Perturbação Anti-virulenta de patogênicos biofilmes usando Engineered Quorum para saciar a Lactonases

Resumo

As enzimas de extinção de quórum são opções antivirulentas e antibacterianas que podem mitigar a patogênese sem risco de incorrer em resistência, impedindo a expressão de fatores de virulência e genes associados à resistência a antibióticos e à formação de biofilme. Neste estudo, relatamos um método que demonstra a eficácia das enzimas de extinção de quorum na ruptura do biofilme bacteriano.

Resumo

O rápido surgimento de bactérias multirresistentes acelerou a necessidade de novas abordagens terapêuticas para combater infecções com risco de vida. A persistência da infecção bacteriana é frequentemente associada à formação de biofilme mediada por detecção de quórum. Assim, a ruptura desse circuito de sinalização apresenta uma estratégia anti-virulência atraente. As lactonases de extinção de quorum foram relatadas como disruptoras eficazes dos circuitos de detecção de quorum. No entanto, houve muito poucos relatos do uso efetivo dessas enzimas na interrupção da formação de biofilme bacteriano. Este protocolo descreve um método para interromper a formação de biofilme em uma cepa S1 de A. baumannii clinicamente relevante por meio do uso de uma lactonase de extinção de quorum projetada. Acinetobacter baumannii é um importante patógeno humano implicado em infecções hospitalares graves em todo o mundo e sua virulência é atribuída predominantemente à tenacidade de seu biofilme. O tratamento com lactonase projetada alcançou uma redução significativa do biofilme de A. baumannii S1. Este estudo também mostrou a possibilidade de usar enzimas de extinção de quorum projetadas no tratamento futuro de doenças bacterianas mediadas por biofilme. Por fim, o método pode ser usado para avaliar a competência de enzimas promissoras de extinção de quórum.

Introdução

As opções de tratamento para doenças infecciosas tem sido complicada pelo aumento rápido em bactérias resistentes a múltiplas drogas que são imunes a uma vasta gama de medicamentos antibióticos ^1. Com alta morbidade e mortalidade por infecções de bactérias resistentes mediadas, há uma necessidade de aumentar os processos de desenvolvimento de medicamentos e / ou explorar alternativas melhores anti-bacterianos para melhorar as opções terapêuticas. Ultimamente, a abordagem anti-virulência está ganhando o interesse dado o seu potencial na prevenção de virulência por métodos de não bactericidas, portanto, reduzir os riscos de mecanismos de resistência ^2.

Quorum-sensing é um "interruptor mestre" na virulência bacteriana e interrupção desse fenômeno sinalização é um método anti-virulência promissora contra patogênese ^3. O aparecimento de virulência exige a acumulação de moléculas de quorum no meio extracelular após uma densidade de população bacteriana crítico é atingido. Como quomoléculas rum difundir de volta para a matriz intracelular, a ligação com os seus receptores cognatos conduz à activação de factores de virulência, bem como os genes de resistência a antibióticos associados com a formação de biofilme e ^4. Em geral, a interrupção quorum-sensing envolve inibir a molécula de quorum e interação receptor sem afetar as vias metabólicas primárias. Assim, ele não tem qualquer implicação direta no crescimento celular. Desde aptidão não seja comprometida, não há pressão de seleção mínima para as bactérias a evoluir e ganhar resistência contra tais tratamentos ^5. Além disso, o sensor de quorum-perturbação pode interferir com os mecanismos de protecção bacterianas inerentes, como no caso da formação de biofilme, que fornece protecção de agentes anti-bacterianos e resposta imune do hospedeiro.

Estima-se que 99% dos micróbios da Terra existir em matrizes de biofilme complexo semelhante, conferindo sobrevivência vantagens cruciais para os microrganismos que vivem dentro thestruturas ese ^6. Mais importante, a formação destes domínios sésseis é a causa de infecções hospitalares mais persistentes e crônicas ^7. Acinetobacter baumannii é um dos principais patógenos humanos que está associado a infecções hospitalares globais e sua virulência é largamente atribuído à quorum-sensing a formação de biofilme mediada ^8. Enzimas de têmpera de quorum foram usados ​​com sucesso na interrupção de transdução de sinal mediada por quorum destinada a um grupo de compostos conhecidos como N-acil homoserina lactonas (AHLs) que são produzidos por bactérias gram-negativas ^9. Vários estudos também expandiu o uso destas enzimas para bloquear patogênese bacteriana através da redução dos números de expressão fator de virulência e de células em biofilmes ^10,11. Infelizmente, ainda há uma falta de demonstração palpável da utilização eficaz de enzimas para saciar quórum contra a formação de biofilme por patógenos bacterianos. ore têm sido as tentativas de usar inibidores de quórum (análogos de AHL), em vez de enzimas quórum para saciar, para perturbar A. baumannii formação de biofilme ^12. Embora este método de utilização de inibidores de moléculas pequenas é uma aproximação válida, mantendo a sua biodisponibilidade em utilizações de translação pode ser um desafio. Pelo contrário, a utilização de enzimas de têmpera de quorum catalíticos pode contornar o problema de biodisponibilidade como enzimas são mais favorável no sentido de imobilização em superfícies de dispositivos biomédicos para efeitos terapêuticos.

Aqui, descrevemos uma avaliação dos efeitos da lactonases para saciar quórum engenharia de Geobacillus kaustophilus (GKL) ¹³ sobre a formação de biofilme bacteriano, utilizando a coloração violeta cristal e microscopia confocal de varredura a laser (CLSM). Este estudo é a primeira demonstração bem sucedida de biofilme interrupção em um A. clinicamente relevante estirpe baumannii S1 usando enzimas de quórum para saciar. Os métodos descritosneste estudo são úteis para avaliar a eficácia de outras enzimas para saciar quórum nos esforços de desenvolvimento terapêuticas posteriores contra bactérias Gram-negativas patogénicas.

Protocolo

1. Cristal Violeta quantificação da formação do biofilme em A. baumannii S1

1. Crescer uma cultura de 5 ml de A. baumannii S1 em caldo Lisogenia (LB) (triptona 10 g / L, extracto de levedura 5 g / L) a 30 ° C numa incubadora com agitação (220 rpm) durante 16 horas.
2. Ajustar a cultura de A. baumannii S1 para uma densidade óptica desejada ₆₀₀ de 0,8. Usando uma placa de 96 poços, a cultura das bactérias inocular (1: 100 de diluição) em LB fresco contendo 10 ul de enzima purificado GKL (40 mg / ml); volume final da nova cultura é de 100 uL.
3. Prepara-se uma cultura de controlo, bem; Isto não irá conter qualquer enzima. Repetir condições semelhantes, para se obter o número desejado de repetições.
4. Cobrir a placa com uma tampa e colocá-lo num recipiente de 10 L de plástico selado. Incubar a placa a 30 ° C durante 3 h antes de remover suavemente a mídia.
5. Adicionar mais 100 mL de meio LB fresco para o poço e incubar a placa durante 21 horas a 30 ° C.
6. Após o segundo período de incubação, remova cuidadosamente todos os meios de comunicação. Lavar a célula bactérias planctônicas com 200 mL de água estéril. Assegure-se que existe apenas uma perturbação mínima para as células durante a lavagem.
7. Adicionar 100 uL de solução de violeta de cristal a 1% a cada poço e incubar durante 15 min à temperatura ambiente. Remover a solução de cristal violeta por lavagem do poço com 200 ul de água estéril. Repita a lavagem por mais duas vezes.
8. Adicionar 100 ul de ácido acético a 33% a cada poço e incubar durante 15 min com agitação suave; isto irá dissolver o corante.
9. Quantificar a quantidade de biofilme formado através da medição da absorvância de cristal violeta a 600 nm. A quantidade de cristal violeta é proporcional à quantidade de biofilme formado.

2. Confocal Laser Scanning Microscopy de A. baumannii S1 biofilme

1. Crescer uma cultura de 5 ml de A. baumannii S1 em LB a 30 ° C numa incubadora com agitação (220 rpm) durante 16 horas.
2. de Anúnciosapenas a cultura de A. baumannii S1 para uma densidade óptica desejada ₆₀₀ de 0,8. Usando um 35 mm μ-lavar com fundo de vidro, inocular a cultura de bactérias (diluição 1: 100) em LB fresco contendo 30 ul de enzima purificado GKL (40 mg / ml); volume final da nova cultura é de 1 ml.
3. Cubra o μ-Prato com uma tampa e coloque-o em um recipiente de 10 L de plástico selado. Incubar a μ-louça a 30 ° C durante 3 horas antes de remover suavemente a mídia. Adicionar 30 ul de enzima purificado e GKL meio fresco, trazê-lo para um volume total de 1 ml. Incubar durante mais 21 h a 30 ° C.
4. Repetir o passo 2.3 e incubar o μ-Dish durante mais 24 h a 30 ° C. Em seguida, retire cuidadosamente a mídia.
5. Adicionar 500 uL de 5 ug / ml de Alex Fluo-488 conjugado com aglutinina de gérmen de trigo (WGA), dissolvido em solução salina equilibrada de Hank (HBSS) para o prato e μ-incubar a 37 ° C durante 30 min; isto irá manchar o biofilme formado. Remover a solução de coloração e lavá tele u-Dish com 2 ml de HBSS. Repetir o passo de lavagem mais uma vez.
6. Adicionar 500 ul de 3,7% de formaldeído dissolvido em HBSS e incubar a 37 ° C durante 30 min; isso vai resolver o biofilme para a μ-Dish. Lave o μ-Dish uma vez com 2 ml de HBSS e depois remover a solução completamente. O prato fixo-μ com biofilme pode ser armazenada no escuro a 4 ° C antes da imagiologia CLSM.
7. Para imagens CLSM e análise, usar 63 vezes de ampliação para gerar 97 pilhas por imagem, com um intervalo de 0,21 mm por pilha.

Resultados

Na quantificação experimento de cristal violeta, duas enzimas quórum para saciar foram usadas para demonstrar viabilidade em perturbar a formação de biofilme: wild-type GKL e um melhorada GKL mutante duplo (E101G / R230C). Ambas as enzimas foram mostrados para demonstrar actividade contra lactonase 3-hidroxi-decanoil-L-homo-serina lactona (3-OH _C-10 -HSL), a principal molécula de quorum utilizados por A. baumannii S1 ^14. Para avaliação válida do bi...

Discussão

Em ambos os conjuntos de experiência, A. baumannii S1 foi cultivada em meio LB sem NaCl como uma concentração elevada de sal pode reduzir a quantidade de biofilme formado pelas bactérias ^15. A presença de tal artefacto pode subestimar a quantidade de biofilme formado, bem como os efeitos de enzimas de têmpera de quorum em diferentes condições de tratamento. O uso de uma enzima cataliticamente inactivo é importante como um controlo negativo para eliminar os possíveis efeitos de sequestro de enzima.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Triptona	Extrato	BD 211705
	BD	212750
Placa de 96 poços	Costar	3596
Cristal Violeta	Sigma-Aldrich	C6158
Ácido Acético	Lab-Scan	PLA00654X	Cuidado: Inflamável
μ-Prato	Ibidi	80136
Alex Fluo 488-conjugado WGA	Invitrogen	W11261
Hank ' s solução salina balanceada	Invitrogen	141475095
Formaldeído	Sigma-Aldrich	F8775	Cuidado: Corrosivo
Leitor de Microplacas Synergy HT	BioTek
1X-81 Microscópio de Fluorescência Invertida	Olympus

de Levedura