Geração de Células-tronco pluripotentes induzidas a partir de sangue periférico usando o STEMCCA Lentivirus Vector

Resumo

Aqui, mostramos um protocolo simples e eficaz para a geração de iPSCs humanos a partir de 3-4 ml de sangue periférico utilizando um vector lentiviral única reprogramação. Reprogramação de células do sangue prontamente disponíveis promete acelerar a utilização da tecnologia iPSC tornando-o acessível a uma comunidade mais ampla de pesquisa.

Resumo

Através da expressão ectópica de quatro factores de transcrição, Oct4, Klf4, Sox2 e cMyc, as células somáticas humanas pode ser convertido para um estado pluripotente, gerando assim chamadas células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) ^1-4. Específicas do paciente iPSCs faltam as preocupações éticas que envolvem as células-tronco embrionárias (CTEs) e seria ignorar rejeição imunológica possível. Assim, iPSCs têm atraído considerável atenção para estudos de doenças de modelagem, a triagem de compostos farmacológicos e terapias regenerativas ^5.

Nós mostramos a geração de transgene livres iPSCs humanos a partir de pacientes com doenças pulmonares diferentes, utilizando um único coletável policistrónica lentiviral Cassete Stem Cell (STEMCCA) codificando os factores Yamanaka ^6. Estas linhas iPSC foram gerados a partir de fibroblastos da pele, o tipo celular mais comum utilizado para a reprogramação. Normalmente, a obtenção de fibroblastos requer uma biópsia por punção da pele seguido de expansão das célulass na cultura de algumas passagens. É importante notar que um certo número de grupos têm relatado a reprogramação de células humanas de sangue periférico em iPSCs ^7-9. Num estudo, uma versão induzível Tet do vector STEMCCA foi empregue ^9, o que exigia que as células do sangue a ser simultaneamente infectadas com um lentivírus constitutivamente activo que codifica a tetraciclina reversa transactivador. Em contraste com os fibroblastos, células do sangue periférico podem ser recolhidas através de procedimentos minimamente invasivos, reduzindo o desconforto e sofrimento do paciente. Um protocolo simples e eficaz para a reprogramação de células de sangue utilizando um único vetor constitutivo coletável pode acelerar a aplicação da tecnologia iPSC tornando-o acessível a uma comunidade mais ampla de pesquisa. Além disso, a reprogramação de células de sangue periférico permite a geração de iPSCs de indivíduos em que as biópsias da pele devem ser evitados (ie. Aberrante cicatriz) ou devido a condições de doença pré-existente prevenng acesso a punch.

Aqui demonstramos um protocolo para a geração de iPSCs humanos a partir de células mononucleares de sangue periférico (PBMC), utilizando um vector floxed-coletável único lentiviral que expressam constitutivamente as quatro factores. PBMCs recolhidos de fresco ou descongelado são expandidos durante 9 dias, tal como descrito em ^10,11 de ácido ascórbico, meio contendo SCF, IGF-1, IL-3 e EPO antes de serem transduzidas com o lentivirus STEMCCA. As células são então plaqueadas em MEFs e ESC-como colónias podem ser visualizadas de duas semanas após a infecção. Finalmente, os clones seleccionados são expandidos e testados quanto a expressão dos marcadores de pluripotência SSEA-4, Tra-1-60 e Tra-1-81. Este protocolo é simples, robusto e altamente consistente, fornecendo uma metodologia fiável para a geração de iPSCs humanos prontamente acessível a partir de 4 ml de sangue.

Protocolo

1. Isolamento e expansão de células mononucleares do sangue periférico (PBMC)

DIA 0

1. Aspire 4 ml de sangue periférico num Vacutainer CPT BD Tubo Preparação celular com citrato de sódio. Inverter o tubo de 8 a 10 vezes e centrifugar a 1800 xg durante 30 min à temperatura ambiente. Idealmente, esta etapa deve ser feito dentro de 2 horas da coleta.
2. Recolher as células mononucleares (MCs), pipetando buffy coat (camada de células entre barreira de gel e de plasma) para um tubo de 15 ml estéril de centrífuga cónico. Levar o volume total a 10 ml com fosfato estéril-salino tamponado (PBS), invertido várias vezes e centrifugar a 3....

Resultados

Nós demonstramos um protocolo simples e eficaz para a geração de iPSCs humanos a partir de PBMCs, utilizando um vector lentiviral única. Figura 1A mostra uma representação esquemática do protocolo. O sangue é recolhido para um tubo CPT Vacutainer BD Preparação celular com citrato de sódio, e após a centrifugação, as células mononucleares pode ser recolhida a partir da interface entre o gel de poliéster e o plasma (buffy coat) (Figura 1B). As PBMCs isoladas são então expandidas em cultur.......

Discussão

Descrevemos aqui a utilização do vector lentiviral STEMCCA para gerar iPSCs humanos a partir de células mononucleares isoladas de alguns mililitros de solução recentemente colhido sangue periférico. O protocolo pode também ser usado para reprogramar PBMCs congelados (obtido directamente a partir de buffy coat), um detalhe de implicações práticas quando se utilizam células de dador adquiridas a partir de um local distante. Antes da indução de reprogramação, PBMCs isoladas deve ser submetida a um passo de expansão crítico.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
BD Vacutainer CPT Tubo preparação celular com citrato de sódio	BD Biosciences	362760
QBSF-60 Médio Stem Cell	Qualidade Biológica	160-204-101
IMDM	Invitrogen	12440
DMEM/F12	Invitrogen	11330
FBS	Atlanta Biologicals	S10250
Substituição Knockout Serum	Invitrogen	10828
Primocin	Invivogen	ant-pm-2
Pen / Strep	Invitrogen	15140
L-Glutamina	Invitrogen	25030
Não-essenciais Aminoácidos	Invitrogen	11140
β-mercaptoetanol	Biomedicals MP	190242
Ácido ascórbico	Sigma	A4544
IGF-1	R & D Systems	291-G1
IL-3	R & D Systems	203-IL
SCF	R & D Systems	255-SC
EPO	R & D Systems	286-PE
Dexametasona	Sigma	D4902
Polybrene	Sigma	H-9268
bFGF	R & D Systems	233-FB
Stemolecule Y27632	Stemgent	04-0012
ES celular Kit Amostra Marcador	Millipore	SCR002