Medição Usina Extensão parede celular (Creep) induzida pelo pH ácido e por Alpha-Expansin

Summary

Nós demonstramos o uso de um extensômetro de força constante para medir a extensão de longo prazo (creep) de espécimes de plantas parede celular induzida por buffers ácidas e proteína expansin.

Abstract

Paredes celulares de plantas crescendo caracteristicamente apresentam uma propriedade conhecida como "crescimento ácido", pelo qual significa que elas são mais extensíveis em pH baixo (<5) ^1. O hormônio vegetal auxina rapidamente estimula o alongamento celular em caules jovens e tecidos semelhantes ao menos em parte por um mecanismo de crescimento ^{ácido-2, 3.} Auxina ativa uma bomba H ⁺ na membrana plasmática, causando a acidificação da solução da parede celular. Acidificação da parede ativa expansins, que são endógenas afrouxamento da parede ^celular-4 proteínas, fazendo com que a parede celular para produzir as tensões de parede criado por pressão de turgor celular. Como resultado, a célula começa a aumentar rapidamente. Esse fenômeno de crescimento ácido "é facilmente medido em isolada (não vivas) espécimes da parede celular. A capacidade das paredes das células se submeter induzida por ácido extensão não é simplesmente o resultado do arranjo estrutural dos polissacarídeos da parede celular (pectinas, por exemplo), mas depende da atividade de expansins ^5. Expansins não têm qualquer atividade enzimática e conhecida a única forma de ensaio para a atividade expansin é medir sua indução da extensão da parede celular. Este relatório detalha o video fontes e técnicas de preparação para a obtenção de materiais de parede adequado para ensaios expansin e passa a mostrar induzida por ácido extensão e expansin induzida extensão da parede amostras preparadas a partir de hipocótilos de pepino crescimento.

Para obter amostras de células da parede adequados, mudas de pepino são cultivados no escuro, o hipocótilo são cortadas e congeladas a -80 ° C. Hipocótilo congelados são desgastados, achatados, e depois preso na tensão constante em uma tina especial para medições extensômetro. Para medir induzida por ácido de extensão, as paredes são inicialmente tamponada em pH neutro, resultando em baixa atividade de expansins que são componentes das paredes das células nativas. Após a troca de buffer para pH ácido, expansins são ativados e as paredes celulares estender rapidamente. Nós também demonstram atividade expansin em um ensaio de reconstituição. Para esta parte, nós usamos um tratamento térmico breve a desnaturar a expansins nativas nas amostras de parede celular. Estas paredes das células inativadas não se estendem até mesmo em tampão ácido, mas além de expansins para as paredes das células rapidamente restaura a sua capacidade de estender.

Protocol

Parte 1: Crescendo e armazenamento de material vegetal adequado

1. Em nossa experiência, hipocótilo jovens de mudas de pepino estiolados servir como uma fonte conveniente de material da parede celular para estas experiências. Sementes de pepino são semeadas em papel molhado em uma caixa à prova de luz, que é manter-se em um armário em uma sala escura temperatura constante fixada em 26 ° C. A temperatura exata não é crítica, como qualquer coisa entre 22 ° e 30 ° C deve ser fino, mas a temperatura vai determinar o quão rápido as mudas atingem um grau adequado de desenvolvimento. A temperatura mais quente, mais rápido as mudas irão se desenvolver. Normalmente usamos mudas quando eles têm crescido para cerca de 5 cm de comprimento, que é alcançado 3-4 dias após a semeadura. É importante que a muda ser cultivada no escuro, já que mesmo pequenas quantidades de luz afetam tanto a taxa de desenvolvimento de plântulas e as propriedades da parede celular que medimos com esta técnica. No dia 3, você pode espreitar na caixa, usando uma luz verde dim filtrada, para verificar o desenvolvimento das plântulas.
2. Mudas são rapidamente cortado e embalado em pequenas caixas de plástico, 100-150 mudas por caixa, e armazenadas a -80 ° C. A esta temperatura que permanecem úteis por semanas.

Parte 2: As amostras de parede celular Preparando

1. Pequenos grupos (8-10) de mudas de corte congelados são transferidos do freezer a um recipiente isolado contendo um bloco freezer -80.
2. A cutícula que cobre o hipocótilo é abrasiva com carborundum. Isso é feito por várias vezes o desenho hipocótilo entre o polegar eo indicador, que são revestidos com uma pasta espessa de pó de carborundum molhado. Leva um pouco de experiência para saber a quantidade correta de pressão para o uso: muita pressão e da camada epidérmica começa a ser desfiado e rasgado; muito pouca pressão ea cutícula não será permeabilizadas. A pessoa também tem que trabalhar rápido, pois como o degelo congelados hipocótilo, torna-se flácido e difícil de gerenciar.
3. O hipocótilo abraded é mergulhado em água gelada para remover a maior parte do carborundum aderir e depois armazenados em água com gelo, enquanto o hipocótilo restantes são preparadas de uma forma similar.
4. O hipocótilo são cortadas no comprimento desejado, geralmente 1,2 centímetros, com uma lâmina de barbear novo single gumes e, em seguida, alinhados em uma lâmina de vidro.
5. Agora precisamos de achatar as paredes para remover seiva celular e para facilitar a fixação. A segunda lâmina de vidro é colocado em cima do grupo de 8-10 amostras, formando um sanduíche. Um peso (400-500 g) é colocado em cima da lâmina de vidro por 5 min. Para o peso que usam rotineiramente um copo contendo uma quantidade adequada de água.
6. Etapa opcional: Dependendo do experimento, o hipocótilo pode ser inactivado com um tratamento térmico breve a este ponto. Para fazer isso, vincular a lâminas de vidro, juntamente com um par de faixas de borracha, coloque o conjunto em um recipiente com 100 mL de água desionizada à temperatura ambiente e colocá-lo em um forno de microondas na potência máxima. Com o nosso forno de microondas a água começa a ferver em cerca de 50 s e paramos no microondas 15 s após a ebulição começa. A água quente é derramada rapidamente fora e substituída por água fria para parar a desnaturação. Você pode ter de variar esses horários, como seu micro pode ser diferente da nossa. Com o aquecimento excessivo das amostras tornam-se fracos e quebram com facilidade. Com o aquecimento insuficiente expansin endógena não é inativada e as amostras de parede manter alguma capacidade de resposta ao pH ácido.

Parte 3: setup Extensômetro

1. As amostras de parede são agora fixada em um extensômetro força constante. Este é um dispositivo feito sob medida, que consiste de uma cuba de acrílico para a realização da final da amostra basal de parede e uma braçadeira móvel unida à extremidade apical da amostra. O grampo móvel é montado na extremidade de uma haste que passa através das bobinas aberto de um sensor de posição, um LVDT ou "Linear Variable Differential Transformer ', que eletronicamente detecta a posição de um pequeno cilindro de metal, ou' core ', que é anexado à haste. A extremidade superior da haste é ligada a uma alavanca com um contrapeso ajustável. Esta alavanca exerce um valor ajustável de força para cima sobre a amostra parede. A força é ajustado pela adição ou remoção de pesos de metal calibrada até o final da alavanca.
2. Voltar para a amostra de parede - o fim basal da amostra hipocótilo é pego com uma pinça fina e ~ 2-3 mm da extremidade apical é colocado entre as mandíbulas abertas do grampo móvel. Este grampo é um grampo jacaré de mola de metal cujas mandíbulas são revestidas com plástico para evitar o contato direto entre a superfície do metal ea solução-tampão ou a amostra parede. Em nossa experiência de íons metálicos pode lixiviar do grampo e inibir a capacidade da parede para estender, e assim mantemos o metal coberto.
3. Segurando o conjunto de grampo móvel em uma mão, o fim basal da amostra parede agora é manobrado entre as duas peças articuladas na célula, Plexiglas e cuvetepeças são reunidas e aparafusadas, garantindo com isso a extremidade inferior da amostra parede na tina.
4. O conjunto de grampo móvel é agora lançado suavemente, permitindo que a força total do contrapesos para ser transferido para a amostra parede. Rotineiramente usamos um contrapeso total de 20 g para as amostras de parede preparados a partir de hipocótilos de pepino. Materiais da parede ou outros experimentos podem requerer diferentes pesos.
5. A cuvete é preenchido com tampão (200 uL) ea posição da cubeta movido para cima ou para baixo com um parafuso de ajuste, de modo que o grampo móvel é levada ao extremo inferior da faixa de medição LVDT. Nosso LVDT é conectado a uma unidade de aquisição de dados de um microcomputador, e por isso monitorar a posição LVDT através do computador. Temos oito assembléias LVDT ligado em paralelo com um computador, o que nos permite executar oito amostras de parede simultaneamente. O computador registra a posição de cada um dos conjuntos LVDT uma vez a cada 30 s.

Parte 4: Medição de extensão resposta ao pH ácido ou expansin - Resultados Representante

1. [Primeira experiência] Para a medição de ácido induzida por extensão, nós começamos com amostras de parede nativa (isto é, não inativado pelo calor) e tampão neutro é adicionado à cubeta. As amostras de parede se estendem por alguns minutos, em resposta à tensão adicionado, mas o decai extensão para uma baixa taxa depois de alguns minutos. Nosso computador nos permite monitorar a variação no comprimento da amostra (isto é, a mudança de posição do grampo móvel, após o início do experimento) ou podemos monitorar a derivada temporal da posição, em outras palavras, a taxa de extensão . A taxa de extensão estabiliza a um baixo valor com o tempo.
2. Depois de ~ 20 minutos, o tampão neutro é removido. Nós usamos um tubo de metal fino, feito de uma agulha hipodérmica calibre grande, conectado a uma bomba de vácuo para remover o tampão rapidamente, com o mínimo de perturbação da parede ou a montagem mecânica. Tampão ácida é então adicionada, às vezes com 1-2 trocas rápidas para garantir a troca completa de tampão ácido. Então sentar e ver a resposta da parede. Tipicamente, podemos detectar a taxa mais rápida de extensão em poucos minutos. Após 60 min geralmente temos informações suficientes para avaliar a resposta de extensão, embora em alguns casos, as medições pode se estender para períodos mais longos.
3. [Segundo experimento] Para a medição de expansin induzida extensão da parede celular, começamos com amostras inativado pelo calor parede e tampão ácido é adicionado à cubeta. Como no primeiro experimento, a taxa de extensão da parede celular estabiliza gradualmente para um valor baixo por causa da falta de expansin funcional.
4. Depois de ~ 20 minutos, proteína expansin é adicionado à cubeta por 'spiking' com o buffer na cuvete com 10-20 uL de uma solução expansin. O expansin penetra rapidamente a amostra da parede celular e em poucos minutos, vemos que a taxa de extensão aumentou. Esta resposta de extensão pode ser seguido por uma hora ou mais.

Figura 1: Esquema de procedimentos para a preparação de paredes celulares para avaliar induzida por ácido ou expansin induzida extensão da parede.

Discussion

Para esta demonstração foram utilizados paredes celulares de hipocótilo do pepino porque eles provaram ser uma fonte confiável de amostras de parede que são fáceis de manusear e que respondem com boa sensibilidade. Nós também tivemos um bom sucesso com paredes de mudas de outras, bem como alguns materiais do supermercado, tais como folhas de espinafre jovens e talos de aipo. Basicamente, o jovem, macio, tecidos vegetais de rápido crescimento tendem a ser facilmente medido com esta técnica, mas resistente, velho, tecidos vegetais oxidados ou nongrowing não são susceptíveis de ser sensível por causa da parede celular reticulação. Há algumas outras coisas para ter cuidado com:

1. Variabilidade biológica - mesmo mudas uniformes dar respostas variável, por isso um mínimo de 5-8 repetições é necessária para produzir resultados estatisticamente significativos.
2. Abrasão da cutícula é importante para permitir a rápida penetração dos buffers e proteínas em amostra da parede celular. Se a cutícula não é suficientemente desgastada, respostas às buffers ácida será lenta e sem som e proteínas não pode mesmo penetrar na cutícula para obter uma resposta. Algumas amostras podem não precisar ou seja, à abrasão, se você usar peelings epidérmicos ou outros tecidos dissecados. Abrasão não uniforme acrescenta variabilidade significativa para muitos iniciantes.
3. Inativação de calor, que é usado para remover ou desnaturar expansins endógena, podem ser realizadas por outros métodos, mas um precisa encontrar a quantidade mínima de aquecimento para inativar expansin endógenos para evitar o enfraquecimento excessivo e quebra das amostras de parede.
4. Expansins está propenso a inativação por oxidação, de modo ditiotreitol mM 1-5 no buffer normalmente ajuda a estabilizar a atividade.
5. O extensômetro não é uma peça-the-shelf off de equipamentos, mas requer a construção personalizada do (a) cuvete o que mantém o modelo de parede e (b) a assembléia LVDT-clamp contrapeso. A interface do computador e unidade de aquisição de dados não são essenciais, mas são particularmente valiosos para a execução de amostras idênticas, ao mesmo tempo e para analisar as curvas de extensão quantitativa.