Mesure Extension mur cellulaire végétale (Creep) induite par un pH acide et par Alpha-expansine

Summary

Nous démontrons l'utilisation d'un extensomètre à force constante pour mesurer extension à long terme (fluage) de spécimens de plantes de la paroi cellulaire induite par les tampons acides et protéines expansine.

Abstract

Growing parois des cellules végétales présentent une caractéristique propriété connue comme «la croissance d'acide", par laquelle nous entendons qu'ils sont plus extensibles à pH faible (<5) ^1. L'hormone végétale auxine stimule rapidement l'élongation cellulaire dans les jeunes tiges et les tissus similaires au moins en partie par un mécanisme acide-croissance de ^{2, 3.} L'auxine active une pompe à H ⁺ dans la membrane plasmique, provoquant l'acidification de la solution de la paroi cellulaire. L'acidification Mur active expansines, qui sont endogènes relâchement de la paroi cellulaire des ^{protéines-4,} causant de la paroi cellulaire de céder à des tensions mur créé par la pression de turgescence cellulaire. En conséquence, la cellule commence à élargir rapidement. Ce phénomène de «croissance acide» est facilement mesurable dans les régions isolées (non vivantes) spécimens paroi cellulaire. La capacité des parois cellulaires de se soumettre à l'acide-induced extension n'est pas simplement le résultat de l'agencement structurel des polysaccharides des parois cellulaires (pectines, par exemple), mais dépend de l'activité des expansines ^5. Expansines n'ont aucune activité enzymatique connue et la seule façon de dosage de l'activité expansine est de mesurer leur induction de l'extension des parois cellulaires. Ce reportage vidéo détaille les sources et les techniques de préparation pour obtenir des matériaux mur approprié pour les dosages expansine et continue de montrer induite par l'acide extension et expansine induite par l'extension des échantillons préparés à partir d'hypocotyles mur de concombre en pleine croissance.

Pour obtenir des échantillons de la paroi cellulaire appropriée, des plants de concombre est cultivé dans l'obscurité, les hypocotyles sont coupés et congelés à -80 ° C. Hypocotyles congelés sont abrasées, aplati, puis serré à une tension constante dans une cuve spéciale pour les mesures extensomètre. Pour mesurer l'extension induite par l'acide, les murs sont d'abord tamponné à pH neutre, résultant en une faible activité de expansines qui sont des composants des parois cellulaires d'origine. Après échange de tampon à pH acide, expansines sont activés et les parois des cellules s'étendent rapidement. Nous démontrons également l'activité expansine dans un essai de reconstitution. Pour cette partie, nous utilisons un traitement thermique pour dénaturer les brèves expansines natif dans les échantillons de la paroi cellulaire. Ces parois cellulaires inactivés ne s'étendent pas, même en tampon acide, mais l'addition de expansines aux parois cellulaires rétablit rapidement leur capacité à étendre.

Protocol

Partie 1: La culture et le stockage du matériel végétal adapté

1. Dans notre expérience, de jeunes plants hypocotyles étiolés concombre servir une source pratique de matériau de paroi cellulaire pour ces expériences. Graines de concombre sont semées sur le papier humide dans une boîte étanche à la lumière, ce qui est de garder dans une armoire sombre dans une pièce à température constante fixée à 26 ° C. La température exacte n'est pas critique, comme quelque chose entre 22 ° et 30 ° C devrait être bon, mais la température sera de déterminer à quelle vitesse les plants atteignent un stade approprié de développement. Le réchauffement de la température, plus le semis se développeront. Nous utilisons généralement des plants quand ils ont passé à environ 5 cm de longueur, qui est atteint 3-4 jours après le semis. Il est important que la plantule être cultivés dans l'obscurité, que même de petites quantités de lumière affectent à la fois le taux de développement des semis et les propriétés paroi cellulaire que l'on mesure avec cette technique. Au jour 3, vous pouvez coup d'oeil dans la boîte, en utilisant une faible lumière verte filtrée, pour vérifier sur le développement des plantules.
2. Les plants sont rapidement coupés et emballés dans des petits boîtes en plastique, 100-150 plants par boîte, et conservés à -80 ° C. A cette température, ils restent utiles pendant des semaines.

Partie 2: Préparation des échantillons paroi cellulaire

1. De petits groupes (8-10) des plants coupés congelés sont transférés du congélateur pour un conteneur isotherme contenant un bloc de congélation -80.
2. La cuticule qui couvre l'hypocotyle est abrasé avec carborundum. Cela se fait en plusieurs reprises le dessin de l'hypocotyle entre le pouce et l'index, qui sont recouverts d'une boue épaisse de poudre de carborundum humide. Il faut un peu d'expérience pour connaître le montant exact de la pression d'utilisation: trop de pression et de la couche épidermique commence à être déchiquetés et déchirés, trop peu de pression et de la cuticule ne sera pas perméabilisées. On doit aussi travailler rapidement parce que le dégel congelé hypocotyle, il devient flasque et difficile à gérer.
3. L'hypocotyle abrasé est plongé dans l'eau glacée pour enlever la plupart du carborundum adhérant puis stockés sur l'eau glacée tout en restant les hypocotyles sont préparés d'une manière semblable.
4. Les hypocotyles sont coupées à la longueur désirée, généralement de 1,2 cm, avec une lame de rasoir nouvelles seul tranchant, puis alignés sur une lame de verre.
5. Maintenant nous avons besoin d'aplatir les murs pour enlever la sève cellulaire et de faciliter serrage. Une seconde lame de verre est placée sur le dessus du groupe de 8-10 échantillons, formant un sandwich. Un poids (400-500 g) est placé sur le dessus de la lame de verre pendant 5 min. Pour le poids nous avons l'habitude d'utiliser un bécher contenant une quantité appropriée d'eau.
6. Étape facultative: Selon l'expérience, les hypocotyles peut être inactivé par un traitement thermique brève à ce point. Pour ce faire, nous lier les lames de verre avec une paire de bandes de caoutchouc, de placer l'ensemble dans un récipient avec 100 ml d'eau déminéralisée à température ambiante et le placer dans un four à micro-ondes à pleine puissance. Avec notre four à micro-ondes de l'eau commence à bouillir à environ 50 s et nous nous arrêtons au micro-ondes 15 s après l'ébullition commence. L'eau chaude est rapidement vidé et remplacé par de l'eau froide pour arrêter la dénaturation. Vous pouvez avoir à modifier ces horaires, en tant que votre micro-ondes peut être différente de la nôtre. Avec l'échauffement excessif des échantillons deviennent faibles et se brisent facilement. Avec un chauffage insuffisant du expansine endogènes n'est pas inactivé et les échantillons mur de conserver une certaine réactivité à pH acide.

Partie 3: configuration Extensomètre

1. Les échantillons murs sont désormais bridée dans un extensomètre à force constante. Ceci est un dispositif sur mesure qui consiste d'une cuvette en plexiglas pour la tenue de l'extrémité basale de l'échantillon mur et une pince amovible fixé à l'extrémité apicale de l'échantillon. La pince mobile est monté à l'extrémité d'une tige qui traverse les bobines ouverte d'un capteur de position, un LVDT ou «transformateur différentiel», qui détecte électroniquement la position d'un cylindre métallique de petites ou «de base», qui est attachée à la tige. L'extrémité supérieure de la tige est reliée à un levier avec un contrepoids ajustable. Ce levier exerce une valeur réglable de force à la hausse sur l'échantillon mur. La force est ajustée en ajoutant ou en enlevant des poids métalliques calibrée à l'extrémité du levier.
2. Retour à l'échantillon de mur - l'extrémité basale de l'échantillon hypocotyle est ramassé avec une pince fine et ~ 2-3 mm de l'extrémité apicale est placé entre les mâchoires ouvertes de la pince mobile. Cette pince est une pince crocodile à ressort dont les mâchoires sont en métal recouvert de plastique pour empêcher tout contact direct entre la surface du métal et la solution tampon ou de l'échantillon mur. Dans notre expérience ions métalliques peuvent être lessivés de la pince et d'inhiber la capacité du mur à étendre, et si nous gardons le métal couvert.
3. En tenant l'ensemble de serrage mobiles dans une main, l'extrémité basale de l'échantillon de mur est désormais manoeuvré entre les morceaux articulée en deux de la cuvette en plexiglas et la cuvetteles pièces sont réunies et vissée, verrouillant ainsi l'extrémité inférieure de l'échantillon mur dans la cuvette.
4. L'assemblage de serrage mobile est désormais publié en douceur, permettant la pleine force de contrepoids à être transférée à l'échantillon de mur. Nous utilisons régulièrement un contrepoids total de 20 g pour les échantillons préparés à partir d'hypocotyles mur de concombre. Autres matériaux des murs ou des expériences pourraient exiger des poids différents.
5. La cuvette est remplie avec le tampon (200 uL) et la position de la cuvette vers le haut ou vers le bas avec une vis de réglage, de sorte que la pince mobile est amené à l'extrémité inférieure de la plage de mesure LVDT. Notre LVDT est connecté à une unité d'acquisition de données d'un micro-ordinateur, et si nous suivons la position LVDT à travers l'ordinateur. Nous avons huit assemblées LVDT connecté en parallèle avec un ordinateur, ce qui nous permet d'exécuter simultanément 8 échantillons mur. L'ordinateur enregistre la position de chacune des assemblées LVDT fois toutes les 30 s.

Partie 4: extension de la réponse à la mesure de pH acide ou expansine - Résultats Représentant

1. [Première expérience] Pour la mesure de l'acide-induced extension, nous commençons avec des échantillons de mur natif (qui est, non pas inactivé par la chaleur) et un tampon neutre est ajouté à la cuvette. Les échantillons mur de prolonger de quelques minutes, en réponse à la tension ajoutée, mais les désintégrations extension à un faible taux après quelques minutes. Notre ordinateur nous permet de suivre soit la variation de longueur de l'échantillon (qui est, le changement de position de la pince amovible, après le début de l'expérience) ou nous pouvons suivre la dérivée temporelle de la position, en d'autres termes le taux d'extension . Le taux d'extension se stabilise à une valeur faible avec le temps.
2. Après environ 20 minutes, le tampon neutre est supprimé. Nous utilisons un tuyau de métal mince, fabriqué à partir d'une aiguille hypodermique de gros calibre, relié à une pompe à vide pour enlever le tampon rapidement, avec une perturbation minimale de la paroi ou l'assemblage mécanique. Tampon acide est ensuite ajouté, parfois avec 1-2 échanges rapides pour assurer l'échange complet de tampon acide. Ensuite, nous s'asseoir et regarder la réponse de la paroi. Typiquement on peut détecter l'accélération du rythme de l'extension, en quelques minutes. Après 60 min nous avons habituellement suffisamment d'informations pour évaluer la réponse d'extension, bien que dans certains cas, les mesures peuvent s'étendre à de plus longues périodes.
3. [Deuxième expérience] Pour la mesure de l'extension expansine induite paroi cellulaire, nous commençons avec des échantillons de mur inactivé à la chaleur et le tampon acide est ajouté à la cuvette. Comme dans la première expérience, le taux d'extension paroi cellulaire se stabilise progressivement à une valeur faible en raison du manque de expansine fonctionnelle.
4. Après environ 20 minutes, les protéines expansine est ajouté à la cuvette par «dopage» avec le tampon dans la cuvette avec 10-20 uL d'une solution expansine. Le expansine pénètre rapidement l'échantillon paroi cellulaire et en quelques minutes, nous voyons que le taux d'extension a augmenté. Cette réponse d'extension peut être suivie pendant une heure ou plus.

Figure 1: Schéma des procédures de préparation des parois cellulaires pour évaluer induite par l'acide ou de l'extension expansine induite mur.

Discussion

Pour cette démonstration, nous avons utilisé les parois cellulaires des hypocotyles de concombre, parce qu'ils se sont révélés être une source fiable d'échantillons mur qui sont faciles à manipuler et qui répondent avec une bonne sensibilité. Nous avons également eu de bons résultats avec des murs d'autres plants ainsi que certains matériaux du supermarché, comme les feuilles d'épinards jeunes et les tiges de céleri. Fondamentalement, jeune, doux, les tissus végétaux à croissance rapide sont susceptibles d'être facilement mesurés avec cette technique, mais difficile, les vieux, les tissus végétaux oxydé ou nongrowing sont peu susceptibles d'être réceptifs à cause de la paroi cellulaire réticulation. Il ya quelques autres choses à se méfier des:

1. La variabilité biologique - même semis uniforme donnent des réponses variables, donc un minimum de 5-8 répliques est nécessaire de produire des résultats statistiquement significatifs.
2. Abrasion de la cuticule est important pour permettre une pénétration rapide des tampons et des protéines dans l'échantillon paroi cellulaire. Si la cuticule n'est pas suffisamment écorchée, les réponses aux tampons acides sera lente et sourde et les protéines peuvent même pas pénétrer la cuticule d'obtenir une réponse. Certains échantillons pourraient pas besoin à l'abrasion, à savoir si vous utilisez pelures épidermique ou d'autres tissus disséqués. L'abrasion nonuniform ajoute une variabilité importante pour beaucoup de novices.
3. Inactivation par la chaleur, qui est utilisé pour supprimer ou de dénaturer expansines endogène, peut être effectuée par d'autres méthodes, mais on a besoin de trouver la quantité minimale de chauffage pour inactiver expansine endogène pour éviter d'affaiblir excessive et la rupture des échantillons mur.
4. Expansines sont sujettes à l'inactivation par oxydation, donc 1-5 mM de dithiothréitol dans le tampon permet généralement de stabiliser l'activité.
5. L'extensomètre n'est pas un hors-la-shelf pièce d'équipement, mais exige la construction sur mesure de (a) de la cuvette qui retient l'échantillon de mur et (b) l'assemblage LVDT-pince-contrepoids. L'interface de l'ordinateur et l'unité d'acquisition de données ne sont pas essentiels, mais sont particulièrement utiles pour la course des échantillons répétés simultanément et pour l'analyse des courbes d'extension quantitative.