मानव प्रेरित स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पन्न पिरामिड न्यूरॉन्स से वृक्ष के समान spines के तीन आयामी मात्रा
Summary
पिरामिड न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान कांटा स्तनधारी मस्तिष्क प्रांतस्था में सबसे उत्तेजक synapses की साइटों रहे हैं। इस विधि को प्रेरित स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पन्न मानव cortical पिरामिड ग्लूटामेटरगिक न्यूरॉन्स में रीढ़ morphologies की एक 3 डी मात्रात्मक विश्लेषण का वर्णन है।
Abstract
वृक्ष के समान कांटा केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में उत्तेजक synapses के बाद synaptic डिब्बों के अनुरूप है कि छोटे उभार कर रहे हैं। वे dendrites साथ वितरित कर रहे हैं। उनकी आकृति विज्ञान neuronal गतिविधि पर काफी हद तक निर्भर है, और वे गतिशील हैं। वृक्ष के समान कांटा उनकी सतह पर और पोस्टअन्तर्ग्रथनी घनत्व के स्तर पर ग्लूटामेटरगिक रिसेप्टर्स (AMPA और NMDA रिसेप्टर्स) व्यक्त करते हैं। प्रत्येक रीढ़ न्यूरॉन स्वतंत्र रूप से अपने राज्य और स्थानीय गतिविधि को नियंत्रित करने के लिए अनुमति देता है। रीढ़ morphologies बड़े पैमाने पर इन विवो दृष्टिकोण और कृंतक ऊतकों से प्राप्त neuronal संस्कृतियों दोनों का उपयोग कर, मस्तिष्क प्रांतस्था के ग्लूटामेटरगिक पिरामिड कोशिकाओं में अध्ययन किया गया है। कृंतक सभ्य न्यूरॉन्स और एक आयामी मात्रात्मक विश्लेषण 1 में दिखाया गया है नयूरोपथोलोगिकल की स्थिति, बदल रीढ़ प्रेरण और परिपक्वता से जुड़ा हो सकता है। वर्तमान अध्ययन मानव cortic का उपयोग कर रीढ़ morphologies की 3 डी मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णनतंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (देर से कॉर्टिकल पूर्वज) से व्युत्पन्न अल न्यूरॉन्स। इन कोशिकाओं को शुरू में प्रेरित स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त किया गया। इस प्रोटोकॉल अलग संस्कृति अवधि में रीढ़ morphologies के विश्लेषण की अनुमति देता है, और मानसिक बीमारियों के साथ रोगियों से प्राप्त उन लोगों के साथ नियंत्रण व्यक्तियों से प्राप्त प्रेरित स्टेम कोशिकाओं के बीच संभव तुलना के साथ।
Introduction
कॉर्टिकल पिरामिड न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान कांटा कृंतक, रहनुमा, और मानव मस्तिष्क में इन न्यूरोनल उपप्रकार के बेसल और शिखर dendrites के साथ वितरित कर रहे हैं, जो छोटे और पतले उभार कर रहे हैं। वे सबसे उत्तेजक synapses की साइटों रहे हैं और सीखने और संज्ञानात्मक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण कार्यों प्रदर्शित करते हैं। मानव वृक्ष के समान कांटा की विस्तृत संरचनाओं तकनीकी रूप से इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 2 से अध्ययन किया गया है। हालांकि, इस तरह के दृष्टिकोण से समय लेने वाली है और भारी काम का बोझ का प्रतिनिधित्व करता है। हाल ही में, वृक्ष के समान कांटा की आकृति विज्ञान की एक तीन आयामी (3 डी) पुनर्निर्माण बड़े मैनुअल रीढ़ विश्लेषण 3 करने के लिए संयुक्त विशेष सॉफ्टवेयर का उपयोग मानव मस्तिष्क प्रांतस्था में सूचना दी गई है।
इम्यूनोफ्लोरेसेंस करने के लिए मिलकर हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP) तकनीक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा रीढ़ की पहचान और आकार माप के लिए एक सटीक उपकरण प्रतिनिधित्व करता है। यह दृष्टिकोण आसानी से सभ्य न्यूरॉन्स के लिए लागू किया जा सकता है। होवेदेखें, कोई डेटा प्रेरित स्टेम कोशिकाओं (IPSC) से व्युत्पन्न मानव न्यूरॉन्स पर रीढ़ परिपक्वता और आकृति विज्ञान के विश्लेषण पर सूचना दी गई है।
इस अध्ययन का उद्देश्य इन विट्रो में सुसंस्कृत मानव न्यूरॉन्स से वृक्ष के समान रीढ़ इमेजिंग की अनुमति देता है जो एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए किया गया था। Imaris सॉफ्टवेयर का रेशा अनुरेखक मॉड्यूल के साथ GFP लेबलिंग, confocal माइक्रोस्कोपी और 3 डी विश्लेषण वर्तमान प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया। द्वितीय तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं से चतुर्थ (एनएससी) के लिए परतों के cortical ग्लूटामेटरगिक न्यूरॉन्स प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं कि संस्कृति कदम भी यहाँ वर्णित संक्षेप में कर रहे हैं। मानव एनएससी उत्पादन के लिए पूरे प्रोटोकॉल पहले से ही कहीं 4 प्रकाशित किया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
पिरामिड न्यूरॉन्स की आकृति विज्ञान की मात्रा का ठहराव सॉफ्टवेयर पर भरोसा किया। रेशा अनुरेखक इंटरफेस न्यूरॉन्स और कांटा के विभाजन के लिए इस्तेमाल किया गया था, और एक्सटी मॉड्यूल उनके विश्लेषण के लिए इ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the Institut Pasteur, the Bettencourt-Schueller foundation, Centre National de la Recherche Scientifique, University Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), the Conny-Maeva Charitable Foundation, the Cognacq Jay Foundation, the Orange Foundation, and the Fondamental Foundation. L.G. is supported by an undergraduate fellowship from the Health Ministry. We acknowledge the help of BitPlane in particular Georgia Golfis, in the early stage of this work.
Materials
| PD-PBS (1X), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red | Gibco/ Life Technologies | 14190169 | |
| Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent | Sigma Aldrich | P4957 | |
| Mouse laminin | Dutscher Dominique | 354232 | |
| N2 Supplement | Gibco/ Life Technologies | 17502048 | |
| B-27 Supplement w/o vit A (50X) | Gibco/ Life Technologies | 12587010 | |
| DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I | Gibco/ Life Technologies | 31331028 | |
| Neurobasal Med SFM | Gibco/ Life Technologies | 21103049 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco/ Life Technologies | 31350-010 | |
| Pen-Steptomycin | Gibco/ Life Technologies | 15140-122 | |
| GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody | Gibco/ Life Technologies | A-6455 | |
| Horse serum | Gibco/ Life Technologies | 16050130 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit | Gibco/ Life Technologies | A11034 | |
| Polyclonal Anti-betaIII tubulin antibody | Millipore | AB9354 | |
| Coverglass 13 mm | VWR | 631-0150 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent avec DAPI | Gibco/ Life Technologies | P36931 | |
| Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid | Sigma Aldrich Chimie | P7949 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich Chimie | X100-100ML | |
| Human Fibroblasts | Coriell Cell Line Biorepository | GM 4603 and GM 1869 | Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss (Germany) | LSM 700 | |
| Imaris Software | Bitplane AG, Zurich | 6.4.0 version | Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary |
| Huygens Software | Huygens software, SVI, Netherlands | Pro version | Optional (for deconvolution testing) |
Referências
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