מדידת תא הצמח החומה הרחבה (Creep) מושרה על ידי ה-pH חומצי על ידי Alpha-Expansin

Summary

אנו מדגימים את השימוש extensometer כוח קבוע, למדוד לטווח ארוך הארכה (זחילה) של תא הדגימות צמח קיר המושרה על ידי מאגרים חומציים חלבון expansin.

Abstract

גידול הצמח קירות התא אופיינית התערוכה מאפיין בשם "צמיחה חומצה", שבו אנו מתכוונים הם הרחבה יותר ב-pH נמוך (<5) ^1. האוקסין הורמון מגרה צמח במהירות התארכות התא נובעת צעירים ורקמות דומה לפחות חלקית על ידי מנגנון חומצה צמיחה ^{2, 3.} אוקסין מפעיל משאבת H ⁺ בקרום פלזמה, גרימת החמצה של הפתרון דופן התא. החמצה הכותל מפעיל expansins, אשר אנדוגני קיר התרופפות התא חלבונים ^4, בגרימת דופן התא להיכנע המתחים קיר שנוצר על ידי לחץ turgor התא. כתוצאה מכך, התא מתחיל להגדיל במהירות. תופעה זו "צמיחה חומצה" נמדדת בקלות מבודדים (הדומם) דגימות דופן התא. היכולת של קירות התא לעבור חומצה הנגרמת הארכה אינה רק תוצאה של הסדר המבני של קיר סוכרים תא (פקטינים למשל), אבל תלוי בפעילות של expansins ^5. Expansins אין שום הפעילות האנזימטית ידוע שהדרך היחידה assay לפעילות expansin היא למדוד גיוסם של הרחבה דופן התא. דו"ח זה מפרט את מקורות וידאו וטכניקות הכנה לקבלת חומרים קיר מתאים מבחני expansin וממשיך להראות חומצה הנגרמת הארכה expansin-Induced הרחבה של דגימות קיר שהוכן hypocotyls מלפפון גדל.

כדי להשיג מתאים הקיר דגימות תאים, שתילי מלפפונים גדלים בחושך, hypocotyls נחתכים קפואים ב -80 ° C. Hypocotyls קפואים הם משופשפות, שטוח, והידק אז המתח המתמיד קובט מיוחד עבור מדידות extensometer. כדי למדוד חומצה הנגרמת הרחבה, הקירות שנאגרו בתחילה ב-pH נייטרלי, וכתוצאה מכך פעילות נמוכה של expansins כי הם מרכיבי דופן התא הילידים. עם חילופי חיץ pH חומצי, expansins מופעלים ואת קירות התא להרחיב במהירות. אנחנו גם מדגימים פעילות expansin ב assay הכינון מחדש. עבור חלק זה, אנו משתמשים טיפול בחום קצר לפגל expansins יליד בדגימות דופן התא. אלה קירות התא מומת לא להאריך גם חיץ חומציים, אך תוספת של expansins את קירות התא במהירות משחזר את יכולתם להאריך.

Protocol

חלק 1: גידול ואחסון חומר צמחי מתאים

1. מניסיוננו, hypocotyls צעירים שתילי מלפפון מולבן לשמש מקור נוח של החומר דופן התא עבור ניסויים אלו. זרעי מלפפון נזרעים על נייר רטוב בתיבה אור הוכחה, שהוא לשמור בארון חשוך בחדר טמפרטורה קבועה נקבע על 26 ° C. הטמפרטורה המדויקת אינה קריטית, כמו כל דבר בין 22 ° לבין 30 ° C אמור להיות בסדר, אבל הטמפרטורה תקבע כמה מהר השתילים מגיעים בשלב המתאים של התפתחות. חם הטמפרטורה, מהר יותר שתילים יפתחו. אנו משתמשים בדרך כלל השתילים כשהם גדלו על 5 ס"מ אורך, אשר הגיעו 3-4 ימים לאחר הזריעה. חשוב כי שתיל להיות מבוגר בחושך, כמו גם כמויות קטנות של אור להשפיע הן על קצב התפתחות הנבט לבין הקיר תכונות התא אנו מודדים עם טכניקה זו. ביום 3 אתה יכול להציץ בתיבה, תוך שימוש באור עמום מסוננים ירוק, כדי לבדוק את התפתחות שתיל.
2. שתילים נחתכים במהירות ארוזים בקופסאות פלסטיק קטנות, 100-150 שתילים בקרטון, ומאוחסנים ב -80 ° C. בטמפרטורה זו הם נשארים שימושי שבועות.

חלק 2: הכנת קיר דגימות תאים

1. קבוצות קטנות (80-10) של שתילים חתך קפוא מועברים מהמקפיא למיכל מבודד המכיל לחסום במקפיא -80.
2. לציפורן כיסוי hypocotyl היא הכתה עם carborundum. הדבר נעשה על ידי ציור hypocotyl שוב ושוב בין האגודל לאצבע המורה, אשר מצופה slurry עבה של אבקת carborundum רטוב. זה לוקח קצת ניסיון כדי לדעת את הסכום הנכון של הלחץ להשתמש: לחץ יותר מדי שכבת אפידרמיס מתחיל להיות גרוסים וקרוע, גם הלחץ קצת את הקוטיקולה לא יהיה permeabilized. אחת גם צריך לעבוד מהר, כי כמו מפשיר hypocotyl קפוא, הוא הופך להיות רפוי, וקשה לנהל.
3. Hypocotyl הכתה הוא טבול במי קרח כדי להסיר את רוב carborundum דבקות ואז מאוחסן על מי קרח בעוד hypocotyls הנותרים מוכנים בצורה דומה.
4. Hypocotyls הם לחתוך לאורך הרצוי, בדרך כלל 1.2 ס"מ, עם סכין גילוח הסינגל החדש קצוות, ואז התאימה בשקופית זכוכית.
5. עכשיו אנחנו צריכים לשטח את הקירות כדי להסיר מוהל התא כדי להקל clamping. שקופיות הזכוכית השני הוא מונח על גבי קבוצה של 8-10 דגימות, ויוצרים כריך. משקל (400-500 גרם) ממוקם על גבי שקופיות הזכוכית דקות 5. עבור משקל אנו משתמשים באופן שגרתי וכוס המכילה כמות מתאימה של מים.
6. שלב אופציונלי: בהתאם הניסוי, hypocotyls עשוי להיות מובטל עם טיפול חום קצר בשלב זה. לשם כך אנו נקשרים שקופיות הזכוכית יחד עם זוג גומיות, לשים את הרכבה במיכל עם 100 מ"ל מים דה מיוננים בטמפרטורת החדר ולשים אותו במיקרוגל בעוצמה מלאה. עם מיקרוגל שלנו המים מתחיל לרתוח כ 50 שניות ואנחנו לעצור את מיקרוגל 15 s אחרי הרתיחה מתחיל. המים החמים זרמו במהירות את והחליפו עם מים קרים כדי לעצור denaturation. ייתכן שיהיה צורך להשתנות אלה תזמונים, כמו מיקרוגל שלך עשוי להיות שונה משלנו. עם חימום יתר הדגימות נעשים חלשים להישבר בקלות. עם חימום מספיק expansin אנדוגני אינו מומת לבין דגימות קיר לשמור כמה ההיענות pH חומצי.

חלק 3: הגדרת Extensometer

1. דגימות הקיר הם הידק עכשיו extensometer כוח קבוע. זהו מכשיר שהותקן שמורכבת קובט פרספקס להחזקת סוף הבסיס של המדגם קיר מלחציים ניד המצורפת בסוף apical של המדגם. מהדק ניד הוא רכוב על קצה מוט שעובר דרך הסלילים פתוח של חיישן מיקום, LVDT או "לינארי דיפרנציאלי משתנה Transformer", כי אלקטרונית מזהה את המיקום של גליל מתכת קטן, או "הליבה", כלומר מחוברת למוט. הקצה העליון של המוט קשורה מנוף עם משקל נגד מתכווננת. מנוף זה מפעיל סכום מתכווננת של כוח כלפי מעלה על מדגם הקיר. הכוח מותאם ידי הוספה או הסרה משקולות מתכת מכויל בקצה הרחוק של הידית.
2. חזרה מדגם הקיר - בסופו של דבר הבסיס של המדגם hypocotyl הוא הרים עם מלקחיים בסדר ~ 2-3 מ"מ של סוף apical ממוקם בין הלסתות פתוח של מהדק ניד. מהדק זו מהדק קפיץ מתכת לסתות תנין אשר הם מצופים פלסטיק כדי למנוע מגע ישיר בין משטח המתכת הפתרון חיץ או מדגם הקיר. ב מתכת הניסיון שלנו יונים ליץ מ מהדק יכול ומעכבות את היכולת של קיר להאריך, ולכן אנחנו ממשיכים המתכת מכוסה.
3. החזקת הרכבה מהדק ניד ביד אחת, בסופו של דבר הבסיס של הדגימה הקיר הוא תמרן כעת בין שתי חתיכות צירים של קובט הפרספקס קובטהחלקים הם הביאו יחד קמוץ, ובכך לנעול את קצה התחתון של המדגם קיר קובט.
4. האסיפה מהדק ניד עכשיו שוחרר בעדינות, המאפשר את מלוא עוצמתה של הנגד שיועברו הדגימה הקיר. אנו משתמשים באופן שגרתי משקל נגד סך של 20 גרם של דגימות קיר שהוכן hypocotyls מלפפון. קיר או חומרים אחרים עשויים לחייב ניסויים במשקלים שונים.
5. קובט מתמלא חיץ (200 UL) ואת המיקום של קובט עברה למעלה או למטה עם בורג התאמה, כך מהדק ניד מובא לקצה התחתון של טווח המדידה LVDT. LVDT שלנו מחוברת יחידת רכישת נתונים של המיקרו, ולכן אנו עוקבים אחר בעמדה LVDT דרך המחשב. יש לנו שמונה מכלולים LVDT מחוברים במקביל עם מחשב אחד, דבר המאפשר לנו לרוץ 8 דגימות הקיר בו זמנית. המחשב רושם את המיקום של כל אחד אסיפות LVDT פעם 30 s.

חלק 4: תגובה הארכה כדי מדידת pH חומצי או expansin - תוצאות נציג

1. [הניסוי הראשון] עבור המדידה של הרחבה חומצה הנגרמת, אנחנו מתחילים עם דגימות קיר יליד (כלומר, לא מובטל בחום) ו חיץ נייטרלי מתווסף קובט. דגימות קיר להאריך במשך כמה דקות, בתגובה למתח נוסף, אך דועך הרחבה בשיעור נמוך אחרי כמה דקות. המחשב שלנו מאפשר לנו לפקח גם את השינוי באורך של המדגם (כלומר, את השינוי בעמדה של מהדק ניד, לאחר תחילת הניסוי) או שאנחנו יכולים לפקח על נגזרת של מיקום זמן, או במילים אחרות את שיעור הארכה . שיעור הארכה מייצב לערך נמוך עם הזמן.
2. לאחר 20 דקות ~, למאגר נייטרלי מוסר. אנחנו משתמשים בצינור מתכת דקה, עשוי מחט מד גדול המזרק, מחובר משאבת ואקום כדי להסיר את החיץ במהירות, עם הפרעה מינימלית של הקיר או הרכבה מכנית. חיץ חומציים הוא הוסיף אז, לפעמים עם 1-2 מהיר כדי להבטיח חילופי החליפין להשלים למאגר חומצי. אז לשבת בחיבוק ידיים ולראות את התגובה של הקיר. בדרך כלל אנחנו יכולים לזהות את קצב מהיר יותר של הרחבה תוך כמה דקות. אחרי 60 דקות בדרך כלל יש לנו מספיק מידע כדי להעריך את התגובה הרחבה, אך במקרים מסוימים המדידות עשוי להאריך את תקופות ארוכות יותר.
3. [ניסוי השנייה] עבור המדידה של הרחבה expansin-Induced דופן התא, אנחנו מתחילים עם חום מומת דגימות קיר חוצץ חומצי מתווסף קובט. כמו בניסוי הראשון, שיעור הארכה דופן התא בהדרגה מייצב לערך נמוך בגלל היעדר expansin תפקודית.
4. לאחר 20 דקות ~, חלבון expansin מתווסף קובט על ידי 'spiking "עם למאגר ב קובט עם UL 10-20 של פתרון expansin. Expansin במהירות חודר מדגם דופן התא ותוך כמה דקות אנו רואים כי שיעור הארכה גדל. תגובה זו יכולה להיות הרחבה במעקב במשך שעה או יותר.

איור 1: מתאר נהלים להכנת קירות התא כדי להעריך חומצה הנגרמת או expansin-Induced הארכת הקיר.

Discussion

להדגמה זו השתמשנו קירות התא מן hypocotyls מלפפון כי הם הוכיחו להיות מקור אמין של דגימות הקיר כי הם קל לטפל כי להגיב ברגישות טוב. יש לנו גם הצלחה טובים עם קירות שתילים אחרים, כמו גם כמה חומרים מהסופרמרקט, כמו עלי תרד צעירים גבעולי סלרי. בעיקרון, צעיר, רך, רקמות הצמח גדל במהירות צפויות להימדד בקלות עם טכניקה זו, אבל קשוח, זקן, רקמות הצמח מחומצן או nongrowing צפויים להיות קשוב בגלל תא הקיר לחצות קישור. ישנם עוד כמה דברים להיזהר:

1. השוני הביולוגי - אפילו שתילים אחיד לתת תשובות משתנה, כך מינימום של 5-8 משכפל יש צורך להניב תוצאות משמעותיות מבחינה סטטיסטית.
2. שחיקה של לציפורן חשוב לאפשר חדירה מהירה של מאגרי וחלבונים לתוך הדגימה את דופן התא. אם לציפורן לא משופשפות מספיק, התגובות מאגרים חומצי יהיה איטי מושתק וחלבונים לא יכול אפילו לחדור לציפורן כדי לעורר תגובה. כמה דוגמאות אולי לא צריך, כלומר שחיקה אם אתה משתמש קליפות אפידרמיס גזור או רקמות אחרות. שחיקה אחידה מוסיף השתנות משמעותית יותר עבור משתמשים חדשים רבים.
3. איון חום, אשר משמש כדי להסיר או לפגל expansins אנדוגני, יכול להתבצע על ידי שיטות אחרות, אבל אחד צריך למצוא את כמות מזערית של חימום כדי להשבית expansin אנדוגני כדי למנוע שבירה והיחלשות מופרזת של דגימות הקיר.
4. Expansins נוטים איון על ידי חמצון, כך dithiothreitol 1-5 מ"מ למאגר בדרך כלל עוזר לייצב את הפעילות.
5. Extensometer אינו פיסת-off-המדף של ציוד, אך דורשת בנייה אישית של קובט (א) המחזיקה את הדגימה קיר (ב) האסיפה LVDT-clamp-כמשקל נגד. ממשק מחשב רכישת יחידת הנתונים אינם הכרחיים, אך הם בעלי ערך במיוחד עבור רץ דגימות לשכפל בו זמנית לניתוח העקומות הרחבה כמותית.