Déclenchement à distance magnétique de sondes micrométriques pour<em> In situ</em> Cartographie 3D de biofilms bactériens Propriétés physiques

Summary

Ce document montre une méthodologie originale sur la base de l'actionnement à distance de particules magnétiques ensemencées dans un biofilm bactérien et le développement des pinces magnétiques dédiés pour mesurer in situ les propriétés mécaniques locales du matériau vivant complexe construit par des micro-organismes au niveau des interfaces.

Abstract

L'adhérence bactérienne et à la croissance sur les interfaces conduisent à la formation de structures en trois dimensions hétérogènes dits biofilms. Les cellules qui demeurent sur ces structures sont maintenues ensemble par des interactions physiques induites par un réseau de substances polymères extracellulaires. Biofilms bactériens impact sur de nombreuses activités humaines et la compréhension de leurs propriétés est cruciale pour une meilleure maîtrise de leur développement – la maintenance ou l'élimination – en fonction de leur résultat négatif ou positif. Cet article décrit une nouvelle méthodologie visant à mesurer in situ les propriétés physiques locales du biofilm qui avait été, jusqu'à présent, examiné que dans une perspective de matériau macroscopique et homogène. L'expérience décrite ici consiste à introduire des particules magnétiques dans un biofilm de plus en plus aux semences sondes locales qui peuvent être actionnés à distance sans perturber les propriétés structurales du biofilm. Pinces magnétiques dédiés ont été développé pour exercer une force définie sur chaque particule noyée dans le biofilm. La configuration est monté sur la scène d'un microscope pour permettre l'enregistrement d'images de time-lapse de la période de particules de traction. Les trajectoires des particules sont ensuite extraites à partir de la séquence de traction et les paramètres viscoélastiques locaux sont obtenus à partir de chaque courbe de déplacement des particules, assurant ainsi la distribution de 3D-spatiale des paramètres. Gagner un aperçu du profil mécanique du biofilm est essentiel du point de vue d'un ingénieur des fins de contrôle du biofilm mais aussi d'un point de vue fondamental de clarifier la relation entre les propriétés architecturales et la biologie particulière de ces structures.

Introduction

Biofilms bactériens sont des communautés de bactéries associées à des surfaces biologiques ou artificiels ^1-3. Ils forment par un mécanisme d'adhérence croissance, associée à la production de matrice extracellulaire riche en polysaccharides qui protège et stabilise l'édifice ^4,5. Ces biofilms sont pas simplement passifs assemblages de cellules collées aux surfaces, mais les systèmes biologiques complexes dynamiques organisés et. Lorsque les bactéries planctoniques à passer de biofilm mode de vie, les changements dans l'expression des gènes et la physiologie des cellules sont observées ainsi qu'une augmentation de la résistance aux antimicrobiens et accueillent les défenses immunitaires étant à l'origine de nombreuses infections persistantes et chroniques ^6. Cependant, le développement contrôlé de ces structures vivantes offrent également des possibilités pour des applications industrielles et environnementales, telles que la bioremédiation des sites de déchets dangereux, bio-filtration de l'eau industrielle ou de la formation de bio-barrières pour protéger les sols et les eaux souterraines de contamination.

Bien que les caractéristiques moléculaires spécifiques de la manière de biofilm de vie sont de plus en plus décrits, les mécanismes d'entraînement le développement communautaire et la persistance restent floues. En utilisant les dernières avancées sur les mesures micrométriques utilisant électrochimique de balayage ou la microscopie à fluorescence, ces organisations vivantes ont été montré pour présenter considérable structurel, chimique et biologique hétérogénéité ^7. Pourtant, jusqu'à présent, la mécanique du biofilm ont été principalement examinés macroscopiquement. Par exemple, l'observation des banderoles de biofilm déformation due aux variations de taux d'écoulement de fluide ^8,9, compression uniaxiale de pièces mécaniques de biofilm milieu d'agar ou cultivé sur le couvercle glisse ^10,11, cisaillement du biofilm collecté de l'environnement, puis transféré à un parallèle rhéomètre à plaques ^12,13, la spectroscopie de force atomique en utilisant une bille de verre et revêtu d'un biofilm bactérien fixé à un cantilever AFM ¹⁴ ou un micr dédiéocantilever méthode de mesure de la résistance à la traction de fragments de biofilm détachées ^15,16 ont été mis en œuvre au cours des dix dernières années, fournissant des informations utiles sur la nature viscoélastique du matériau ^17. Cependant, il semble probable que des informations sur des propriétés mécaniques du biofilm in situ est perdue lorsque le matériau est retiré de son environnement d'origine, ce qui est souvent le cas dans ces approches. En outre, le traitement du biofilm en tant que matériau homogène manque les informations sur l'éventuelle hétérogénéité des propriétés physiques au sein de la communauté. Par conséquent, la portée exacte de la mécanique de la structure de la formation de biofilm et des caractéristiques biologiques telles que les motifs d'expression du gène ou de gradients chimiques peuvent difficilement être reconnus. Pour progresser vers une description microscopique des propriétés physiques du biofilm, de nouveaux outils dédiés sont nécessaires.

Cet article détaille une approche originale conçue pour atteindrela mesure des paramètres mécaniques locales in situ, sans perturber le biofilm et permet le dessin de la répartition spatiale des propriétés du matériau à micro-échelle, puis l'hétérogénéité mécanique. Le principe de l'essai repose sur le dopage d'un film biologique en croissance avec des microparticules magnétiques suivie de leur chargement à distance en utilisant des pinces magnétiques dans le biofilm mature. déplacement des particules sous l'application de la force magnétique contrôlé imagé au microscope permet la dérivation de paramètre viscoélastique local, chaque particule de rapports de son propre environnement local. A partir de ces données, le profil 3D mécanique du biofilm peut être tirée, révélant état dépendances spatiales et environnementales. L'ensemble de l'expérience sera montrée ici sur un E. biofilm coli faite par une souche génétiquement modifiée portant un plasmide F-comme déréprimée. Les résultats détaillés dans un document récent ¹⁸ offrent une vision unique de l'intérieur de la mécanique du biofilm intactes.

Protocol

1. Culture de bactéries et de préparation de Suspension Choisissez une colonie fraîchement cultivés à partir d'une plaque de gélose Lysogénie Broth (LB), inoculer dans 5 ml de milieu LB liquide contenant 100 μ g / ml d'ampicilline et 7,5 μ g / ml tétracycline et incuber pendant 5 à 6 heures à 37 ° C sur une plate-forme en secouant. Ensuite, ajouter 100 μ l de la culture bactérienne dans 5 ml de milieu minimum (M63B1) supplémenté avec 0,4% de glucos…

Representative Results

Une analyse typique fournira la distribution spatiale des paramètres viscoélastiques à l'échelle du micron sur un biofilm vivant sans déranger son agencement d'origine. Des résultats typiques sont présentés dans la figure 7, où les valeurs de J 0 – la compliance élastique – sont donnés en fonction de l'axe z le long de la profondeur et de l'axe y le long d'une dimension latérale du biofilm. Chaque point correspond à un bourrelet dont l'analyse de la courbe…

Discussion

Cette particule magnétique ensemencement et en tirant expérience in situ a permis la cartographie 3D des paramètres viscoélastiques d'un biofilm de plus en plus dans son état ​​d'origine en. Cette approche a révélé l'hétérogénéité de la mécanique E. coli biofilm cultivé ici et a donné des indices pour pointer les composants du biofilm soutenant les propriétés physiques du biofilm, ce qui suggère fortement une implication fondamentale de la matrice extracellul…

Materials

Table 1: Reagents and cells
Magnetic particles	Life technologies	14307D	Micrometric magnetic particle, 2.8 µm diameter
Ampicillin (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	A9518
Tetracycline (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	87128
Bacterial strain MG1655gfpF	UGB, Institut Pasteur, France		produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline
Table 2:  Capillaries and tubing
Filters for pediatric perfusion	Prodimed-Plastimed	6932002
Hollow Square Capillaries	Composite Metal Scientific	8280-100	Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8mm x0.8mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0512	Diameter 1mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0700	Diameter 3mm
Table 3: Biofilm growth
Lysogeny Broth (LB) solution	Amresco-VWR	J106-10PK	standard medium used to grow bacteria
M63B1 solution	Home-made		Standard minimum  medium used to grow bacteria
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose
Table 4: Electronics
Camera EMCCD	Hamamatsu	C9100-02
Heater controller	World precision instruments	300354
Function generator	Agilent technologies	33210A
Power amplifier	Home-made		It gives a current signal with amplitudes up to 4 A.
Syringe pumps	Kd Scientific	KDS-220
Shutter	Vincent Associates	Uniblitz T132
Magnetic tweezers	Home-made		Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Fig. 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11.
Table 5: Optics
Inverted microscope	Nikon	TE-300
S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3)	Nikon		This a long working distance ojective enabling observation of the biofilm in the depth
Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20  2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55	Chroma	1)#49020 2)#31002	Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block.
Table 6: Image analysis
ImageJ	NIH – particle tracker plugin