Osteoclastos Derivação do mouse Medula Óssea

Summary

Os osteoclastos são as células de reabsorção óssea principais no corpo. Uma capacidade de isolar os osteoclastos em grandes números resultou em avanços significativos na compreensão da biologia dos osteoclastos. Neste protocolo, nós descrevemos um método para o isolamento, cultivo e quantificar a actividade dos osteoclastos in vitro.

Abstract

Os osteoclastos são células altamente especializadas que são derivados a partir da linhagem monócito / macrófago de medula óssea. A sua capacidade única para reabsorver tanto as matrizes orgânicas e inorgânicas de osso significa que eles desempenham um papel fundamental na regulação da remodelação esquelética. Juntos, osteoblastos e osteoclastos são responsáveis ​​pelo processo de acoplamento dinâmico que envolve tanto a reabsorção óssea e formação óssea agindo em conjunto para manter o esqueleto normal durante a saúde e na doença.

À medida que a célula de reabsorção óssea principais no corpo, alterações na diferenciação de osteoclastos ou a função pode resultar em efeitos profundos no corpo. Doenças associadas com a função dos osteoclastos alterada pode variar em gravidade de doença neonatal letal devido a falha para formar um espaço de medula para a hematopoiese, a patologias como a osteoporose, na qual excessiva reabsorção óssea osteoclástica predispõe à fratura formação mais comumente observada. ent "> A capacidade de isolar os osteoclastos em números elevados in vitro tem permitido avanços significativos na compreensão do ciclo de remodelação óssea e abriu o caminho para a descoberta de novas estratégias terapêuticas que combatam essas doenças.

Aqui, nós descrevemos um protocolo para isolar e cultivar osteoclastos da medula óssea do rato que irá produzir um grande número de osteoclastos.

Introduction

A remodelação óssea é dinâmico e envolve o acoplamento de formação óssea com reabsorção óssea ^1. Este processo fortemente regulado é responsável por manter o esqueleto durante a homeostase normal, e em resposta a lesões e doenças.

Os osteoclastos são células únicas, multinucleadas, que são capazes de reabsorção ambas as matrizes orgânicos e inorgânicos dos ossos. Os osteoclastos são derivadas da linhagem monócito / macrófago de medula óssea ^2-5. As anormalidades na função ou a formação de osteoclastos pode resultar numa variedade de patologias, incluindo condições clínicas comuns, como a osteoporose.

Protocol

NOTA: Declaração de Ética: Toda pesquisa envolvendo animais vertebrados foi realizada em termos dos protocolos aprovados pelo Painel Administrativo Stanford em Laboratory Animal Care (APLAC).

1. Preparação

1. Permitir 10 ml de disponíveis comercialmente meios de separação de gradiente de densidade celular (que contém polissacarose e diatrizoato de sódio, ajustada a uma densidade de 1,077 g / ml) de vir até à temperatura ambiente num tubo de 50 ml.
2. Prepare a citometria de fluxo (FACS) com tampão fosfato solução salina tamponada 1x (PBS) e 2% de soro fetal de vitelo (FCS). Tomar uma aliquota de 50 ml e manter esta aliquota à temperatura ambien....

Results

O objectivo deste método foi isolar facilmente um grande número de osteoclastos in vitro, tipicamente em uma semana. Isolamento bem sucedido de um grande número de osteoclastos foi confirmada utilizando a coloração da fosfatase ácida resistente ao tartarato (Figura 1A). Grandes osteoclastos são visualizados como grandes células roxas com múltiplos núcleos (tipicamente ≥ 3 núcleos). Usando este protocolo, é comum para isolar osteoclastos com até 30 núcleos por osteoclastos (Figura 1B).

Discussion

Uma habilidade para isolar facilmente e cultivar um grande número de osteoclastos in vitro tem sido responsável por ajudar a avançar na compreensão da biologia óssea e doenças mediadas por osteoclastos. Foi a identificação de RANKL que levam a este, quando foi recentemente identificado como o principal regulador da formação de osteoclastos, diferenciação e sobrevivência ^{de 16-18.}

Tem sido nossa experiência que o cultivo in vitro de osteoclastos de medula óssea é .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEM, sem glutamina, sem vermelho de fenol	Gibco	51200-038
M-CSF, camundongo recombinante	Gibco	PMC2044
camundongo recombinante TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expresso)	D Systems	462-TEC-010
Prostaglandina E2	Sigma-Aldrich
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771
Kit de fosfatase ácida, lecócitos (TRAP)	Sigma-Aldrich	387A
, placas de 24 poços	Corning Life Sciences	3987