Osteoclastos Derivação do mouse Medula Óssea

Resumo

Os osteoclastos são as células de reabsorção óssea principais no corpo. Uma capacidade de isolar os osteoclastos em grandes números resultou em avanços significativos na compreensão da biologia dos osteoclastos. Neste protocolo, nós descrevemos um método para o isolamento, cultivo e quantificar a actividade dos osteoclastos in vitro.

Resumo

Os osteoclastos são células altamente especializadas que são derivados a partir da linhagem monócito / macrófago de medula óssea. A sua capacidade única para reabsorver tanto as matrizes orgânicas e inorgânicas de osso significa que eles desempenham um papel fundamental na regulação da remodelação esquelética. Juntos, osteoblastos e osteoclastos são responsáveis ​​pelo processo de acoplamento dinâmico que envolve tanto a reabsorção óssea e formação óssea agindo em conjunto para manter o esqueleto normal durante a saúde e na doença.

À medida que a célula de reabsorção óssea principais no corpo, alterações na diferenciação de osteoclastos ou a função pode resultar em efeitos profundos no corpo. Doenças associadas com a função dos osteoclastos alterada pode variar em gravidade de doença neonatal letal devido a falha para formar um espaço de medula para a hematopoiese, a patologias como a osteoporose, na qual excessiva reabsorção óssea osteoclástica predispõe à fratura formação mais comumente observada. ent "> A capacidade de isolar os osteoclastos em números elevados in vitro tem permitido avanços significativos na compreensão do ciclo de remodelação óssea e abriu o caminho para a descoberta de novas estratégias terapêuticas que combatam essas doenças.

Aqui, nós descrevemos um protocolo para isolar e cultivar osteoclastos da medula óssea do rato que irá produzir um grande número de osteoclastos.

Introdução

A remodelação óssea é dinâmico e envolve o acoplamento de formação óssea com reabsorção óssea ^1. Este processo fortemente regulado é responsável por manter o esqueleto durante a homeostase normal, e em resposta a lesões e doenças.

Os osteoclastos são células únicas, multinucleadas, que são capazes de reabsorção ambas as matrizes orgânicos e inorgânicos dos ossos. Os osteoclastos são derivadas da linhagem monócito / macrófago de medula óssea ^2-5. As anormalidades na função ou a formação de osteoclastos pode resultar numa variedade de patologias, incluindo condições clínicas comuns, como a osteoporose.

A capacidade de gerar osteoclastos in vitro tem permitido avanços significativos em nossa compreensão da biologia óssea ^6. Como resultado, os novos agentes terapêuticos estão a emergir para tratar doenças relacionadas com osteoclastos que são responsáveis ​​pela morbilidades e mortalidades significativas ⁷ . Manutenção homeostática da massa óssea e força exige a acção concertada dos osteoblastos da formação óssea e osteoclastos de reabsorção óssea ^8,9. Homeostase óssea é modificado de uma série de doenças, incluindo a osteoporose pós-menopausa, em que o aumento da actividade de osteoclastos levando à perda de massa óssea patogénico e densidade de ^10. Com o aumento da disponibilidade de modelos murinos transgénicos de doença humana, há mais oportunidade para decifrar o papel dos osteoclastos na doença óssea humana ^11-13.

Inúmeros protocolos para técnicas de cultura de osteoclastos aparecem na literatura, com muitas variações descritas ^9,12,14. Xing e colegas descrevem uma metodologia semelhante para o protocolo descrito abaixo, na descrição de ensaios osteoclastogênicos a partir de células de medula óssea de murino. No entanto, para libertar as células de medula óssea seguintes colheita de osso longo, Xing et al. Lave a cavidade da medula com α-MEM meio completo^14. Catalfamo examina o efeito da hiperglicemia em função dos osteoclastos e descreve um método em que todas as células mobilizadas pela lavagem da medula óssea são cultivadas durante 24 horas, altura em que as células não-aderentes são descartados ^12, uma técnica também usada por Boyle et ai . ⁹ Estes protocolos previamente publicados exigem a prática de lavagem da medula óssea, uma prática tedioso, que também introduz o risco de um ferimento por picada de agulha e perda de medula óssea valiosa, pois é necessário cortar ambas as extremidades do osso. O protocolo, que descrevemos, implementa a utilização de um almofariz e pilão para isolar os osteoclastos, que é semelhante ao processo de isolamento descrito por macrófagos Weischenfeldt et al ^15.

A nossa experiência, contudo, é que o isolamento dos osteoclastos e da cultura in vitro usando técnicas de resultados anteriormente publicados nos resultados variáveis ​​em termos de produção de osteoclastos, muitas vezes resultandona impossibilidade de cultivar osteoclastos. Por conseguinte, temos desenvolvido um protocolo que permite o isolamento consistente de medula óssea de ratinho para produzir um grande número de osteoclastos in vitro, multinucleadas, com um rendimento aproximado de 70-80% das células plaqueadas inicialmente formando macrófagos e, subsequentemente, osteoclastos, na presença de meio de indução de osteoclastos.

Protocolo

NOTA: Declaração de Ética: Toda pesquisa envolvendo animais vertebrados foi realizada em termos dos protocolos aprovados pelo Painel Administrativo Stanford em Laboratory Animal Care (APLAC).

1. Preparação

1. Permitir 10 ml de disponíveis comercialmente meios de separação de gradiente de densidade celular (que contém polissacarose e diatrizoato de sódio, ajustada a uma densidade de 1,077 g / ml) de vir até à temperatura ambiente num tubo de 50 ml.
2. Prepare a citometria de fluxo (FACS) com tampão fosfato solução salina tamponada 1x (PBS) e 2% de soro fetal de vitelo (FCS). Tomar uma aliquota de 50 ml e manter esta aliquota à temperatura ambiente para uso durante o passo de gradiente de densidade media de separação de células.
3. Possui um balde de gelo pronto para manter o tecido isolado e em células durante o procedimento de isolamento.

2. Prepare Meios de Cultura

1. Prepare meios basais: MEM (Meio Essencial Mínimo), sem vermelho de fenol (500 ml), glutamato (1x), FCS (10x), 10.000 unidades / ml penicillin (1x).
2. Filtre meio basal com um filtro de 0,22 um.
3. Prepare osso mídia indução de macrófagos de medula:
   1. Introduzir 50 ml de mídia basais preparada no passo 2.1.
   2. Adicionar prostaglandina E2 (PGE2, Sr. 352,465 g / mol) a 10 ^-7 M de concentração final.
   3. Adicionar Macrophage Colony-Stimulating Factor (M-CSF) a 10 ng / ml.
   4. Não filtrar a solução final de macrófagos da medula óssea estimulando mídia.
4. Prepare a mídia de indução de osteoclastos:
   1. Introduzir 50 ml de mídia basais preparada no passo 2.1.
   2. Adicionar prostaglandina E2 (PGE2, Sr. 352,465 g / mol) a 10 ^-7 M concentração final
   3. Adicionar Macrophage Colony-Stimulating Factor (M-CSF) a 10 ng / ml.
   4. Adicionar RANKL a 10 ng / ml.
   5. Não filtrar a solução final dos meios de comunicação de indução dos osteoclastos.

3. Isolamento de Medula Óssea

1. Euthanize um C57BL / 6 do mouseutilizando o método de inalação de dióxido de carbono, seguido por deslocação cervical.
   NOTA: Os roedores devem ser sacrificados por pessoal treinado usando técnica adequada, equipamentos e agentes.
2. Posicione e fixe o mouse em uma placa de dissecação e pulverize com álcool 70%.
3. Dissecar os fémures, tíbias, úmeros e coluna vertebral.
   1. Comece com o mouse na posição supina. Realizar uma incisão na vertical ao longo do membro inferior e começar por dissecação ao longo do comprimento do fémur e da tíbia dividindo anexos tecidos moles. Finalmente, deslocar ossos da articulação do joelho e do quadril para liberar ossos totalmente a partir do esqueleto.
   2. Avance para fazer uma incisão ao longo do comprimento do membro superior para isolar o úmero. Deslocar o úmero no ombro e cotovelo dissecando fixação capsular tecidos moles.
   3. Finalmente, vire o mouse sobre, para que o mouse se encontra propenso. Adicione uma incisão na pele ao longo do comprimento da coluna vertebral, na linha média. Observe a paravertebral suavetecido de cada lado da coluna vertebral e inciso ao longo da borda óssea da coluna vertebral, dissecando através da massa do tecido mole paravertebral. Utilizando uma tesoura, fazer um corte horizontal ao longo da coluna vertebral, na base do pescoço, e no final da coluna vertebral, apenas proximal para a inserção da cauda, ​​libertando a coluna vertebral de fixação do tecido mole.
4. Uma vez que os ossos são colhidas, mantê-los em tampão de FACS em gelo.
5. Use lenço de papel para limpar o músculo e tecido macio a partir dos ossos.
6. Colocar os ossos limpos em um pilão e almofariz com 3 ml de tampão de FACS.
7. Esmagar os ossos delicadamente no pilão.
8. Aspirar o fluido manchada de sangue e transferência para um tubo cónico de 50 ml fazendo passar a solução através de um filtro de células de 70 mm.
9. Adicionar 5 ml de tampão de FACS para o osso esmagado e esmagar ainda mais. Mais uma vez, remover o fluido, utilizando uma pipeta e transferir para o tubo de 50 ml através de uma peneira de 70? M.
10. Normalmente esmagar o twi ossosce a três vezes em tampão de SCAF fresco, utilizando um almofariz e pilão, cada vez que a adição de mais 5 ml de tampão FACS fresco, até que o fluido não mancha vermelha.
11. Centrifuga-se a solução de medula óssea a 200 xg durante 5 min a 4 ° C, para produzir um sedimento celular.

4. Separação Gradiente de Células da Medula Óssea

1. Aspirar o sobrenadante e ressuspender em 10 ml de tampão FACS (mantido à temperatura ambiente).
2. Tirar o tubo de 50 ml contendo 10 ml de meios de comunicação disponíveis comercialmente separação de gradiente de densidade celular (RT).
3. A camada de solução de medula óssea para a mídia de separação celular gradiente de densidade. Faça isto lentamente usando uma pipeta elétrica. Ângulo a ponta da pipeta contra a superfície interior, perto da parte superior do tubo cónico e inclinar o tubo cónico de cerca de 30 °. Usando uma configuração de baixa velocidade na pipeta, expulsar suavemente a solução de medula óssea, de modo a não perturbar os meios de separação de células por gradiente de densidade.
   NOTA: Em última análise, haveráser uma definição clara entre as duas soluções (solução celular e solução de mídia de separação de células em gradiente de densidade).
4. Utilizando uma centrífuga RT, centrifugar os meios de separação de gradiente de densidade das células e solução de células em uma centrífuga equilibrada a 200 xg durante 15 min. Além disso, remover a aceleração e desaceleração na centrífuga para garantir a separação de fases adequada utilizando o gradiente de densidade de gradiente de meios de separação de células.
5. Após centrifugação, aspirar para fora da camada intermédia nebulosa que contém as células da medula óssea de interesse.
6. Transferir essas células para um novo tubo cónico. Adicionar 20 ml de tampão FACS adicional (mantidos em gelo) para lavar as células.
7. Centrifugar a 200 xg durante 5 min a 4 ° C, para produzir um sedimento celular.
8. Ressuspender o sedimento final de células em 1 ml de macrófago estimulador meios de comunicação para permitir a contagem de células utilizando um hemocitómetro.

Contando 5. celular

1. Tomar 10 ul da solução de células e misturarcom 10 ul de azul de tripano. Carga de 10 ul da mistura resultante para um hemocitómetro e obter a contagem de células por ml de solução.

A cultura 6. celular

1. Coloque 2 ml de meio de estimulação de macrófagos em cada poço de uma placa de 24 poços.
2. Adicionar 200.000 células de cada poço.
   NOTA: Em nossa experiência, densidade de células-revestimento é um dos requisitos mais importantes para o adequado cultivo in vitro dos osteoclastos.
3. Agitar suavemente a placa e colocar numa incubadora normal a 37 ° C.
4. Não altere os meios de comunicação durante 3 dias.
5. Após 3 dias em media macrófagos estimulante, mudar a mídia para mídia osteoclastos.
6. A partir de agora, alterar a mídia diariamente por 5-7 dias, altura em que, grande, osteoclastos multinucleados devem ser visíveis na placa de cultura.

7. A coloração com fosfatase ácida tartarato resistente (TRAP)

1. Depois de 5-7 dias de in vitro cultura, aspirar a mídia da cultura também.
2. Lavar os poços cuidadosamente com 1x PBS três vezes.
3. Fixar as células por adição de solução de paraformaldeído a 4% e deixar durante 1 hora a 4 ° C.
4. Durante este tempo, preparar a mancha TRAP (que está comercialmente disponível) por pré-aquecimento a 37 ° C.
5. Depois de 1 hora em paraformaldeído, aspirar fora paraformaldeído e lavar cuidadosamente 3 vezes com PBS 1x.
6. Adicionar 1 ml de pré-aquecido mancha TRAP em cada poço da placa de serem coradas.
7. Colocar a placa numa incubadora a 37 ° C durante 1 h, protegida da luz.
8. Depois de 1 hora, aspirar fora da mancha TRAP.
9. Lavar os poços três vezes com água desionizada pré-aquecida.
10. Contracorante o bem com hematoxilina de Gill (CUIDADO) para 1-2 min.
11. Osteoclastos imagem usando microscopia de campo claro.
12. Lavar os poços com água desionizada até uma intensidade de cor adequada da mancha é conseguida, normalmente aparecem quando núcleos blue.

8. Osteoclasto reabsorção Ensaio

1. Usar um de 24 poços de poliestireno prato de cultura disponíveis comercialmente que é pré-revestido com qualquer substrato de osso ou um revestimento de fosfato de cálcio cristalino inorgânico.
2. Coloque 2 ml de meio de estimulação de macrófagos em cada poço.
3. Adicionar 200.000 células da medula óssea recentemente isolados obtidos no final da etapa 2 para cada poço.
4. Agitar suavemente a placa antes de colocá-lo em uma incubadora a 37 ° C durante 3 dias.
5. No dia 3, mudar a mídia para mídia diferenciação dos osteoclastos.
6. Realizar mudanças de mídia diários com mídia diferenciação dos osteoclastos por 5-7 dias.

9. Quantificação de reabsorção de osteoclastos de Actividade

1. Após 5-7 dias de cultura in vitro em meios de diferenciação dos osteoclastos sobre um substrato mineralizada, analisar a superfície mineralizada, como descrito abaixo, para avaliar a capacidade dos osteoclastos para formar resorptiem poços, um indicador da atividade osteoclástica.
2. Aspirar a partir de meios de comunicação a placa de ensaio a reabsorção e adicionar 100 ul de solução de lixívia a 10% a cada poço.
3. Incubar as células com a solução de lixívia a 10% durante 15 min à TA.
4. Lavar os poços três vezes com água destilada.
5. Aspirar fora de todo o restante da água e sacuda o excesso de água da placa e deixar secar ao ar para 5/3 horas.
6. Contracoloração a placa com um kit de coloração de Von Kossa disponível comercialmente para permitir a fácil visualização do substrato reabsorvido-un.
7. Use microscopia de campo claro de tomar imagens de peças representativas da superfície reabsorvida.
8. Usando software de análise de imagem, calcule a percentagem da superfície reabsorvida para permitir a quantificação da atividade de reabsorção osteoclástica.

Resultados

O objectivo deste método foi isolar facilmente um grande número de osteoclastos in vitro, tipicamente em uma semana. Isolamento bem sucedido de um grande número de osteoclastos foi confirmada utilizando a coloração da fosfatase ácida resistente ao tartarato (Figura 1A). Grandes osteoclastos são visualizados como grandes células roxas com múltiplos núcleos (tipicamente ≥ 3 núcleos). Usando este protocolo, é comum para isolar osteoclastos com até 30 núcleos por osteoclastos (Figura 1B).

Discussão

Uma habilidade para isolar facilmente e cultivar um grande número de osteoclastos in vitro tem sido responsável por ajudar a avançar na compreensão da biologia óssea e doenças mediadas por osteoclastos. Foi a identificação de RANKL que levam a este, quando foi recentemente identificado como o principal regulador da formação de osteoclastos, diferenciação e sobrevivência ^{de 16-18.}

Tem sido nossa experiência que o cultivo in vitro de osteoclastos de medula óssea é ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
MEM, sem glutamina, sem vermelho de fenol	Gibco	51200-038
M-CSF, camundongo recombinante	Gibco	PMC2044
camundongo recombinante TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expresso)	D Systems	462-TEC-010
Prostaglandina E2	Sigma-Aldrich
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771
Kit de fosfatase ácida, lecócitos (TRAP)	Sigma-Aldrich	387A
, placas de 24 poços	Corning Life Sciences	3987