Introduction
خيارات العلاج للأمراض المعدية قد تعقدت بسبب الزيادة السريعة في البكتيريا المقاومة للأدوية المتعددة التي هي في مأمن من مجموعة واسعة من المضادات الحيوية 1. مع ارتفاع معدلات المراضة والوفيات من مقاومة العدوى البكتيريا بوساطة، هناك حاجة لتصعيد عمليات التنمية المخدرات و / أو البحث عن بدائل مضادة للبكتيريا أفضل لتحسين الخيارات العلاجية. في الآونة الأخيرة، ونهج معاداة الفوعة تكتسب الفائدة نظرا إمكاناتها في منع الفوعة عبر وسائل غير جراثيم، وبالتالي التخفيف من مخاطر آليات المقاومة 2.
النصاب الاستشعار هو "المفتاح الرئيسي في الفوعة البكتيرية وتعطل هذه الظاهرة يشير هو وسيلة لمكافحة الفوعة واعد ضد المرضية 3. بداية الفوعة يتطلب تراكم الجزيئات النصاب في البيئة خارج الخلية بعد الوصول إلى الكثافة السكانية البكتيرية حرجة. كما الراهنجزيئات الروم منتشر مرة أخرى إلى مصفوفة الخلايا، ملزم مع مستقبلاتها وما شابه ذلك يؤدي إلى تفعيل عوامل الفوعة وكذلك الجينات المرتبطة بمقاومة المضادات الحيوية وتشكيل بيوفيلم 4. في العام، واختلال نصاب الاستشعار ينطوي على تثبيط جزيء النصاب والتفاعل مستقبلات دون التأثير على المسارات الأيضية الأساسية. وبالتالي، فإنه ليس لديها أي تأثير مباشر على نمو الخلايا. لأنه لا شبهة اللياقة البدنية، وهناك الحد الأدنى من ضغط اختيار البكتيريا في التطور واكتساب مقاومة ضد مثل هذه العلاجات 5. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تعطيل النصاب الاستشعار تتداخل مع آليات الحماية البكتيرية الكامنة، كما في حالة تشكيل بيوفيلم، الذي يوفر حماية من العوامل المضادة للبكتيريا واستضافة الاستجابات المناعية.
وتشير التقديرات إلى أن 99٪ من الميكروبات على الأرض موجودة في المصفوفات مثل بيوفيلم معقدة، منح مزايا البقاء على قيد الحياة حاسمة في الكائنات الحية الدقيقة التي تعيش داخل الهياكل جنوب شرقي 6. الأهم من ذلك، تشكيل هذه المجالات اطئة هو سبب العدوى المكتسبة من المستشفيات الأكثر المستمرة والمزمنة 7. راكدة بومانية هي واحدة من مسببات الأمراض البشرية الكبرى مقترن العدوى المكتسبة من المستشفيات العالمية ويعزى الفوعة إلى حد كبير إلى النصاب الاستشعار تشكيل بيوفيلم بوساطة 8. وقد استخدمت إنزيمات التبريد النصاب القانوني بنجاح في تعطيل النصاب بوساطة نقل الإشارة من خلال استهداف مجموعة من المركبات المعروفة باسم N -acyl اكتونات homoserine (AHLs) التي تنتجها البكتيريا سالبة الجرام 9. وقد وسعت العديد من الدراسات أيضا على استخدام هذه الانزيمات لمنع المرضية البكتيرية من خلال الحد من أعداد عامل الفوعة التعبير وخلية في الأغشية الحيوية 10،11. للأسف، لا يزال هناك نقص في مظاهرة اضح من الاستخدام الفعال للإنزيمات التبريد النصاب القانوني ضد تشكيل بيوفيلم عن طريق الجراثيم البكتيرية. الوقد تم إعادة محاولات لاستخدام مثبطات النصاب (نظائرها AHL)، بدلا من الانزيمات التبريد النصاب، لتعطيل A. تشكيل بيوفيلم baumannii 12. على الرغم من أن هذه الطريقة من استخدام الجزيئات الصغيرة مثبطات هو نهج صحيح، واستدامة التوافر البيولوجي في استخدامات متعدية يمكن أن يشكل تحديا. على العكس من ذلك، يمكن استخدام إنزيمات التبريد النصاب الحفازة تحايل على قضية التوافر البيولوجي كإنزيمات اكثر سهولة نحو تجميد على أسطح الطبية الأجهزة الآثار العلاجية.
هنا، نحن تصف تقييم آثار المهندسة lactonases-التبريد النصاب القانوني من Geobacillus kaustophilus (GKL) 13 على تشكيل بيوفيلم البكتيرية، وذلك باستخدام تلطيخ البنفسجي الكريستال ومتحد البؤر المجهر الليزر (CLSM). هذه الدراسة هي أول مظاهرة ناجحة تعطل بيوفيلم في A. ذات الصلة سريريا سلالة baumannii S1 باستخدام أنزيمات التبريد النصاب. الطرق وصفتفي هذه الدراسة هي مفيدة لتقييم فعالية أخرى إنزيمات التبريد النصاب القانوني في جهود التنمية العلاجية اللاحقة ضد الجراثيم سلبية الغرام المسببة للأمراض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. كريستال البنفسج الكميات من تشكيل بيوفيلم في A. baumannii S1
- تنمو ثقافة 5 مل من A. baumannii S1 في استذابة مرق (LB) (تريبتون 10 ز / L، خلاصة الخميرة 5 جم / لتر) عند 30 درجة مئوية في حاضنة تهتز (220 دورة في الدقيقة) لمدة 16 ساعة.
- ضبط ثقافة A. baumannii S1 إلى OD المطلوب 600 من 0.8. باستخدام لوحة 96-جيدا، تطعيم ثقافة البكتيريا (1: 100 تمييع) في LB الطازجة التي تحتوي على 10 ميكرولتر من تنقية GKL انزيم (40 ملغ / مل). الحجم النهائي الثقافة الجديدة هو 100 ميكرولتر.
- إعداد ثقافة السيطرة كذلك؛ هذا لن يحتوي على أي الانزيم. كرر ظروف مماثلة لانتاج العدد المطلوب من مكررات.
- تغطية لوحة مع غطاء ووضعه في 10 L عاء من البلاستيك مختوم. احتضان لوحة عند 30 درجة مئوية لمدة 3 ساعات قبل إزالة بلطف وسائل الإعلام.
- إضافة 100 ميكرولتر آخر من الطازجة المتوسطة LB إلى البئر واحتضان لوحة لمدة 21 ساعة على 30 ° C. بعد الفترة الثانية من الحضانة، وإزالة بلطف كافة وسائل الإعلام. يغسل البكتيريا خلية العوالق مع 200 ميكرولتر الماء المعقم. ضمان أنه لا يوجد سوى اضطراب الحد الأدنى للخلايا أثناء الغسل.
- إضافة 100 ميكرولتر من 1٪ محلول الكريستال البنفسجي إلى كل بئر واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT. إزالة الحل الكريستال البنفسجي غسل جيدا مع 200 ميكرولتر الماء المعقم. تكرار غسل مرتين أكثر.
- إضافة 100 ميكرولتر من حامض الخليك 33٪ على كل بئر واحتضان لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز لطيف؛ هذا سوف تذوب الصبغة.
- Quantitate كمية بيوفيلم تشكلت من خلال قياس الامتصاصية من الكريستال البنفسجي في 600 نانومتر. كمية من الكريستال البنفسجي يتناسب مع كمية بيوفيلم تشكيلها.
2. متحد البؤر الليزر الضوئي المجهري للA. baumannii S1 بيوفيلم
- تنمو ثقافة 5 مل من A. baumannii S1 في LB عند 30 درجة مئوية في حاضنة تهتز (220 دورة في الدقيقة) لمدة 16 ساعة.
- ميلاديمجرد ثقافة A. baumannii S1 إلى OD المطلوب 600 من 0.8. باستخدام 35 ملم ذات القاع الزجاجي μ-الصحن، تطعيم ثقافة البكتيريا (1: 100 تمييع) في LB الطازجة التي تحتوي على 30 ميكرولتر من تنقية GKL انزيم (40 ملغ / مل). الحجم النهائي الثقافة الجديدة هو 1 مل.
- تغطية μ-صحن مع غطاء ووضعه في 10 L عاء من البلاستيك مختوم. احتضان μ-الطبق عند 30 درجة مئوية لمدة 3 ساعات قبل إزالة بلطف وسائل الإعلام. إضافة 30 ميكرولتر من تنقية إنزيم GKL ومتوسطة جديدة، ليصل إلى الحجم الكلي لل1 مل. احتضان لمدة ساعة 21 آخرين في 30 ° C.
- كرر الخطوة 2.3 واحتضان μ-طبق لمدة 24 ساعة أخرى في 30 ° C. ثم، وإزالة وسائل الإعلام بلطف.
- إضافة 500 ميكرولتر من 5 ميكروغرام / مل اليكس فلوو 488 مترافق جنين القمح راصة (WGA) الذائب في محلول ملحي متوازن هانك (HBSS) إلى μ-صحن واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. هذا وصمة عار على بيوفيلم تشكيلها. إزالة حل تلطيخ وغسل رانه ميكرون-صحن 2 مل من HBSS. كرر الخطوة غسل واحد مزيد من الوقت.
- إضافة 500 ميكرولتر من 3.7٪ الفورمالديهايد الذائبة في HBSS واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. هذا سوف إصلاح بيوفيلم على μ-الصحن. يغسل μ-الطبق مرة واحدة مع 2 مل من HBSS ثم قم بإزالة الحل تماما. يمكن تخزين μ-صحن ثابت مع بيوفيلم في الظلام في 4 درجات مئوية قبل التصوير CLSM.
- للتصوير CLSM والتحليل، استخدم 63 مرات التكبير لتوليد 97 رزمة لكل صورة مع فاصل من 0.21 ميكرون في كومة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في التجربة الكميات الكريستال البنفسجي، واستخدمت اثنين من الانزيمات والتبريد النصاب القانوني لإثبات جدوى في تعطيل تشكيل بيوفيلم: من النوع البري GKL وتحسين متحولة مزدوج GKL (E101G / R230C). وقد تبين أن كلا من الأنزيمات لإثبات النشاط lactonase ضد 3-هيدروكسي-decanoyl-L-homoserine اكتون (3-OH-C 10 -HSL)، جزيء النصاب الرئيسية المستخدمة من قبل أ. baumannii S1 14. لتقييم صحيح من تعطل بيوفيلم، أدرجت أيضا إنزيمات نشطة حفاز لكل منهما (كما هو موضح سابقا لعدم عزل بروابط AHL) والضوابط المباشرة (GKL D266N متحولة وGKL E101G / R230C / D266N متحولة). بالإضافة إلى استخدام البرية من نوع A. تم اختبار أيضا baumannii S1، بيوفيلم تشكيل قدرة متحولة Δ ABAI سلالة (AHL-سينسيز ناقصة). وكانت كل من الانزيمات التبريد النصاب، من النوع البري GKL وGKL E101G / R230C متحولة قادرة على خفض كبير في مرحلة ما قبل تشكيل بيوفيلمتعامل A. ثقافات baumannii S1 (ن = 10؛ ف قيمة ≤ 0.0001) (الشكل 1). ومع ذلك، ومدى تعطل بيوفيلم لكل من الانزيمات ليست متناسبة مع فعاليتها ضد 3-OH-C 10 -HSL. معدل الدوران (ك القط) من GKL E101G / R230C متحولة هو ست مرات أسرع من النوع البري GKL ضد 3-OH-C 10 -HSL 14. ومع ذلك، فإن الاختلاف في مدى تعطل بيوفيلم بين الإنزيمات هو فقط شقين.
الشكل 1. A. وقد تم قياس تشكيل baumannii تعطل بيوفيلم الفحص. بيوفيلم التي كتبها الكريستال البنفسجي تلطيخ. أعمدة حمراء تمثل كمية بيوفيلم التي شكلتها النوع البري A. baumannii وΔ ABAI متحولة، بدون إضافة lactonases التبريد النصاب القانوني. الأعمدة الزرقاء تمثل عموالاتحاد الوطني للعمال من بيوفيلم التي شكلتها البرية من نوع A. baumannii في وجود أربعة إنزيمات GKL مختلفة: نشط GKL D266N متحولة، من النوع البري GKL، غير نشط GKL E101G / R230C / D266N متحولة وGKL E101G / R230C متحولة. ****، P- قيمة ≤ 0.0001. مستنسخة بإذن من الوسائل المضادة للجراثيم والعلاج الكيميائي 58، 1802-1805 (2014). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
التصوير متحد البؤر من A. وقد استخدم تشكيل بيوفيلم baumannii S1 إلى توفير قدر النوعي والكمي للآثار التبريد النصاب على التشكل الهيكلي لهذه المجالات اطئة. واستخدمت تحسن GKL E101G / R230C متحولة وأنزيم نشط في تحفيزيا للمقارنة. على النقيض من الصورة التفاضلي أظهرت (DIC) الصورة التي المعاملة مع تحسن GKL E101G / R230C متحولة أدت إلى انخفاض في حجم بيوفيلم (شملت رقمه 2). وكشف تحليل الصور مضان أيضا أن هناك انخفاض في المساحة السطحية، والكتلة الحيوية ومتوسط سماكة بيوفيلم عندما تعامل مع تحسين GKL E101G / R230C متحولة (الجدول 1).
صور الشكل 2. الممثل المسح بالليزر متحد البؤر المجهري A. الأغشية الحيوية baumannii. A. تم علاج الأغشية الحيوية baumannii مع غير نشط GKL E101G / R230C / D266N متحولة (A) وGKL E101G / R230C متحولة (B) وملطخة اليكسا فلور 488 مترافق WGA. وتظهر الصور DIC من الأغشية الحيوية (يسار) والصور مضان من الأغشية الحيوية (يمين) لس ص تمثيلي (في الوسط)، YZ (يمين)، وXZ (القاع) أقسام. مستنسخة بإذن من الوسائل المضادة للجراثيم والعلاج الكيميائي <قوية> 58، 1802-1805 (2014). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| قيمة ± SD ل | |||
| صفة مميزة | لا يوجد علاج | العلاج مع متحولة غير نشط | العلاج مع E101G / R230C متحولة |
| الكتلة الحيوية (3 ميكرون / ميكرون 2) | 2.57 ± 1.65 | 3.39 ± 1.33 | 1.37 ± 0.20 ** |
| سمك متوسط (ميكرون) | 3.68 ± 2.51 | 3.41 ± 1.31 | 1.21 ± 0.21 ** |
| مساحة (ميكرون) | 235،920.59 ± 79،456.46 | 209،872.6 ± 115،094.7 | 115،354.9 * ± 7،630.3 |
| ون = 10 مداخن صورة. **، P ≤ 0.001؛ *، P ≤ 0.05، مقارنة مع العلاج مع E101G غير نشط / R230C / D266N متحولة. | |||
الجدول 1. A. baumannii بيوفيلم الكميات الهيكلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في كلتا المجموعتين من التجربة، A. تم مثقف baumannii S1 في LB سائل الإعلام دون كلوريد الصوديوم حيث تركيز الملح العالية قد يقلل من كمية بيوفيلم التي شكلتها البكتيريا 15. وجود مثل هذه الأداة يمكن أن نقلل من كمية بيوفيلم تشكيلها، وكذلك آثار إنزيمات التبريد النصاب في ظروف معاملة مختلفة. استخدام انزيم نشط حفاز مهم كوسيلة لمراقبة سلبية للقضاء على الآثار المحتملة للاحتباس انزيم الشكل 1 يبين أنه حتى لو إنزيمات نشطة تصادر الجزيئات النصاب، لا يتم تعطيل تشكيل بيوفيلم.
A. baumannii S1 يشكل الدائري مثل هيكل بيوفيلم الدقيق بين الهواء والسائل البيني في بئر من لوحة 96-جيدا. وبالتالي، لا بد من تجنب الإثارة المفرطة خلال إزالة وسائل الإعلام وغسل خطوات لمنع إزالة عرضية من الأغشية الحيوية البكتيرية. تمت إزالة LB سائل الإعلام بعد كل حضانة لالقضاء على خلايا العوالق. وبالإضافة إلى ذلك، وضعت لوحة 96-جيدا في وعاء من البلاستيك 10 L للحد من اضطرابات في تدفق الهواء وخلق بيئة لاهوائية الصغيرة التي تفضل تشكيل بيوفيلم. الكميات بيوفيلم في لوحة 96-جيدا هي أيضا تعتمد على كمية من الكريستال البنفسجي وأضاف أن كل بئر. في حال أن يتم إضافة الزائدة الكريستال البنفسجي في بئر، ويمكن زيادة عدد الخطوات غسل. توفر تجربة الكريستال البنفسجي تلطيخ مقارنة النسبية للكفاءات النصاب، التبريد في تعطل بيوفيلم. على الرغم من وضوح الشمس البنفسجي تلطيخ كمي لقياس تشكيل بيوفيلم، أنها ليست سوى نصف الكمية من حيث الكفاءة الحفزية للأنزيمات التبريد النصاب. للمقارنة إحصائية دقيقة، وأحجام عينة كافية من أهمية بالنسبة للمجموعات العلاج المختلفة. وينبغي أيضا إزالة القيم المتطرفة لمنع تحريف النتائج.
التصوير والتحليل من بيوفيلم البكتيرية متحد البؤر هو usefأداة المجاهدين لتقييم الآثار النوعية للإنزيمات التبريد النصاب القانوني. ومع ذلك، فإن عملية اختيار بيوفيلم للتحليل قد يكون قناة محتملة للتحيز إذا كان المستخدم على بينة من نوع الإنزيم النصاب، التبريد تدار (نشط أو غير نشط). لتجنب احتمال التحيز، التجربة يمكن أن تكون مصممة لاستبعاد المعلومات انزيم من المستخدم أو استخدام النهج العشوائي للاختيار. تمكن استراتيجية اختيار مشاركات أيضا مقارنة كمية أفضل من الأشكال التضاريسية بيوفيلم التي كتبها CLSM. ومع ذلك، وهذا هو الدراسة الأولى التي توضح طريقة لتقييم نتائج إنزيمات التبريد النصاب القانوني في الأغشية الحيوية البكتيرية. وقد أثبتت الكريستال البنفسجي تلطيخ فائدة إنزيمات التبريد النصاب القانوني في تعطل بيوفيلم وكشف أن إنزيمات "مودى operandorum لا تقتصر على الحد من أعداد الخلايا وعامل الفوعة التعبير. وفي الوقت نفسه، يمكن أن تؤدي التغيرات المورفولوجية التي يحددها التحليل CLSM كما توفر نظرة ثاقبة الممكن moleculأهداف AR هذه الإنزيمات. على الرغم من أن التجربة الحالية كانت تهدف إلى تحقيق تأثيرات الإنزيمات المعالجة على الأغشية الحيوية البكتيرية، يمكن تعديل البروتوكول لتقييم تأثير الانزيم على بيوفيلم قبل المشكل عن طريق إضافة الإنزيم بعد نمو البكتيريا، أو لفحص الكفاءة في ظل الظروف الفسيولوجية من خلال استخدام المصل ظروف تشبه للثقافة. البروتوكول المستخدم لدراسة الأنزيمات GKL يجوز تمديد لغيرها من الأنزيمات ومسببات الأمراض التبريد النصاب القانوني للتحقيق في علاقتهم في تعطل بيوفيلم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast Extract | BD | 212750 | |
| 96-well plate | Costar | 3596 | |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
| Acetic Acid | Lab-Scan | PLA00654X | Caution: Flammable |
| μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Alex Fluo 488-conjugated WGA | Invitrogen | W11261 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 141475095 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Caution: Corrosive |
| Synergy HT Microplate Reader | BioTek | ||
| 1X-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus |
References
- Alanis, A. J. Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era? Archives of medical research. 36, 697-705 (2005).
- Cegelski, L., Marshall, G. R., Eldridge, G. R., Hultgren, S. J. The biology and future prospects of antivirulence therapies. Nature reviews. Microbiology. 6, 17-27 (2008).
- LaSarre, B., Federle, M. J. Exploiting quorum sensing to confuse bacterial pathogens. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 77, 73-111 (2013).
- Waters, C. M., Bassler, B. L. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
- Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature reviews. Drug discovery. 9, 117-128 (2010).
- Lazar, V. Quorum sensing in biofilms--how to destroy the bacterial citadels or their cohesion/power? Anaerobe. 17, 280-285 (2011).
- Costerton, J. W. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Perez, F., et al. Global challenge of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3471-3484 (2007).
- Tay, S. B., Yew, W. S. Development of quorum-based anti-virulence therapeutics targeting Gram-negative bacterial pathogens. International journal of molecular sciences. 14, 16570-16599 (2013).
- Igarashi, J., Suga, H. Ch. 19. Quorum Sensing. Rumbaugh, K. P. 692, Methods in Molecular Biology. Humana Press. 265-274 (2011).
- Ng, F. S., Wright, D. M., Seah, S. Y. Characterization of a phosphotriesterase-like lactonase from Sulfolobus solfataricus and its immobilization for disruption of quorum sensing. Applied and environmental microbiology. 77, 1181-1186 (2011).
- Stacy, D. M., Welsh, M. A., Rather, P. N., Blackwell, H. E. Attenuation of quorum sensing in the pathogen Acinetobacter baumannii using non-native N-Acyl homoserine lactones. ACS chemical biology. 7, 1719-1728 (2012).
- Chow, J. Y., et al. Directed evolution of a thermostable quorum-quenching lactonase from the amidohydrolase superfamily. The Journal of biological chemistry. 285, 40911-40920 (2010).
- Chow, J. Y., Yang, Y., Tay, S. B., Chua, K. L., Yew, W. S. Disruption of biofilm formation by the human pathogen Acinetobacter baumannii using engineered quorum-quenching lactonases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, 1802-1805 (2014).
- Pour, N. K., et al. Biofilm formation by Acinetobacter baumannii strains isolated from urinary tract infection and urinary catheters. FEMS immunology and medical microbiology. 62, 328-338 (2011).
