Introduction
Behandlungsmöglichkeiten für Infektionskrankheiten durch die rasche Zunahme der Multidrug-resistenten Bakterien, die immun gegen ein breites Spektrum von Antibiotika 1 sind kompliziert. Mit hoher Morbidität und Mortalität von resistenten Bakterien-vermittelte Infektionen, gibt es einen Bedarf an Arzneimittelentwicklungsprozesse zu eskalieren und / oder entdecken bessere antibakterielle Alternativen Therapiemöglichkeiten zu verbessern. In letzter Zeit wird die anti-Virulenz Ansatz gewinnen an Interesse gegeben sein Potenzial bei der Verhinderung von Virulenz über nicht bakterizide Methoden, damit Minderung der Risiken der Resistenzmechanismen 2.
Quorum-Sensing ist ein "Hauptschalter" in bakteriellen Virulenz und Störung dieses Signal Phänomen ist eine vielversprechende anti-Virulenz Verfahren gegen Pathogenese 3. Der Beginn der Virulenz erfordert die Ansammlung von Quorum-Moleküle in der extrazellulären Umgebung, nachdem ein kritischer bakterielle Bevölkerungsdichte erreicht ist. Wie quorum Moleküle diffundieren in die intrazelluläre Matrix, die Bindung mit ihren verwandten Rezeptoren führt zur Aktivierung von Virulenzfaktoren sowie Gene mit Antibiotikaresistenz und Biofilmbildung 4 verbunden. Im Allgemeinen Quorum-Sensing-Störung beinhaltet Hemmung Quorum Molekül und Rezeptor-Wechselwirkung, ohne die primären Stoffwechselwege. Daher spielt es keine direkten Auswirkungen auf das Zellwachstum. Da Fitness nicht beeinträchtigt wird, es eine minimale Selektionsdruck für Bakterien zu entwickeln und zu erhalten Widerstand gegen solche Behandlungen 5. Zusätzlich kann ein Quorum-sensing Störung mit inhärenten Bakterienschutzmechanismen interferieren, wie im Fall der Bildung von Biofilmen, die Schutz gegen antibakterielle Mittel bereitstellt und Wirt-Immunantworten.
Es wird geschätzt, dass 99% der Mikroben auf der Erde existieren in komplexen Biofilm artigen Matrizes verleih entscheidende Lebensvorteil für die lebenden Mikroorganismen innerhalb these Strukturen 6. Noch wichtiger ist, ist die Bildung dieser sessile Domains die Ursache der hartnäckigsten und chronischer Krankenhausinfektionen 7. Acinetobacter baumannii ist eine der wichtigsten menschlichen Krankheitserreger, die mit der globalen Krankenhausinfektionen verbunden ist und dessen Virulenz ist weitgehend auf die Quorum-Sensing zurückzuführen vermittelte Biofilmbildung 8. Quorum-Abschrecken Enzyme erfolgreich in stören Quorum-vermittelte Signaltransduktion durch gezielt eine Gruppe von Verbindungen, wie N-Acyl Homoserinlactone (AHLs), die von Gram-negativen Bakterien 9 sind bekannt dafür verwendet worden. Mehrere Studien haben auch von der Verwendung dieser Enzyme erweitert, um bakterielle Pathogenese durch die Reduktion von Virulenzfaktor Expression und Zellzahlen in Biofilmen 10,11 blockieren. Leider gibt es nach wie vor ein Mangel an greifbaren Beweis für die effektive Nutzung von Quorum-Abschrecken Enzyme gegen die Biofilmbildung durch bakterielle Erreger. dasre es Versuche, Quorum-Inhibitoren (AHL-Analoga), anstelle von Quorum-Abschrecken Enzyme verwenden, um A. zu stören baumannii Biofilmbildung 12. Obwohl diese Methode der Verwendung von kleinen Molekülen Inhibitoren ist ein gültiger Ansatz können erhalt seine Bioverfügbarkeit in der translationalen Verwendungen eine Herausforderung sein. Im Gegenteil könnte die Verwendung von katalytischen quorum Abschrecken Enzyme die Bioverfügbarkeit Problem zu umgehen, wie Enzyme sind empfänglicher gegen Immobilisierung an Oberflächen von biomedizinischen Vorrichtungen für therapeutische Wirkungen.
Hier beschreiben wir eine Bewertung der Auswirkungen von gentechnisch Quorum lösch Lactonasen von Geobacillus kaustophilus (GKL) 13 auf bakterielle Biofilmbildung, mit Kristallviolett-Färbung und konfokaler Laser Scanning Mikroskopie (CLSM). Diese Studie ist die erste erfolgreiche Demonstration von Biofilm Störung in einem klinisch relevanten A. baumannii S1-Stamm unter Verwendung Quorum lösch Enzyme. Beschriebenen Verfahrenin dieser Studie sind nützlich für die Beurteilung der Wirksamkeit anderer quorum Abschrecken Enzyme in nachfolgenden therapeutischen Entwicklungsbemühungen gegen pathogene gramnegative Bakterien.
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Protocol
1. Kristallviolett Quantifizierung von Biofilm-Bildung in A. baumannii S1
- Wachsen Sie eine 5-ml-Kultur von A. baumannii S1 in LB-Medium (LB) (Trypton 10 g / L, Hefeextrakt 5 g / L) bei 30 ° C in einem Schüttelinkubator (220 UpM) für 16 Stunden.
- Stellen Sie die Kultur von A. baumannii S1 auf eine gewünschte OD 600 von 0,8 auf. Verwendung eines 96-Well-Platte, zu inokulieren Bakterienkultur (1: 100 Verdünnung) in frisches LB, das 10 & mgr; l gereinigtes GKL-Enzym (40 mg / ml); Endvolumen der neuen Kultur ist 100 ul.
- Bereiten Sie eine Kontrollkultur als auch, Dies hat jedoch keinerlei Enzym enthalten. Wiederholen ähnlichen Bedingungen, um die gewünschte Anzahl an Wiederholungen ergeben.
- Die Platte mit einem Deckel und legen Sie sie in einem verschlossenen 10 l Kunststoffbehälter. Die Platte bei 30 ° C für 3 Stunden, bevor sanft Entfernen der Medien.
- Fügen Sie eine weitere 100 ul frischem LB-Medium zu der Vertiefung und inkubieren Sie die Platte für 21 Stunden bei 30 ° C. Nach der zweiten Inkubationszeit, entfernen Sie vorsichtig alle Medien. Waschen Sie die planktonischen Bakterien-Zelle mit 200 ul sterilem Wasser. Sicherzustellen, dass es nur eine minimale Störung der Zellen während des Waschvorgangs.
- Fügen Sie 100 ul von 1% Kristallviolett-Lösung in jede Vertiefung und Inkubation für 15 min bei RT. Entfernen Sie die Kristallviolett-Lösung durch Waschen der gut mit 200 ul sterilem Wasser. Wiederholen Sie den Waschgang für zwei weitere Male.
- 100 l 33% Essigsäure in jede Vertiefung und inkubieren Sie für 15 min unter leichtem Schütteln; Dies wird den Farbstoff aufzulösen.
- Quantifizieren der Menge des Biofilms durch Messung der Absorption des Kristallviolett bei 600 nm ausgebildet. Die Menge an Kristallviolett, ist proportional zu der Menge an Biofilm gebildet.
2. konfokale Laser Scanning Mikroskopie von A. baumannii S1 Biofilm
- Wachsen Sie eine 5-ml-Kultur von A. baumannii S1 in LB bei 30 ° C in einem Schüttelinkubator (220 UpM) für 16 Stunden.
- Anzeigenur die Kultur von A. baumannii S1 auf eine gewünschte OD 600 von 0,8 auf. Mit Hilfe eines 35-mm-Glasboden μ-Dish, zu impfen die Bakterienkultur (1: 100 Verdünnung) in frischem LB, das 30 & mgr; l des gereinigten GKL Enzym (40 mg / ml); Endvolumen der neuen Kultur ist 1 ml.
- Decken Sie die μ-Dish mit Deckel und legen Sie sie in einem verschlossenen 10 l Kunststoffbehälter. Inkubieren Sie die μ-Dish bei 30 ° C für 3 Stunden, bevor sanft Entfernen der Medien. Werden 30 & mgr; l gereinigtes GKL Enzym und frisches Medium, das bis zu einem Gesamtvolumen von 1 ml zu bringen. Inkubation für weitere 21 h bei 30 ° C.
- Wiederholen Sie Schritt 2.3 und inkubieren Sie die μ-Dish für einen weiteren 24 Stunden bei 30 ° C. Dann entfernen Sie die Medien vorsichtig.
- Gib 500 ul 5 ug / ml Alex Fluo 488 konjugiertem Weizenkeim-Agglutinin (WGA) in Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) mit dem μ-Geschirr gelöst und bei 37 ° C für 30 min; Dies wird das gebildete Biofilm färben. Entfernen Sie die Farblösung und waschen ter u-Teller mit 2 ml HBSS. Wiederholen Sie den Waschvorgang noch einmal.
- Gib 500 & mgr; l von 3,7% igem Formaldehyd in HBSS gelöst und bei 37 ° C für 30 min; Dies wird den Biofilm auf den μ-Dish beheben. Einmal Waschen Sie die μ-Dish mit 2 ml HBSS und entfernen Sie die Lösung vollständig. Die μ-Schale mit Biofilm fixiert kann in der Dunkelheit bei 4 ° C vor dem CLSM Abbildungs gespeichert werden.
- Für CLSM Bildgebung und Analyse sind 63-facher Vergrößerung und 97 Stapel pro Bild mit einem Abstand von 0,21 um pro Stapel zu erzeugen.
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Representative Results
In der Kristallviolett Quantifizierung Experiment wurden zwei Quorum lösch Enzyme verwendet, um Machbarkeit stören Biofilmbildung zu demonstrieren: Wildtyp-GKL und eine verbesserte GKL Doppelmutante (E101G / R230C). Beide Enzyme wurde gezeigt, Lactonase-Aktivität gegen demonstrieren 3-Hydroxy-decanoyl-L-homoserinlacton (3-OH-C 10 -HSL), der Haupt Quorum Molekül von A. verwendet baumannii S1 14. Für gültige Beurteilung der Biofilm Unterbrechung wurden ihre jeweiligen katalytisch inaktiven Enzyme (früher gezeigt, um nicht zu maskieren AHL Liganden) auch als unmittelbarer Kontrollen (GKL D266N-Mutante und GKL E101G / R230C / D266N-Mutante) enthalten. Neben der Verwendung von Wildtyp-A. baumannii S1, der Biofilm bildenden Fähigkeit eines mutierten Δ abai Stamm (AHL-Synthase-defizienten) wurde ebenfalls getestet. Sowohl Quorum lösch Enzyme, Wildtyp-GKL und GKL E101G / R230C Mutante konnte die Biofilmbildung in pre deutlich reduzierenbehandelten A. baumannii S1 Kulturen (n = 10; p-Wert ≤ 0,0001) (Abbildung 1). Dennoch ist der Umfang der Biofilm Unterbrechung für beide Enzyme ist nicht proportional zu ihrer Wirksamkeit gegen 3-OH-C 10 -HSL. Die Umschlagshäufigkeit (k cat) der GKL E101G / R230C Mutante ist sechsmal schneller als Wildtyp-GKL gegen 3-OH-C 10 -HSL 14. Allerdings ist der Unterschied im Ausmaß der Biofilm Störung zwischen den Enzymen nur zweifach.
Abbildung 1. A. baumannii Biofilm Störung Assay. Biofilmbildung wurde durch Kristallviolettfärbung gemessen. Red Spalten stellen die Menge des Biofilms durch Wildtyp A. gebildet baumannii und Δ Abai Mutante, ohne Zusatz von Quorum-Abschrecken Lactonasen. Blaue Säulen stellen den amount von Biofilm durch Wildtyp A. gebildet baumannii in Gegenwart von vier verschiedenen Enzymen GKL: inaktiv GKL D266N-Mutante, Wildtyp-GKL, inaktiv GKL E101G / R230C / D266N-Mutante und GKL E101G / R230C Mutante. ****, P- Wert von ≤ 0,0001. Mit freundlicher Genehmigung von Antimicrobial Agents and Chemotherapy 58 wiedergegeben, 1802-1805 (2014). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Konfokale Bildgebung von A. baumannii S1 Biofilmbildung wurde verwendet, um eine qualitative und quantitative Messung der Quorum-Abschrecken Auswirkungen auf die strukturelle Morphologie dieser sessile Domänen bereitzustellen. Die verbesserte GKL E101G / R230C-Mutante und ihre katalytisch inaktiven Enzyms wurden zum Vergleich verwendet. Das Differenzbild-Kontrast (DIC), zeigte, dass die Behandlung mit dem verbesserten GKL E101G / R230C Mutante führte zu einer Verminderung der Biofilmgröße (Figure 2). Analyse der Fluoreszenz-Bilder zeigten auch, dass es Verringerung der Oberfläche, Biomasse und durchschnittlichen Dicke von Biofilm mit der verbesserten GKL E101G / R230C-Mutante (Tabelle 1) behandelt.
Abbildung 2. Repräsentative konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie-Aufnahmen von A. baumannii Biofilmen. A. baumannii Biofilme wurden mit inaktiven GKL E101G / R230C / D266N-Mutante (A) und GKL E101G / R230C Mutante (B) behandelt und mit Alexa gebeizt Fluor 488-konjugiert WGA. DIC Bilder der Biofilme (links) und Fluoreszenzaufnahmen der Biofilme (rechts) sind für repräsentative xy (Mitte), yz (rechts), und xz (unten) Sektionen gezeigt. Mit freundlicher Genehmigung von Antimicrobial Agents and Chemotherapy <wiedergegebenstrong> 58, 1802-1805 (2014). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Wert ± SD ein | |||
| Eigenschaft | Keine Behandlung | Die Behandlung mit inaktive Mutante | Die Behandlung mit E101G / R230C Mutante |
| Biomasse (& mgr; m 3 / & mgr; m 2) | 2,57 ± 1,65 | 3,39 ± 1,33 | 1,37 ** ± 0,20 |
| Avg Dicke (um) | 3,68 ± 2,51 | 3,41 ± 1,31 | 1.21 ** ± 0,21 |
| Fläche (um) | 235,920.59 ± 79,456.46 | 209,872.6 ± 115,094.7 | 115,354.9 * ± 7,630.3 |
| a n = 10 Bildstapeln. **, P ≤ 0,001; *, P ≤ 0,05, im Vergleich zu einer Behandlung mit inaktiven E101G / R230C / D266N-Mutante. | |||
Tabelle 1 A. baumannii Biofilm Struktur Quantifizierung.
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Discussion
In beiden Sätzen von Experiment A. baumannii S1 wurde in LB-Medium ohne NaCl weise einer hohen Salzkonzentration kann die Menge des Biofilms von den Bakterien 15 ausgebildet reduzieren kultiviert. Das Vorhandensein solcher Artefakt könnte die Menge der Biofilm gebildet, sowie die Auswirkungen der Quorum-Abschrecken Enzyme in verschiedenen Behandlungsbedingungen unterschätzen. Die Verwendung einer katalytisch inaktiven Enzym ist wichtig, da eine negative Kontrolle, die möglichen Effekte der Enzymbindung eliminieren. 1 zeigt, dass, selbst wenn inaktive Enzyme absondern Quorum Molekülen ist die Biofilmbildung nicht gestört wird.
A. baumannii S1 bildet einen zarten ringartige Biofilmstruktur zwischen Luft und Flüssigkeit-Grenzfläche in der Vertiefung der 96-Well-Platte. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, um übermäßige Bewegung während Medienentfernung und Waschschritte zur Entfernung von Neben bakterielle Biofilme verhindern, zu vermeiden. LB-Medium wurde nach jeder Inkubation entferntbeseitigen planktonischen Zellen. Darüber hinaus wurde die Platte mit 96 Vertiefungen in einer 10-l-Kunststoffbehälter gelegt, um Störungen des Luftstroms zu minimieren und eine Mikro anaeroben Umgebung, Biofilmbildung begünstigt erstellen. Biofilm-Quantifizierung in einer 96-Well-Platte ist auch abhängig von der Menge an Kristallviolett in jede Vertiefung gegeben. Im Falle, dass überschüssige Kristallviolett in eine Vertiefung gegeben, kann die Anzahl der Waschschritte erhöht werden. Die Kristallviolettfärbung Experiment liefert einen relativen Vergleich der Quorum-Löscheffizienzen in Biofilm Störung. Obwohl Kristallviolettfärbung ist quantitativ zu messen Biofilmbildung, ist es nur semi-quantitative im Hinblick auf die katalytische Effizienz der Beschlussfähigkeit lösch Enzyme. Zur genauen statistischen Vergleich, ausreichende Fallzahlen sind wichtig für die verschiedenen Behandlungsgruppen. Ausreißer sollten auch entfernt werden, um falsche Darstellung der Ergebnisse zu verhindern.
Konfokale Bildgebung und Analyse der bakteriellen Biofilm ist eine useful für die Beurteilung der qualitativen Auswirkungen der Quorum-Abschrecken Enzyme. Jedoch kann der Prozess der Auswahl Biofilm zur Analyse ein möglicher Kanal für Bias, wenn der Benutzer auf die Art der Quorum-Abschrecken Enzym verabreicht (aktiv oder inaktiv) ist. Um die Möglichkeit der Befangenheit zu vermeiden, kann das Experiment entworfen werden, um Enzym Informationen vom Benutzer auszuschließen oder verwenden Sie einen zufälligen Ansatz zur Auswahl. Eine unvoreingenommene Auswahlstrategie ermöglicht auch eine bessere quantitativen Vergleich der Biofilm Morphologien durch CLSM. Dennoch ist dies die erste Studie, die eine Methode beschreibt, für die Bewertung der Ergebnisse der Quorum-Abschrecken Enzymen auf bakterielle Biofilme. Kristallviolettfärbung hat die Nützlichkeit von Quorum-Abschrecken Enzyme im Biofilm Störung nachgewiesen und gezeigt, dass Enzyme 'modi operandorum nicht zur Verringerung der Zellzahlen und Virulenzfaktor Ausdruck beschränkt. In der Zwischenzeit können morphologische Veränderungen durch CLSM-Analyse bestimmt auch Einblicke in mögliche molecular Ziele dieser Enzyme. Obwohl die aktuelle Experiment wurde entworfen, um die Wirkungen von Enzymen Vorbehandlung auf bakterielle Biofilme zu untersuchen, kann das Protokoll modifiziert werden, um die Enzymwirkung auf vorgeformten Biofilm durch Zugabe des Enzyms nach dem Bakterienwachstum zu beurteilen oder seine Kompetenz unter physiologischen Bedingungen durch die Verwendung von Serum zu untersuchen -ähnlichen Bedingungen für die Kultur. Das zur GKL Enzyme Studienprotokoll kann auf andere Quorum lösch Enzyme und Pathogene verlängert werden, um ihre Beziehung in Biofilm Unterbrechung zu untersuchen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast Extract | BD | 212750 | |
| 96-well plate | Costar | 3596 | |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
| Acetic Acid | Lab-Scan | PLA00654X | Caution: Flammable |
| μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Alex Fluo 488-conjugated WGA | Invitrogen | W11261 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 141475095 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Caution: Corrosive |
| Synergy HT Microplate Reader | BioTek | ||
| 1X-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus |
References
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