Het meten van Plant Cell muur Extension (Creep) geïnduceerd door zure pH en door Alpha-Expansin

Summary

We demonstreren het gebruik van een constante kracht extensometer op lange termijn uitbreiding (kruip) van plantaardige celwand exemplaren veroorzaakt door zure buffers en expansin eiwitten te meten.

Abstract

Groeiende plant celwanden karakteristiek vertonen een eigenschap bekend als 'zuur groei', waarmee we bedoelen ze meer uitbreidbaar bij lage pH (<5) ^1. Het plantenhormoon auxine stimuleert snel celelongatie in jonge stengels en dergelijke weefsels ten minste gedeeltelijk door een zuur-groei-mechanisme ^{2, 3.} Auxine activeert een H ⁺ pomp in het plasmamembraan, waardoor verzuring van de celwand oplossing. Wand verzuring activeert expansins, die endogene celwand-losmaken eiwitten ^4, waardoor de celwand te geven aan de muur spanningen gecreëerd door cel turgor druk. Als gevolg hiervan, de cel snel begint te vergroten. Deze 'zuur groei' fenomeen is gemakkelijk gemeten in geïsoleerde (niet-levende) celwand exemplaren. Het vermogen van celwanden te zuur-geïnduceerde uitbreiding ondergaan, is niet simpelweg het gevolg van de structurele regeling van de celwand polysacchariden (bijvoorbeeld pectine), maar hangt af van de activiteit van expansins ^5. Expansins hebben geen bekend enzymatische activiteit en de enige manier om test voor expansin activiteit bestaat uit het meten hun inductie van celwand extensie. Deze video rapport beschrijft de bronnen en de voorbereiding van technieken voor het verkrijgen van geschikte materialen voor wand-expansin assays en gaat verder om aan te tonen zuur-geïnduceerde uitbreiding en expansin-geïnduceerde verlenging van de muur monsters bereid uit groeiende komkommer hypocotylen.

Voor het verkrijgen van geschikte celwand monsters, komkommer zaailingen worden geteeld in het donker, de hypocotylen worden gesneden en ingevroren bij -80 ° C. Frozen hypocotylen zijn afgesleten, afgeplat, en vervolgens geklemd bij een constante spanning in een speciale cuvet voor extensometer metingen. Voor het meten van zuur-geïnduceerde uitbreiding, zijn de muren in eerste instantie gebufferd bij een neutrale pH, wat resulteert in lage activiteit van expansins die zijn componenten van de inheemse celwanden. Bij buffer te wisselen om zure pH, zijn expansins geactiveerd en de celwanden te breiden snel. We hebben ook laten zien expansin activiteit in een reconstitutie test. Voor dit gedeelte maken we gebruik van een korte warmtebehandeling om de inheemse expansins in de celwand monsters denatureren. Deze geïnactiveerd celwanden zelfs niet uit te breiden in zure buffer, maar de toevoeging van expansins om de celwanden snel herstelt hun vermogen om uit te breiden.

Protocol

Deel 1: Groeien en opslaan van geschikt plantmateriaal

1. In onze ervaring, jonge hypocotylen uit geëtioleerde komkommer zaailingen dienen als een handige bron van de celwand materiaal voor deze experimenten. Komkommer zaden worden gezaaid op nat papier in een lichtdichte doos, die in een donkere kast te houden in een constante temperatuur ruimte ingesteld op 26 ° C. De exacte temperatuur is niet kritisch, als iets tussen 22 ° en 30 ° C moet fijn, maar de temperatuur zal bepalen hoe snel de zaailingen een juiste fase van ontwikkeling te bereiken. Hoe warmer de temperatuur, hoe sneller de zaailingen zich zal ontwikkelen. Wij gebruiken meestal de zaailingen als ze zijn gegroeid tot ongeveer 5 cm in lengte, die 3-4 dagen wordt bereikt na het zaaien. Het is belangrijk dat de zaailing worden gekweekt in het donker, als zelfs kleine hoeveelheden licht invloed hebben op zowel het tempo van de zaailing ontwikkeling en de celwand eigenschappen die we meten met deze techniek. Op dag 3 kunt u kijken in de doos, met behulp van een zwak groen gefilterd licht, om te controleren op zaailing ontwikkeling.
2. Zaailingen worden snel gesneden en verpakt in kleine plastic doosjes, 100-150 zaailingen per doos, en opgeslagen bij -80 ° C. Bij deze temperatuur blijven ze nuttig voor weken.

Deel 2: Voorbereiding celwand monsters

1. Kleine groepen (8-10) van bevroren gesneden zaailingen worden overgedragen van de vriezer tot een geïsoleerde container met daarin een -80 vriezer blok.
2. De nagelriem die de hypocotyl is afgesleten met carborundum. Dit gebeurt door herhaaldelijk het trekken van de hypocotyl tussen duim en wijsvinger, die zijn bekleed met een dikke brij van nat carborundum poeder. Het duurt een beetje ervaring te weten wat de juiste hoeveelheid druk om te gebruiken: te veel druk en de epidermale laag begint te worden versnipperd en gescheurd; te weinig druk en de cuticula worden niet gepermeabiliseerde. Men moet ook snel werken, want als het bevroren hypocotyl ontdooit, wordt het slap en moeilijk te beheren.
3. De geschaafde hypocotyl is gedoopt in ijswater om de meeste van de deelnemende carborundum en vervolgens opgeslagen op ijs water te verwijderen, terwijl de resterende hypocotylen worden voorbereid op een vergelijkbare manier.
4. De hypocotylen worden gesneden op de gewenste lengte, meestal 1,2 cm, met een nieuwe single scherpe scheermes en vervolgens uitgelijnd op een glasplaatje.
5. Nu moeten we de muren plat naar cel sap te verwijderen en te vergemakkelijken klemmen. Een tweede glasplaatje is bovenaan geplaatst van de groep van 8-10 monsters, de vorming van een sandwich. Een gewicht (400-500 g) wordt geplaatst op de top van het glas glijbaan voor 5 minuten. Voor het gewicht hebben we routinematig gebruik van een bekerglas met een geschikte hoeveelheid water.
6. Optionele stap: Afhankelijk van het experiment, de hypocotylen kan worden geïnactiveerd met een korte warmtebehandeling op dit punt. Om dit te doen we binden de glazen dia's, samen met een paar elastiekjes, zet de montage in een container met 100 ml gedeïoniseerd water op kamertemperatuur en plaats deze in een magnetron op vol vermogen. Met onze magnetron het water begint te koken bij ongeveer 50 s en stoppen we de magnetron 15 s na het koken begint. Het warme water is snel afgegoten en vervangen door koud water om denaturatie te stoppen. Het kan zijn dat deze timings variëren, als je magnetron kan anders zijn dan de onze. Met overmatige verhitting van de monsters worden zwak en breken gemakkelijk. Met onvoldoende verwarmen van de endogene expansin is niet geïnactiveerd en de muur monsters nog enige respons op zure pH.

Deel 3: extensometer setup

1. De muur monsters zijn nu vastgeklemd in een constante kracht extensometer. Dit is een custom-built apparaat dat van een plexiglas kuvet bestaat voor het houden van de basale einde van de muur monster en een beweegbare klem aan de apicale uiteinde van het monster. De beweegbare klem is gemonteerd op het uiteinde van een staaf die door het open spoelen van een positie sensor, een LVDT of 'Linear Variable Differential Transformer', die elektronisch detecteert de positie van een kleine metalen cilinder of 'core', dat wil aan de stang. Het bovenste uiteinde van de stang is gekoppeld aan een hefboom met een verstelbaar tegengewicht. Deze hendel oefent een instelbare hoeveelheid opwaartse kracht op de muur monster. De kracht wordt aangepast door het toevoegen of verwijderen geijkte metalen gewichtjes om het verre uiteinde van de hendel.
2. Terug naar de muur monster - de basale einde van de hypocotyl monster is opgepakt met een fijne pincet en ~ 2-3 mm van het apicale einde is geplaatst tussen de open kaken van de beweegbare klem. Deze klem is een veer alligator klem, waarvan het metalen kaken zijn bedekt met plastic om te voorkomen dat direct contact tussen het metalen oppervlak en de bufferoplossing of de muur monster. In onze ervaring metaalionen kunnen lekken uit de klem en remmen de muur van het vermogen uit te breiden, en zo houden we het metaal bedekt.
3. Houd de beweegbare klem montage in een hand, is de basale einde van de muur monster nu gemanoeuvreerd tussen de twee scharnierende stukken van de plexiglas cuvette en de cuvettestukken zijn bij elkaar gebracht en strak geschroefd, waardoor het blokkeren van de onderkant van de muur monster in het kuvet.
4. De beweegbare klem montage is nu langzaam verdwijnt, waardoor de volle kracht van de contragewichten over te dragen aan de muur monster. We routinematig gebruik van een contragewicht in totaal van 20 g voor wand-monsters bereid uit komkommer hypocotylen. Andere muur materialen of experimenten zou kunnen vereisen verschillende gewichten.
5. De cuvet wordt gevuld met buffer (200 uL) en de positie van de cuvet ging omhoog of omlaag met een stelschroef, zodat de beweegbare klem wordt gebracht aan de onderkant van de LVDT meetbereik. Onze LVDT is verbonden met een data-acquisitie eenheid van een microcomputer, dus we controleren LVDT positie door de computer. We hebben acht LVDT vergaderingen parallel met een computer, die ons in staat stelt om gelijktijdig acht muur monsters. De computer registreert de positie van elk van de LVDT vergaderingen eenmaal per 30 s.

Deel 4: Het meten van de uitbreiding naar aanleiding van zure pH of expansin - representatieve resultaten

1. [Eerste experiment] Voor het meten van zuur-geïnduceerde uitbreiding, beginnen we met native muur monsters (dat wil zeggen, niet geïnactiveerd met warmte) en neutrale buffer wordt toegevoegd aan de cuvet. De muur monsters te verlengen voor een paar minuten, in reactie op de toegevoegde spanning, maar de uitbreiding vervalt tot een laag tarief na een paar minuten. Onze computer laat ons bewaken de verandering in de lengte van het monster (dat wil zeggen de verandering in de positie van de beweegbare klem, na de start van het experiment), of we kunnen de tijd afgeleide van positie te controleren, met andere woorden: het tempo van de uitbreiding . De uitbreiding tarief stabiliseert op een lage waarde met de tijd.
2. Na ~ 20 min, is de neutrale buffer verwijderd. We maken gebruik van een dunne metalen pijp, gemaakt van een grote gauge injectienaald, aangesloten op een vacuümpomp aan de buffer snel te verwijderen, met een minimale verstoring van de muur of de mechanische montage. Zure buffer wordt vervolgens toegevoegd, soms met 1-2 snelle uitwisseling om de volledige uitwisseling zure buffer te verzekeren. Dan gaan we achterover leunen en kijken naar de reactie van de muur. Normaal gesproken kunnen we ontdekken hoe sneller tempo van de uitbreiding in een paar minuten. Na 60 minuten hebben we meestal genoeg informatie om de uitbreiding respons te beoordelen, hoewel in sommige gevallen de metingen kan zich uitstrekken tot langere periodes.
3. [Tweede experiment] Voor het meten van expansin-geïnduceerde celwand extensie, beginnen we met hitte-geïnactiveerd muur monsters en zure buffer wordt toegevoegd aan de cuvet. Net als in het eerste experiment, het tempo van de celwand uitbreiding stabiliseert geleidelijk tot een lage waarde vanwege het ontbreken van functionele expansin.
4. Na ~ 20 min, wordt expansin eiwit toegevoegd aan de cuvet door 'spijkeren' met de buffer in het kuvet met 10-20 uL van een expansin oplossing. De expansin dringt snel de celwand monster en binnen een paar minuten zien we dat de uitbreiding is gestegen. Deze uitbreiding reactie kan gevolgd worden voor een uur of meer.

Figuur 1: Overzicht van de procedures voor het bereiden van celwanden te zuur-geïnduceerde of expansin-geïnduceerde muur extensie te beoordelen.

Discussion

Voor deze demonstratie hebben we celwanden gebruikt van komkommer hypocotylen, omdat ze hebben bewezen een betrouwbare bron van wand-monsters die zijn gemakkelijk te hanteren en die reageren met een goede gevoeligheid. We hebben ook een goede succes met muren van andere zaailingen evenals sommige materialen uit de supermarkt, zoals jonge spinazie bladeren en stengels bleekselderij. Kortom, jong, zacht, snel groeiende plant weefsels die waarschijnlijk gemakkelijk gemeten worden met deze techniek, maar taaie, oude, geoxideerd of nongrowing plantenweefsels waarschijnlijk reageren vanwege de celwand verknoping. Er zijn een paar andere dingen oppassen:

1. Biologische variabiliteit - zelfs uniform zaailingen geven variabele reacties, dus een minimum van 5-8 herhalingen nodig is om statistisch zinvolle resultaten opleveren.
2. Slijtage van de cuticula is belangrijk om vergunning snelle penetratie van buffers en eiwitten in de celwand monster. Als de cuticula is niet voldoende afgesleten, zullen de antwoorden op zure buffers te traag en gedempt en eiwitten kunnen niet eens doordringen in de nagelriem om een ​​reactie uit te lokken. Enkele voorbeelden misschien niet nodig schuren, dat wil zeggen als je gebruik maakt epidermale peelings of andere ontleed weefsels. Niet-uniforme slijtage voegt aanzienlijke variabiliteit voor veel beginners.
3. Warmte-inactivatie, die wordt gebruikt te verwijderen of te denatureren endogene expansins, kan worden uitgevoerd door andere methoden, maar moet men de minimale hoeveelheid warmte aan endogene expansin inactiveren te veel verzwakking en breuk van de muur te voorkomen monsters te vinden.
4. Expansins zijn gevoelig voor inactivatie door oxidatie, zodat 1-5 mm dithiothreitol in de buffer helpt meestal te stabiliseren activiteit.
5. De extensometer is niet een off-the-shelf stuk van de apparatuur, maar vereist maatwerk de bouw van (a) de cuvet dat de muur monster en (b) de LVDT-clamp-contragewicht montage houdt. De computer interface en data-acquisitie-eenheid zijn niet essentieel, maar zijn bijzonder waardevol voor het uitvoeren van identieke monsters gelijktijdig en voor het analyseren van de uitbreiding curves kwantitatief.