Artigo de método

Perturbação Anti-virulenta de patogênicos biofilmes usando Engineered Quorum para saciar a Lactonases

DOI:

10.3791/53243

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1 de janeiro de 2016

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1Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, 2Department of Chemistry, University of Utah, 3Synthetic Biology Research Consortium, National University of Singapore

Neste artigo

Resumo

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As enzimas de extinção de quórum são opções antivirulentas e antibacterianas que podem mitigar a patogênese sem risco de incorrer em resistência, impedindo a expressão de fatores de virulência e genes associados à resistência a antibióticos e à formação de biofilme. Neste estudo, relatamos um método que demonstra a eficácia das enzimas de extinção de quorum na ruptura do biofilme bacteriano.

Resumo

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O rápido surgimento de bactérias multirresistentes acelerou a necessidade de novas abordagens terapêuticas para combater infecções com risco de vida. A persistência da infecção bacteriana é frequentemente associada à formação de biofilme mediada por detecção de quórum. Assim, a ruptura desse circuito de sinalização apresenta uma estratégia anti-virulência atraente. As lactonases de extinção de quorum foram relatadas como disruptoras eficazes dos circuitos de detecção de quorum. No entanto, houve muito poucos relatos do uso efetivo dessas enzimas na interrupção da formação de biofilme bacteriano. Este protocolo descreve um método para interromper a formação de biofilme em uma cepa S1 de A. baumannii clinicamente relevante por meio do uso de uma lactonase de extinção de quorum projetada. Acinetobacter baumannii é um importante patógeno humano implicado em infecções hospitalares graves em todo o mundo e sua virulência é atribuída predominantemente à tenacidade de seu biofilme. O tratamento com lactonase projetada alcançou uma redução significativa do biofilme de A. baumannii S1. Este estudo também mostrou a possibilidade de usar enzimas de extinção de quorum projetadas no tratamento futuro de doenças bacterianas mediadas por biofilme. Por fim, o método pode ser usado para avaliar a competência de enzimas promissoras de extinção de quórum.

Introdução

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As opções de tratamento para doenças infecciosas tem sido complicada pelo aumento rápido em bactérias resistentes a múltiplas drogas que são imunes a uma vasta gama de medicamentos antibióticos 1. Com alta morbidade e mortalidade por infecções de bactérias resistentes mediadas, há uma necessidade de aumentar os processos de desenvolvimento de medicamentos e / ou explorar alternativas melhores anti-bacterianos para melhorar as opções terapêuticas. Ultimamente, a abordagem anti-virulência está ganhando o interesse dado o seu potencial na prevenção de virulência por métodos de não bactericidas, portanto, reduzir os riscos de mecanismos de resistência 2.<....

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Protocolo

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1. Cristal Violeta quantificação da formação do biofilme em A. baumannii S1

  1. Crescer uma cultura de 5 ml de A. baumannii S1 em caldo Lisogenia (LB) (triptona 10 g / L, extracto de levedura 5 g / L) a 30 ° C numa incubadora com agitação (220 rpm) durante 16 horas.
  2. Ajustar a cultura de A. baumannii S1 para uma densidade óptica desejada 600 de 0,8. Usando uma placa de 96 poços, a cultura das bactérias inocular (1: 100 de diluição) em LB fresco contendo 10 ul de enzima purificado GKL (40 mg / ml); volume final da nova cultura é de 100 uL.
  3. Prepara-se uma cultura de controlo, bem; Isto não irá con....

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Resultados

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Na quantificação experimento de cristal violeta, duas enzimas quórum para saciar foram usadas para demonstrar viabilidade em perturbar a formação de biofilme: wild-type GKL e um melhorada GKL mutante duplo (E101G / R230C). Ambas as enzimas foram mostrados para demonstrar actividade contra lactonase 3-hidroxi-decanoil-L-homo-serina lactona (3-OH C-10 -HSL), a principal molécula de quorum utilizados por A. baumannii S1 14. Para avaliação válida do bi.......

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Discussão

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Em ambos os conjuntos de experiência, A. baumannii S1 foi cultivada em meio LB sem NaCl como uma concentração elevada de sal pode reduzir a quantidade de biofilme formado pelas bactérias 15. A presença de tal artefacto pode subestimar a quantidade de biofilme formado, bem como os efeitos de enzimas de têmpera de quorum em diferentes condições de tratamento. O uso de uma enzima cataliticamente inactivo é importante como um controlo negativo para eliminar os possíveis efeitos de sequestro de enzima.

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado por doações do Fundo de Pesquisa Acadêmica do Ministério da Educação, do Conselho Nacional de Pesquisa Médica e da Fundação Nacional de Pesquisa de Cingapura.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Triptona ExtratoBD 211705
BD212750
Placa de 96 poçosCostar3596
Cristal VioletaSigma-AldrichC6158
Ácido AcéticoLab-ScanPLA00654XCuidado: Inflamável
μ-PratoIbidi80136
Alex Fluo 488-conjugado WGAInvitrogenW11261
Hank ' s solução salina balanceada Invitrogen141475095
FormaldeídoSigma-AldrichF8775Cuidado: Corrosivo 
Leitor de Microplacas Synergy HTBioTek
1X-81 Microscópio de Fluorescência InvertidaOlympus
de Levedura

Referências

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  1. Alanis, A. J. Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era? Archives of medical research. 36, 697-705 (2005).
  2. Cegelski, L., Marshall, G. R., Eldridge, G. R., Hultgren, S. J. The biology and future prospects of antivirulence therapies. Na....

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Etiquetas

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