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Artigo de método

Aguda Cérebro Trauma em camundongos seguiu por Longitudinal dois fótons de imagem

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DOI:

10.3791/51559

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6 de abril de 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Neuroscience Center, University of Helsinki

Neste artigo

Resumo

Trauma cerebral aguda é uma lesão grave que não tem tratamento adequado à data. Microscopia Multiphoton permite estudar longitudinalmente o processo de desenvolvimento agudo trauma cerebral e sondagem estratégias terapêuticas em roedores. Dois modelos de trauma cerebral aguda estudou com in vivo de dois fótons de imagem de cérebro são demonstrados neste protocolo.

Resumo

Embora trauma cerebral aguda muitas vezes resulta de danos à cabeça em diferentes acidentes e afeta uma fração substancial da população, não existe um tratamento eficaz para ele ainda. Limitações dos modelos animais usados ​​atualmente impedem a compreensão do mecanismo de patologia. Microscopia Multiphoton permite o estudo de células e tecidos dentro cérebros de animais intactos longitudinalmente sob condições fisiológicas e patológicas. Aqui, descrevemos dois modelos de lesão cerebral aguda estudados por meio de dois fótons de imagem de comportamento das células do cérebro em condições pós-traumáticas. A região do cérebro selecionado é ferido com uma agulha fina para produzir um trauma de largura controlada e profundidade no parênquima cerebral. O nosso método utiliza estereotáxico picada com uma agulha de seringa, que pode ser combinado com a aplicação simultânea de drogas. Propomos que este método pode ser utilizado como uma ferramenta avançada para estudar os mecanismos celulares de consequências fisiopatológicos de traumas agudos no cérebro dos mamíferos

Introdução

Lesão cerebral aguda é um problema significativo de saúde pública, com alta incidência de lesões em acidentes de trânsito, quedas ou agressões, e alta prevalência de incapacidade crônica subseqüente. As abordagens terapêuticas para o tratamento de lesões cerebrais permanecem totalmente sintomático, limitando assim a eficácia do atendimento pré-hospitalar, cirúrgico e crítico. Isso faz com que o impacto social e econômico da lesão cerebral particularmente grave. Por uma variedade de razões, a maioria dos ensaios clínicos não demonstraram melhoria na recuperação após a lesão cerebral usando novas abordagens terapêuticas.

Os modelos animais são cruciais para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para uma fase em que a eficácia da droga pode ser previsto em pacientes com lesões cerebrais. Atualmente, existem vários modelos animais bem estabelecidos de traumatismo craniano, incluindo o impacto controlado cortical 1, o fluido lesão percussão 2, dinâmico deformação cortical 3, peso-drop4 e lesão foto 5. Uma série de modelos experimentais têm sido utilizados para estudar certos aspectos morfológicos, moleculares e comportamentais de cabeça associada a trauma patologia. No entanto, nenhum modelo animal único é totalmente bem-sucedido na validação de novas estratégias terapêuticas. Desenvolvimento de modelos animais confiáveis, reprodutíveis e controladas de lesão cerebral é necessário avaliar os processos patológicos complexos.

A nova combinação das mais recentes tecnologias de imagem microscópica e repórteres fluorescentes geneticamente codificados oferece uma oportunidade sem precedentes para investigar todas as fases da lesão cerebral, que incluem lesão primária, espalhando-se da lesão primária, a lesão secundária e regeneração. Em particular, in vivo microscopia de dois fótons é uma tecnologia óptica não-linear única que permite a visualização em tempo real das estruturas celulares e subcelulares mesmo em profundas camadas corticais do cérebro de roedores. Vários tipos de células e organelles podem ser visualizados simultaneamente, combinando diferentes marcadores fluorescentes. Usando essa poderosa ferramenta, podemos visualizar as alterações morfológicas e funcionais dinâmicos no cérebro vivendo sob condições pós-traumáticas. As vantagens da microscopia in vivo de dois fótons em estudar lesão cerebral foram recentemente demonstrado pelo Kirov e colegas 6. Usando um modelo de contusão cortical focal leve, estes autores mostraram que a lesão dendrítica aguda no córtex pericontusional é fechado pela diminuição do fluxo sanguíneo local. Além disso, demonstraram que o córtex metabolicamente comprometida em torno do local contusão é mais danificado pela despolarização espalhar. Este dano secundário afeta circuitos sinápticos, tornando as conseqüências da lesão cerebral traumática mais grave.

Aqui, propõe-se o método de picada estereotáxico com uma agulha de seringa, que pode ser combinado com a aplicação tópica de drogas em simultâneo, como um modelo avançado para o local do cérebrolesão e como uma ferramenta para estudar as consequências fisiopatológicas do trauma agudo no cérebro de mamíferos in vivo.

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Protocolo

Todos os procedimentos aqui apresentados foram realizados de acordo com a orientação local para cuidar dos animais (A lei finlandesa de Experimentação Animal º 62/2006). Licença Animal (ESAVI/2857/04.10.03/2012) foi obtida de autoridade local (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). Camundongos adultos de 1-3 meses de idade, peso 24-38 g, foram mantidos em gaiolas individuais no biotério da Universidade de certificado e desde que com comida e água ad libitum.

1. Lesão Cerebral de imagem através de uma janela Cranial

  1. Anestesiar animais e preparar o campo de operação
    1. Anestesiar os ratos por injecção peritoneal de uma mistura de cetamina (Ketalar, 80 mg / kg) e xilazina (Rompun, 10 mg / kg) dissolvido em solução salina tampão de fosfato, esterilizada por filtro (PBS), pH 7,4. Confira os reflexos do rato regularmente (cauda e sonda pitada tep) para verificar a profundidade da anestesia. Aumentar a dose se necessário, para manter a anestesia adequada, mas evitar Overdose.
    2. Manter o animal a 37,0 ° C utilizando uma almofada de aquecimento durante a operação cirúrgica, sessão de imagem e primeira hora após a recuperação da anestesia.
    3. Para proteger os olhos do rato de secar, aplique um lubrificante ocular.
    4. Administrar dexametasona (veterinário Rapidexon, 2 mg / kg) por injecção subcutânea para reduzir a inflamação e edema cerebral.
    5. Administrar um analgésico (por exemplo, por via intraperitoneal Ketoprophene) até 30 minutos antes ou imediatamente após a cirurgia. Se o animal apresenta quaisquer sintomas de dor, como a relutância em se movimentar, comer ou beber, ou perda de peso, salivação, piloereção, ou respiratória sons anormais após a cirurgia, repetir a injeção de analgésico.
    6. Raspar a cabeça de rato ", com uma máquina de barbear (ver Materiais e Equipamentos). Evite danificar os bigodes.
    7. Tratar a pele na cabeça do rato com uma solução de etanol 70% para limpar a área raspada.
    8. Usando uma tesoura cirúrgica (ver Materiais eEquipamentos) e fórceps (ver Materiais e Equipamentos), corte a pele da linha média entre as orelhas para a testa.
    9. Delicadamente raspar o tecido conjuntivo ligado ao crânio com uma lâmina microcirúrgica contundente.
    10. Deslize fronteiras de pele de lado e puxe barras de ouvido ligeiramente em orifícios auditivos do crânio para a cabeça e fixação da pele.
    11. Limpe o crânio com PBS estéril e tratar o local da cirurgia na cabeça do rato com 0,5% de digluconato de clorexidina, em seguida, secar a superfície do crânio usando uma combinação de cotonetes estéril e ar comprimido.
  2. Infliction da lesão picada
    1. Posicione um animal pequeno instrumento estereotáxico com um suporte de animais (ver Materiais e Equipamentos).
    2. Ajustar a posição do microscópio binocular ao lado do instrumento estereotáxico para focar na superfície do crânio do animal.
    3. Utilizando um microscópio binocular, localizar o ponto bregma no crânio.
    4. Identificar a region de interesse, utilizando as coordenadas estereotáxica.
      NOTA: Evite as áreas de interesse que estão localizados diretamente sobre os vasos corticais superficiais. Destruição destes pode afetar fortemente a progressão trauma.
    5. Posicione a agulha 30 G acima da região escolhida e marcar o local de destino, arranhando a superfície do crânio.
    6. Perfurar o crânio com todas as precauções possíveis para evitar a ampliação desnecessária da superfície osso afetado. Use uma broca cirúrgica de alta velocidade (ver Materiais e Equipamentos) sob o microscópio. Pare de perfurar se líquido aparece na área perfurada.
    7. Tocar no fundo do poço perfurado com agulha.
    8. Mergulhar a agulha suavemente no cérebro (taxa de inserção 5-10 mm / min), para a profundidade de 0,5-2,0 mm, de acordo com as coordenadas do local de aplicação da picada.
    9. Remova a agulha imediatamente após atingir a profundidade desejada (taxa de retração 5-10 mm / min) e limpar o sangue que aparece após a picada com um pequeno tampão (see Materiais e equipamentos).
    10. Realize microinjeção de 100 M Sulforodamina 101 ou outro composto de interesse para o local da lesão usando uma bomba de micro-seringa (WPI) e 10 mL Hamilton seringa montar com pipeta de vidro.
      NOTA: Durante a preparação da pipeta de vidro de borosilicato capilar de vidro, aguçar a ponta de um diâmetro de 10-20 m.
    11. Infundir 250-1,500 nl de solução de injecção a uma taxa de 2-5 nl / seg.
      NOTA: Deixe a pipeta após o término da infusão por pelo menos 5 minutos em parênquima cerebral, em seguida, removê-lo devagar e com cuidado para evitar a solução de saída.
  3. Craniotomia para janela craniana crônica
    1. Fure o crânio delicadamente e com cuidado para fazer uma janela de círculo em torno do local da lesão. Use diâmetro janela de 3-3,5 mm.
    2. Aplicar uma gota de tampão de córtex (NaCl 125 mM, KCl 5 mM, glicose 10 mM, HEPES 10 mM, CaCl2 2 mM e 2 mM de MgSO4 em H2O destilada) para cobrir o window.
    3. Coloque uma lamela de vidro redondo (# 1.5 espessura) na janela craniana.
    4. Remover o excesso de tampão de córtex em torno da lamela.
    5. Selar as bordas da lamínula com cola poliacrílico (ver Materiais e Equipamentos).
      NOTA: Assegurar que a cola não é aplicada à superfície superior da lamela. Se a tampa de vidro está contaminado com cola, espere até que o vidro é estavelmente colado ao crânio e a cola na superfície do vidro fica seca, em seguida, retire cuidadosamente a cola contaminar com uma micro-lâmina.
    6. Aguarde 5 minutos para deixar a cola secar.
    7. Usando os parafusos altura da barra de ouvido, ajuste a posição da cabeça, de modo que o suporte do metal pode ser colocado.
    8. Aplique uma pequena quantidade de cola poliacrílico no anel do suporte do aço (ver Materiais e Equipamentos).
    9. Cole o anel do suporte do aço na lamela de vidro com o punho suporte de metal dirigido para trás.
    10. Aguarde 5 minutos para deixar a cola secar.
    11. Mix cimento dental (ver Materiais e equipamentos) com cola poliacrílico em um prato de Petri 3,5 centímetros (ou analógico) para alcançar condições viscosos.
    12. Selar as bordas da janela craniana com a mistura de cola + cimento e cobrir a superfície exposta do crânio com a mesma mistura até a fronteira da pele.
    13. Aguarde 15 minutos para deixar a mistura de cola cimento + secar e, em seguida, remover as barras de ouvido.
    14. Realize dois fótons de excitação microscópica (TPEM) de imagem para a região de interesse e uma área de controle, uma vez que definido no protocolo 3.
    15. Depois de imagem, permitem que o animal se recuperar da anestesia em uma almofada de aquecimento e mantê-lo em uma gaiola indivíduo sob observação até a recuperação completa. Alimentos úmidos pode ser dada para facilitar a mastigação e hidratação.

2. Lesão Cerebral de imagem através do crânio afinado

  1. Anestesiar animais e preparar o campo de operação
    1. Anestesiar o mouse e prepará-lo para a indução do traumatal como descrito na etapa 1.1.
  2. Crânio afinamento e imposição da lesão picada
    1. Posicione um animal pequeno instrumento estereotáxico com o suporte do animal (ver Materiais e equipamentos).
    2. Ajustar a posição de um microscópio binocular ao lado do instrumento estereotáxico para focar na superfície do crânio do animal.
    3. Localize o ponto bregma no crânio usando o microscópio binocular, identificar a área do cérebro a ser trabalhada com base nas coordenadas estereotaxia e marcá-lo riscando.
      NOTA: Crânio posição desbaste não deve ser localizado sobre ou perto suturas cranianas, como a estabilidade crânio é comprometido nessas áreas. Além disso, grandes vasos e meninges localizados abaixo das suturas do crânio corticais ou meninges são susceptíveis de causar artefatos de imagem.
    4. Colocar o suporte metálico revestido com cola ao longo da área de interesse no crânio do animal, aplicar uma ligeira pressão e esperar cinco minutos, até o suporte do metal é firmemente colado ao crânio.
    5. Misturar o cimento dental (ver Materiais e Equipamento) com cola poliacrílico em uma placa de Petri de 3,5 cm (ou análogo) para alcançar condições viscosos.
    6. Selar as bordas do suporte de metal com a mistura de cola + cimento e cobrir a superfície exposta do crânio com a mesma mistura-se até à fronteira da pele.
    7. Aguarde 15 minutos para deixar o cimento e mistura de cola secar.
    8. Lavar a região crânio diluído e as partes circundantes de suporte metálico várias vezes com PBS, de modo que os restos de cola nonpolymerized são lavados.
      NOTA: É fundamental garantir a fixação estável do crânio ao titular. Isto permite que a estabilidade durante a preparação de imagem.
    9. Usando o modo de alta ampliação do microscópio binocular, remover as camadas superiores do osso do crânio com um micro-broca de alta velocidade para criar uma área de crânio diluído de ~ 0,5-1,5 mm de diâmetro. Use ar comprimido durante a perfuração para remover os escombros do osso. Realize o intermittentl perfuraçãoy durante o processo de desbaste de modo a evitar o sobreaquecimento induzida por fricção. Arrefece-se a broca com a solução à temperatura ambiente e aplicar periodicamente tampão para a zona adelgaçada para absorver o calor.
      NOTA: Para evitar danos ao córtex, não perfurar em grandes regiões (> 1,5 mm) até uma camada fina (<50 mm).
      NOTA: A estrutura de roedor osso do crânio é constituído por duas camadas finas de osso compacto separadas por uma camada espessa de osso esponjoso. Cavidades minúsculas da forma de osso esponjoso círculos concêntricos e canalículos, que contêm vasos sanguíneos. Utilizar a microdrill para remover tanto a camada externa de osso compacto e mais da camada esponjosa. O rompimento dos vasos sanguíneos dentro do osso esponjoso pode provocar sangramento. Use esponja de colágeno hemostasia para parar o sangramento.
    10. Use geração de segundo harmônico (SHG) de imagem para analisar se a maior parte do osso esponjoso foi removido. Tenha cuidado para evitar desbaste excessivo, certifique-se que o osso restante é thicker do que 50 um, nesta fase da preparação.
    11. Coloque uma gota de tampão quente (35-37 ° C) no topo da região diluído. Use uma lâmina microcirúrgica ou acabamento Micro Bur para remover mais camadas de osso e formam uma zona lisa de ~ 700 um de diâmetro com a espessura do osso de ~ 20 mM. Durante este passo, que é útil para realizar imagiologia de SHG repetitivo e regularmente medir a espessura do osso.
    12. Realize imagem TPEM para a região de interesse e uma área de controle.
    13. Ajustar a posição de cabeça utilizando os parafusos de barra de altura da orelha, de tal maneira que a região é diluído posicionados rigorosamente horizontalmente. Posicione a agulha acima da região diluída e certifique-se de que não existem grandes navios sob o local alvo.
    14. Fazer uma lesão por meio de imersão da agulha no cérebro, com a profundidade de 0,5-2,0 mm da superfície do crânio e afinada de acordo com as coordenadas do local de aplicação da picada.
    15. Remova a agulha e suprimir a hemorragia que aparece depois de tele lesão cerebral aguda com tampão hemostático (ver Materiais e equipamentos). Espere até que os coágulos de sangue forma e pulsação vaso no local da lesão pára.
    16. Realizar a microinjecção de 100 uM Sulforodamina 101 ou outro composto de interesse para o local da lesão, tal como acima descrito na secção 1.2.10.
    17. Realize imagem TPEM para monitorar a progressão de lesões e recuperação, conforme descrito no Protocolo no 3.
    18. Depois de imagem, permitem que o animal a recuperar a consciência da anestesia em uma almofada de aquecimento. Não deixe o animal sem supervisão e devolvê-lo à sua gaiola somente após a recuperação física completa.

3. Imagem

  1. Colocar o animal sob o microscópio, anexando o suporte do metal para o quadro personalizado construído.
  2. Para imagens, use por exemplo, o FV1000MPE dois fótons microscópio equipado com Mai Tai DeepSee laser e XLPLN 25X 1,05 NA objetivo de imersão em água otimizado para in vivo de dois fótonsimagiologia.
  3. Identificar o local da lesão ao microscópio usando o modo de fluorescência de campo amplo. Utilize filtros passa longos para visualizar vasculatura cerebral e selecionar a área de controle de acordo com o padrão observado dos vasos sanguíneos.
  4. Para a imagem do sinal de geração de segundo harmônico (SHG), ajustar o laser de femtosegundos para o comprimento de onda de 800 nm e coletar a luz emitida usando o filtro de desvio nm 380-410. Para imagens de fluorescência, utilize o filtro passa-banda (515-560 nm) para coletar a luz emitida, e os seguintes comprimentos de onda são usados ​​para excitar a fluorescência: GFP-860 nm, YFP-950 nm.
  5. Use software FluoView para aquisição de imagem.
  6. Coordena loja de cada ROI para posterior imagem repetitivo. Imagem da mesma ao longo do tempo de ROIs, e ajustar as coordenadas de cada vez para maximizar a sobreposição de imagem.
  7. Analisar as imagens com o software apropriado (por exemplo,. ImageJ). Reconstruções aqui apresentados foram feitos usando software Imaris.

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Resultados

Nós otimizamos dois procedimentos de operação: 1) janela craniana crônica e 2) desbaste crânio, para imagiologia cerebral pós-traumático em camundongos transgênicos. Representação esquemática das preparações experimentais é apresentada na Figura 1. Traumática por picada de agulha de aço de 0,3 mm de diâmetro externo (30 L) é aplicada ao poço perfurado (Figura 1A). A preparação janela craniana bem sucedido permite imagens em profundidades de até 650 mícrons abaixo da superfície pial

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Discussão

Trauma cerebral é um evento abrupto, imprevisível. Aqui, nós descrevemos o modelo animal que reproduz um espectro de alterações patológicas observadas em pacientes humanos após a lesão do cérebro, tais como a neurodegeneração, a eliminação de dendritos, edema cerebral, cicatriz glial, hemorragias no córtex cerebral, juntamente com uma hemorragia subaracnóide focal e aumento da permeabilidade da barreira sangue-cérebro. Estudar patogênese primário e secundário, bem como a recuperação após o trauma, este modelo foi combin...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Estamos profundamente agradecidos ao Dr. Frank Kirchhoff para a prestação de GFAP-EGFP e cepas CX3CR1-EGFP do mouse. O trabalho foi suportado por concessões do Centro de Mobilidade Internacional da Finlândia, Tekes, o finlandês Graduate School of Neuroscience (FGSN) e da Academia da Finlândia.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Pinça muda 2A-sa, 115 mmXYtronicXY-2A-SA
30 G ½ na agulhaBDREF 304000
Aparador de animais, máquina de barbearAesculapIsis GT420
Microscópio BinocularZeissStemi 2000
Controlador de Temperatura Biológico com almofada de aquecimento de aço inoxidávelSupertechTMP-5b
Lâmina microcirúrgica rombaBDREF 374769
Tubo de borossilicato com filamentoSutter InstrumentsBF120-69-10Para produção de pipetas de vidro
CarprofenoPfizerRimadyl vet
Digluconato de clorexidinaSigmaC9394
Cimento dentárioDrguDent, DentsplyREF 640 200 271
DexametasonaFaunaPharmaRapidexon veterinário
Brocas descartáveisMeisingerHP 310 104 001 001 008
Dulbeco' s PBS 10xSigmaD1408
Dumont #5 fórceps, 110 mmFST91150-20
Extrator de microeletrodos EalingEaling50-2013Extrator vertical para produção de pipetas de vidro
Pomada para os olhosNovartisViscotears
Controle de broca ForedomFM3545
de mão micromotor ForedomForedomMH-145
Plataforma de anestesia a gás para camundongosStoelting50264Montado em instrumento estereotáxico
Hemostasia Colágeno EsponjaAvitene, Ultrafoam BARDRef 1050050
ImarisBitplane
CetaminaIntervetKetaminol vet
Mai Tai DeepSee laserSpectra-Physics
Suporte de metalNeurotar
Microdressing fórceps, 105 mmAesculapBD302R
MicrofilWPIMF34G-5Micro capilares de enchimento de seringas
Óleo mineralSigmaM8410
Microscópio de varredura a laser multifotônicoOlympusFV1000MPE
Seringa NanoFil 10 μ lSeringa WPINANOFILHamilton
Cotonetes não tecidos 5 x 5 TampõescirúrgicosMolnlycke Health CareMesoft
Cola poliacrílicaHenkelLoctite 401
Lamínula de vidro redonda de Microscopia Eletrônica
1.5 espessura 
Instrumento estereotáxico para pequenos animaisDavid Kopf Instruments900
Adaptador de rato e rato neonatal Stoelting51625Montado em instrumento estereotáxico.
Tesoura de íris de estudante, reta 11,5 cmFST91460-11
Sulforrodamina 101Sondas MolecularesS-359
UMP3 e controlador de bomba de micro 4 microseringasWPIUMP3-1Microinjetor e controlador
XylazineBayer Health CareRompun vet
Peça Ciências Bomba de microsseringa

Referências

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  15. Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J. Vis. Exp. 61, (2012).

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Reimpressões e permissões

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