسه بسهولة مع هذه التقنية ، ولكن القديمة صعبة ، والأنسجة النباتية أو تتأكسد nongrowing من غير المرجح أن تكون متجاوبة نظرا لربط عبر جدار الخلية. هناك بضعة أشياء أخرى الحذر من :

1. التغير البيولوجي -- الشتلات حتى اعطاء اجابات موحدة متغير ، لذلك يعيد الحد الأدنى من 5-8 من الضروري أن تسفر عن نتائج ذات مغزى من الناحية الإحصائية.
2. الكشط للبشرة من المهم أن تسمح الاختراق السريع للمخازن والبروتينات داخل الخلية عينة الجدار. إذا لم يتم إهاب متآكل بما فيه الكفاية ، والردود على مخازن الحمضية تكون بطيئة وصامتة والبروتينات قد لا تتمكن من اختراق حتى جليدة للحصول على رد. قد لا تحتاج بعض العينات الكشط ، أي إذا كنت تستخدم قشور البشرة أو غيرها من الأنسجة تشريح. غير منتظم كشط يضيف تقلب كبير بالنسبة للمستخدمين المبتدئين كثيرة.
3. يمكن أن يتم تعطيل الحرارة ، والذي يستخدم لإزالة أو تفسد expansins الذاتية ، من قبل وسائل أخرى ، ولكن المرء يحتاج إلى العثور على كمية ضئيلة من التدفئة لتعطيل expansin الذاتية لتجنب الإفراط في إضعاف وكسر جدار من العينات.
4. Expansins عرضة للتعطيل من قبل الأكسدة ، dithiothreitol حتى 1-5 ملم في المنطقة العازلة وعادة ما يساعد على استقرار النشاط.
5. والتمدد ليست قبالة الجاهزة للاستخدام قطعة من المعدات ، ولكنها تتطلب بناء مخصصة لكفيت (أ) التي تحمل العينة الجدار و (ب) إن الجمعية LVDT - المشبك - موازن. واجهة الكمبيوتر والبيانات اقتناء وحدة ليست ضرورية ، بل هي قيمة خاصة بالنسبة للتشغيل في وقت واحد وتكرار عينات لتحليل المنحنيات تمديد كميا.