Introduction
Behandlingsmuligheder for smitsomme sygdomme er blevet vanskeliggjort af den hurtige stigning i multiresistente bakterier, der er immune over for en lang række antibiotika 1. Med høj sygelighed og dødelighed fra resistente bakterier-medierede infektioner, er der behov for at optrappe udvikling af lægemidler processer og / eller udforske bedre anti-bakterielle alternativer for at forbedre terapeutiske muligheder. På det seneste er den anti-virulens tilgang få interesse givet sit potentiale i forebyggelsen virulens via ikke-bakteriedræbende metoder, dermed mindske risikoen for resistensmekanismer 2.
Quorum-sensing er en "hovedafbryder" i bakteriel virulens og afbrydelse af denne signalering fænomen er en lovende anti-virulens metode mod patogenese 3. Starten af virulens kræver akkumulering quorum molekyler i det ekstracellulære miljø efter en kritisk bakteriel befolkningstæthed er nået. Som quorom molekyler diffunderer tilbage i den intracellulære matrix, binding med deres beslægtede receptorer fører til aktivering af virulensfaktorer samt gener associeret med antibiotikaresistens og biofilmdannelse 4. Generelt quorum-sensing forstyrrelser indebærer hæmme quorum molekyle og receptor interaktion uden at påvirke de primære metaboliske veje. Derfor har det ikke nogen direkte konsekvenser på cellulær vækst. Da fitness ikke er kompromitteret, der er minimal selektionspres for bakterier at udvikle sig og få modstand mod sådanne behandlinger 5. Desuden kan quorum sensing-forstyrrelser forstyrre iboende bakterielle beskyttelsesmekanismer, som i tilfælde af biofilmdannelse, som giver beskyttelse mod anti-bakterielle midler og værtsimmunreaktioneme.
Det anslås, at 99% af mikrober på Jorden findes i komplekse biofilm-lignende matricer, der giver afgørende overlevelse fordele til mikroorganismerne bor inden thESE strukturer 6. Endnu vigtigere er, dannelsen af disse fastsiddende domæner er årsag til mest vedholdende og kroniske hospitalserhvervede infektioner 7. Acinetobacter baumannii er en af de store humane patogener, der er forbundet med globale hospitalserhvervede infektioner, og dens virulens er i vid udstrækning tilskrives quorum-sensing -medieret biofilmdannelse 8. Quorum-quenching enzymer er blevet anvendt med succes i at forstyrre quorum-medieret signaltransduktion ved at målrette en gruppe af forbindelser kendt som N-acyl homoserinlaktoner (AHL'er) der er produceret af Gram-negative bakterier 9. Flere undersøgelser har også udvidet på anvendelsen af disse enzymer til at blokere bakteriel patogenese gennem reduktion af virulensfaktor udtryk og celletal i biofilm 10,11. Desværre er der stadig mangel på håndgribelig demonstration af effektiv brug af beslutningsdygtighed-quenching enzymer mod biofilmdannelse af bakterielle patogener. Dere har været forsøg på at anvende beslutningsdygtighed hæmmere (AHL analoger), i stedet for beslutningsdygtighed-quenching enzymer, at forstyrre A. baumannii biofilmdannelse 12. Selv om denne fremgangsmåde til anvendelse af små molekyler inhibitorer er en gyldig metode kan opretholde dets biotilgængelighed i translationelle anvendelsesformål være en udfordring. Tværtimod kunne brugen af katalytiske beslutningsdygtighed-quenching enzymer omgå biotilgængelighed spørgsmålet som enzymer er mere modtagelig over for immobilisering på overflader af biomedicinsk udstyr til terapeutiske virkninger.
Her beskriver vi en vurdering af virkningerne af manipuleret beslutningsdygtighed-quenching lactonases fra Geobacillus kaustophilus (GKL) 13 om bakteriel biofilm dannelse, ved hjælp af krystalviolet farvning og konfokal laser scanning mikroskopi (CLSM). Denne undersøgelse er den første vellykkede demonstration af biofilm afbrydelse i en klinisk relevant A. baumannii S1 stammen ved hjælp af beslutningsdygtighed-quenching enzymer. Beskrevet de metoder,i denne undersøgelse er nyttige til vurdering af effekten af andre beslutningsdygtighed-quenching enzymer i efterfølgende terapeutiske udviklingsindsats mod patogene Gram-negative bakterier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. krystalviolet Kvantificering af biofilmdannelse i A. baumannii S1
- Vokse en 5 ml kultur af A. baumannii S1 i lysogeni bouillon (LB) (trypton 10 g / l, gærekstrakt 5 g / l) ved 30 ° C i en rysteinkubator (220 rpm) i 16 timer.
- Juster kultur af A. baumannii S1 til en ønsket OD600 på 0,8. Anvendelse af en 96-brønds plade, pode bakteriekulturen (1: 100 fortynding) i frisk LB indeholdende 10 pi oprenset GKL enzym (40 mg / ml); den nye kultur endelige volumen er 100 pi.
- Forbered en kontrol kultur samt; dette vil ikke indeholde noget enzym. Gentag lignende betingelser til opnåelse af det ønskede antal gentagelser.
- Dæk pladen med låg og anbringe det i en forseglet 10 L plastbeholder. Inkubér pladen ved 30 ° C i 3 timer, før forsigtigt at fjerne mediet.
- Tilføje yderligere 100 pi frisk LB-medium til brønd og inkuberes pladen i 21 timer ved 30 ° C. Efter den anden inkubationstid, forsigtigt fjerne alle medier. Vask planktoniske bakterier celle med 200 ul sterilt vand. Sørg for, at der kun er minimal forstyrrelse til cellerne under vask.
- Tilsæt 100 pi 1% krystalviolet opløsning til hver brønd og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur. Fjern krystalviolet opløsning ved at vaske brønden med 200 pi sterilt vand. Gentag vask for to gange mere.
- Tilsættes 100 pi 33% eddikesyre til hver brønd og inkuberes i 15 minutter under forsigtig omrystning; dette vil opløse farvestoffet.
- Kvantificere mængden af biofilm dannes ved at måle absorbansen af krystalviolet ved 600 nm. Mængden af krystalviolet er proportional med mængden af biofilm dannet.
2. Konfokal Laser Scanning mikroskopi af A. baumannii S1 Biofilm
- Vokse en 5 ml kultur af A. baumannii S1 i LB ved 30 ° C i en rysteinkubator (220 rpm) i 16 timer.
- Adlige kulturen af A. baumannii S1 til en ønsket OD600 på 0,8. Ved hjælp af en 35 mm glas-bund μ-Dish, pode bakteriekulturen (1: 100 fortynding) i frisk LB indeholdende 30 pi oprenset GKL enzym (40 mg / ml); den nye kultur endelige volumen er 1 ml.
- Dæk μ-Fad med låg og læg den i en forseglet 10 L plastbeholder. Inkubér μ-Dish ved 30 ° C i 3 timer, før forsigtigt at fjerne mediet. Tilsæt 30 pi oprenset GKL enzym og frisk medium, hvilket bringer det til et totalvolumen på 1 ml. Inkuberes i en anden 21 timer ved 30 ° C.
- Gentag trin 2.3 og inkuber μ-Dish i yderligere 24 timer ved 30 ° C. Derefter fjerne mediet forsigtigt.
- Der tilsættes 500 pi af 5 pg / ml Alex Fluo 488-konjugeret hvedekimagglutinin (WGA) opløst i Hanks balancerede saltopløsning (HBSS) til μ-skål og inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter; dette vil plette det dannede biofilm. Fjern farveopløsningen og vask than u-Fad med 2 ml HBSS. Gentag vasketrinet en gang mere.
- Der tilsættes 500 pi 3,7% formaldehyd opløst i HBSS og inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter; dette vil løse biofilmen på μ-skålen. Vask μ-Dish gang med 2 ml HBSS og derefter fjerne løsningen helt. Den μ-Dish fikseret med biofilm kan opbevares i mørke ved 4 ° C forud for CLSM billeddannelse.
- For CLSM billedbehandling og analyse, brug 63 gange forstørrelse til at generere 97 stakke pr billede med et interval på 0,21 um pr stak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I krystalviolet kvantificering eksperiment blev to beslutningsdygtighed-quenching enzymer bruges til at demonstrere mulighederne i at forstyrre biofilmdannelse: vildtype GKL og en forbedret GKL dobbelt mutant (E101G / R230C). Begge enzymer har vist sig at påvise lactonase aktivitet mod 3-hydroxy-decanoyl-L-homoserinlakton (3-OH-C 10 -HSL), den største quorum molekyle anvendes af A. baumannii S1 14. Til gyldig vurdering af biofilm forstyrrelser, blev deres respektive katalytisk inaktive enzymer (tidligere vist sig at ikke binde AHL ligander) også inkluderet som umiddelbare kontroller (GKL D266N mutant og GKL E101G / R230C / D266N mutant). Ud over anvendelse af vildtype A. baumannii S1, biofilmen evne til at danne en mutant Δ Abai stamme (AHL synthase-deficient) blev også testet. Både beslutningsdygtighed-afkølende enzymer, vildtype GKL og GKL E101G / R230C mutant var i stand til at reducere biofilmdannelse i præbehandlede A. baumannii S1 kulturer (n = 10; p-værdi ≤ 0,0001) (figur 1). Ikke desto mindre er omfanget af biofilm forstyrrelser for begge enzymer er ikke proportional med deres effektivitet mod 3-OH-C 10 -HSL. Omsætningen sats (k kat) i GKL E101G / R230C mutant er seks gange hurtigere end vildtype GKL mod 3-OH-C 10 -HSL 14. Forskellen i omfanget af biofilm forstyrrelser mellem enzymerne er imidlertid kun to-fold.
Figur 1. A. baumannii biofilm forstyrrelser assay. biofilmdannelse blev målt ved krystalviolet farvning. Røde søjler repræsenterer mængden af biofilm dannet af vildtype A. baumannii og Δ Abai mutant, uden tilsætning af beslutningsdygtighed-quenching lactonases. Blå søjler repræsenterer amoUNT af biofilm dannet af vildtype A. baumannii i overværelse af fire forskellige GKL enzymer: inaktiv GKL D266N mutant, vildtype GKL, inaktive GKL E101G / R230C / D266N mutant og GKL E101G / R230C mutant. ****, P- værdi på ≤ 0,0001. Gengivet med tilladelse fra Antimicrobial Agents and kemoterapi 58, 1802-1805 (2014). Klik her for at se en større version af dette tal.
Konfokal afbildning af A. baumannii S1 biofilmdannelse blev brugt til at give en kvalitativ og kvantitativ måling af beslutningsdygtighed-afkølende effekt på den strukturelle morfologi af disse fastsiddende domæner. Den forbedrede GKL E101G / R230C mutant og dens katalytisk inaktiv enzym blev anvendt til sammenligning. Den differentielle billede kontrast (DIC) billede viste, at behandling med den forbedrede GKL E101G / R230C mutant resulterede i et fald i biofilm størrelse (Figure 2). Analyse af fluorescens billeder viste også, at der var arealindskrænkning, biomasse og gennemsnitlig tykkelse på biofilm, når de behandles med de forbedrede GKL E101G / R230C mutant (tabel 1).
Figur 2. Repræsentativ konfokal laser scanning mikroskopi billeder af A. baumannii biofilm. A. baumannii biofilm blev behandlet med inaktiv GKL E101G / R230C / D266N mutant (A) og GKL E101G / R230C mutant (B) og farvet med Alexa Fluor 488-konjugeret WGA. DIC billeder af biofilm (venstre) og fluorescens billeder af biofilm (til højre) er vist for repræsentative xy (i midten), YZ (til højre), og XZ (nederst) sektioner. Gengivet med tilladelse fra Antimicrobial Agents and kemoterapi <strong> 58, 1802-1805 (2014). Klik her for at se en større version af dette tal.
| Værdi ± SD a | |||
| Karakteristisk | Ingen behandling | Behandling med inaktiv mutant | Behandling med E101G / R230C mutant |
| Biomasse (um 3 / um 2) | 2,57 ± 1,65 | 3.39 ± 1.33 | 1,37 ** ± 0,20 |
| Gennemsnitlig tykkelse (um) | 3,68 ± 2,51 | 3,41 ± 1,31 | 1.21 ** ± 0,21 |
| Overfladeareal (um) | 235,920.59 ± 79,456.46 | 209,872.6 ± 115,094.7 | 115,354.9 * ± 7,630.3 |
| en n = 10 billedstakke. **, P ≤ 0,001; *, P ≤ 0,05 sammenlignet med behandling med inaktivt E101G / R230C / D266N mutant. | |||
Tabel 1. A. baumannii biofilm strukturel kvantificering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I begge sæt eksperiment A. baumannii S1 blev dyrket i LB-medier uden NaCl som en høj saltkoncentration kan reducere mængden af biofilm dannet af bakterierne 15. Tilstedeværelsen af en sådan artefakt kunne undervurdere mængden af biofilm dannet, samt virkningerne af beslutningsdygtighed-quenching enzymer på tværs af forskellige behandlingsbetingelser. Anvendelsen af en katalytisk inaktiv enzym er vigtig som en negativ kontrol for at eliminere de mulige virkninger af enzym binding. Figur 1 viser, at selv om inaktive enzymer sekvestrerer beslutningsdygtighed molekyler, er biofilmdannelse ikke forstyrres.
A. baumannii S1 danner en delikat ringlignende biofilm struktur mellem luft og væske-grænsefladen i brønden af 96-brønds plade. Derfor er det afgørende at undgå overdreven agitation under mediernes fjernelse og vask skridt til at forhindre tilfældig fjernelse af bakterielle biofilm. LB-medium blev fjernet efter hver inkubation for atfjerne planktoniske celler. Desuden blev 96-brønds plade anbragt i en 10 L plastbeholder at minimere forstyrrelser i luftstrømmen og for at skabe en mikro-anaerobt miljø, som fremmer biofilmdannelse. Biofilm kvantificering i en 96-brønds plade er også afhængig af mængden af krystalviolet tilsat til hver brønd. I tilfælde af, at der tilsættes overskydende krystalviolet i en brønd, kan antallet af vasketrin øges. Den krystalviolet farvning eksperiment giver en relativ sammenligning af quorum-quenching effektivitet i biofilm forstyrrelser. Selv krystalviolet farvning er kvantitativ til måling af biofilm, er det kun semikvantitative i form af den katalytiske effektivitet quorum-quenching enzymer. For nøjagtig statistisk sammenligning, tilstrækkelige stikprøvestørrelser er vigtige for de forskellige behandlingsgrupper. Outliers bør også fjernes for at forhindre vildledning af resultater.
Konfokal afbildning og analyse af bakteriebiofilm er en useful værktøj til vurdering af de kvalitative virkninger af beslutningsdygtighed-quenching enzymer. Processen med at udvælge biofilm til analyse kan imidlertid være en potentiel kanal for skævhed, hvis brugeren er opmærksom på den type quorum-quenching enzym administreret (levende eller inaktiv). For at undgå muligheden for bias, kan eksperimentet designes til at udelukke enzym oplysninger fra brugeren, eller brug en tilfældig tilgang til udvælgelse. En fordomsfri valg strategi muliggør også bedre kvantitativ sammenligning af biofilm morfologier af CLSM. Dette er dog den første undersøgelse, der beskriver en fremgangsmåde til evaluering af resultaterne af beslutningsdygtighed-quenching enzymer fra bakterier biofilm. Krystalviolet farvning har vist nytten af beslutningsdygtighed-quenching enzymer i biofilm forstyrrelser og afslørede, at enzymer 'modi operandorum ikke er begrænset til at reducere celle numre og virulensfaktor udtryk. I mellemtiden kan morfologiske ændringer bestemt ved CLSM analyse også give indsigt i mulige molecular mål for disse enzymer. Selv om den nuværende forsøg blev designet til at undersøge virkningerne af enzymer forbehandling på bakterielle biofilm, kan protokollen modificeres til at vurdere enzymets virkning på præformet biofilm ved at tilsætte enzymet efter bakterievækst eller at behandle kompetence under fysiologiske betingelser ved anvendelse af serum -lignende forhold for kultur. Den protokol, der bruges til at studere GKL enzymer kan udvides til andre beslutningsdygtighed-quenching enzymer og patogener til at undersøge deres forhold i biofilm forstyrrelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast Extract | BD | 212750 | |
| 96-well plate | Costar | 3596 | |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
| Acetic Acid | Lab-Scan | PLA00654X | Caution: Flammable |
| μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Alex Fluo 488-conjugated WGA | Invitrogen | W11261 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 141475095 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Caution: Corrosive |
| Synergy HT Microplate Reader | BioTek | ||
| 1X-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus |
References
- Alanis, A. J. Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era? Archives of medical research. 36, 697-705 (2005).
- Cegelski, L., Marshall, G. R., Eldridge, G. R., Hultgren, S. J. The biology and future prospects of antivirulence therapies. Nature reviews. Microbiology. 6, 17-27 (2008).
- LaSarre, B., Federle, M. J. Exploiting quorum sensing to confuse bacterial pathogens. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 77, 73-111 (2013).
- Waters, C. M., Bassler, B. L. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
- Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature reviews. Drug discovery. 9, 117-128 (2010).
- Lazar, V. Quorum sensing in biofilms--how to destroy the bacterial citadels or their cohesion/power? Anaerobe. 17, 280-285 (2011).
- Costerton, J. W. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Perez, F., et al. Global challenge of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3471-3484 (2007).
- Tay, S. B., Yew, W. S. Development of quorum-based anti-virulence therapeutics targeting Gram-negative bacterial pathogens. International journal of molecular sciences. 14, 16570-16599 (2013).
- Igarashi, J., Suga, H. Ch. 19. Quorum Sensing. Rumbaugh, K. P. 692, Methods in Molecular Biology. Humana Press. 265-274 (2011).
- Ng, F. S., Wright, D. M., Seah, S. Y. Characterization of a phosphotriesterase-like lactonase from Sulfolobus solfataricus and its immobilization for disruption of quorum sensing. Applied and environmental microbiology. 77, 1181-1186 (2011).
- Stacy, D. M., Welsh, M. A., Rather, P. N., Blackwell, H. E. Attenuation of quorum sensing in the pathogen Acinetobacter baumannii using non-native N-Acyl homoserine lactones. ACS chemical biology. 7, 1719-1728 (2012).
- Chow, J. Y., et al. Directed evolution of a thermostable quorum-quenching lactonase from the amidohydrolase superfamily. The Journal of biological chemistry. 285, 40911-40920 (2010).
- Chow, J. Y., Yang, Y., Tay, S. B., Chua, K. L., Yew, W. S. Disruption of biofilm formation by the human pathogen Acinetobacter baumannii using engineered quorum-quenching lactonases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, 1802-1805 (2014).
- Pour, N. K., et al. Biofilm formation by Acinetobacter baumannii strains isolated from urinary tract infection and urinary catheters. FEMS immunology and medical microbiology. 62, 328-338 (2011).
