Introduction
감염성 질환에 대한 치료 옵션은 항생제 1 광범위한 면역 다제 내성 박테리아에 급격한 증가에 의해 복잡 하였다. 내성 세균 - 매개 감염에서 높은 이환율 및 사망률, 신약 개발 과정을 확대 및 / 또는 치료 옵션을 향상시키기 위해 더 항균 대안을 모색 할 필요가있다. 최근에, 항 병원성 접근법 따라서 저항 메커니즘 (2)의 위험을 완화, 비 살균 방법을 통해 독성을 예방 가능성 주어진 관심을 얻고있다.
쿼럼 센싱 박테리아 독성이 신호 현상의 중단에 '마스터 스위치'는 발병 3에 대한 유망한 항 독성 방법이다. 세균 집단 임계 밀도에 도달 한 후 독성의 발현은 세포 외 환경에서 정수 분자의 축적을 필요로한다. 로 현럼 분자는 자신의 동족 수용체와 결합하면 독성 인자의 활성화뿐만 아니라 항생제 내성 및 biofilm 형성 (4)과 관련된 유전자지도, 세포 내 매트릭스로 다시 확산. 일반적으로, 정족수 감지 중단에 차 대사 경로에 영향을주지 않고 쿼럼 분자와 수용체의 상호 작용을 억제하는 것을 포함한다. 따라서,이 세포 성장에 직접적인 의미가 없습니다. 체력이 저하되지 않기 때문에, 발전 및 치료에 대해 5 저항을 얻기위한 최소한의 박테리아 선택 압력이 존재한다. 또한, 정수 감지 중단은 항균제으로부터 보호를 제공하고, 면역 반응을 호스팅 생물막 형성의 경우와 같이, 고유 세균성 보호 메커니즘을 방해 할 수있다.
그것은 지구에 미생물의 99 %가 일 이내 거주 미생물에 중요한 생존의 장점을 부여, 복잡한 바이오 필름 같은 행렬에 존재하는 것으로 추정된다ESE 구조 6. 더욱 중요한 것은,이 고착 영역의 형성은 가장 지속적인 만성 병원 내 감염 (7)의 원인이다. Acinetobacter baumannii의 글로벌 병원 내 감염과 연관되어 있고 그 독성이 크게 정수 감지에 기인 주요 인간 병원체 중 하나 인 - 매개 biofilm 형성 8. 정원 담금질 효소는 그람 음성균 (9)에 의해 생성되는 N 아실 호모 세린 락톤 (AHLs)로 공지 된 화합물의 그룹을 대상으로하여 정수 - 매개 신호 전달을 방해에서 성공적으로 사용되어왔다. 여러 연구는 또한 생물막 10,11 독성 인자의 발현 및 세포 수의 감소를 통해 박테리아 발병을 차단하는이 효소의 용도에 확대. 불행하게도, 세균성 병원체에 의한 바이오 필름 형성에 대한 쿼럼 담금질 효소의 효과적인 사용의 만져서 알 수있는 데모의 부족이 남아있다. 그만큼다시 A를 방해, 쿼럼 억제제 (AHL 유사체), 대신 쿼럼 담금질 효소를 사용하려고왔다 baumannii의 생물막 형성 (12). 작은 분자 억제제를 사용하는이 방법은 유효한 방법이지만, 병진 용도에서의 생체 이용률을 유지하는 것은 도전이 될 수 있습니다. 효소는 치료 효과에 대한 생의학 장치의 표면에 고정화 향해 더 의무만큼 반대로, 촉매 정수 담금질 효소의 사용은 생체 이용률 문제를 회피 할 수있다.
여기, 우리는 크리스탈 바이올렛 염색 및 공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM)를 사용하여, Geobacillus의 kaustophilus (GKL) 세균 바이오 필름 형성에 13에서 설계 쿼럼 담금질 lactonases의 효과에 대한 평가에 대해 설명합니다. 이 연구는 임상 적으로 A의 생물막 중단되는 최초의 성공적인 데모입니다 쿼럼 담금질 효소를 사용하여 baumannii의 S1 변형. 방법 설명본 연구에서 병원성 그람 음성 세균에 대한 후속 치료 개발 노력에 다른 쿼럼 담금질 효소의 효능을 평가하는 데 유용합니다.
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Protocol
A의 biofilm 형성 1. 크리스탈 바이올렛 정량 baumannii가 S1
- A의 5 ml의 문화를 성장 원성 국물에 baumannii가 S1 (LB) 16 시간 동안 진탕 배양기 (220 RPM)에서 30 ° C에서 (트립 톤 10g / L, 효모 추출물 5g / L).
- A의 문화를 조정 원하는 OD 0.8 600 baumannii의 (S1). 96 웰 플레이트를 사용하여, 박테리아 배양 접종 : GKL 정제 효소 (40 ㎎ / ㎖) 10 ㎕를 함유 신선한 LB으로 (1 내지 100 희석); 새로운 문화의 최종 부피는 100 μL입니다.
- 뿐만 아니라 제어 문화를 준비; 이 모든 효소가 포함되지 않습니다. 복제의 수를 수득 된 것과 유사한 조건을 반복한다.
- 뚜껑 판을 덮고 밀봉 (10) L 플라스틱 용기에 넣습니다. 부드럽게 매체를 제거하기 전에 3 시간 동안 30 ℃에서 플레이트를 배양한다.
- 잘 신선한 LB 배지의 또 다른 100 μl를 추가하고 30 ℃에서 21 시간 동안 접시를 품어. 배양의 두 번째 기간 후, 부드럽게 모든 용지를 제거합니다. 200 μL 멸균 수와 플랑크톤 박테리아 세포를 씻으십시오. 세탁시 세포에 최소한의 방해가 있는지 확인합니다.
- 각 웰에 1 % 크리스탈 바이올렛 용액 100 μl를 추가하고 실온에서 15 분 동안 품어. 200 μL 멸균 수로 잘 세척하여 크리스탈 바이올렛 솔루션을 제거합니다. 두 번 이상 세척을 반복합니다.
- 각 웰에 33 % 아세트산 100 μl를 추가하고 부드러운 동요와 15 분 동안 품어; 이는 염료를 용해한다.
- 600 nm에서의 크리스탈 바이올렛의 흡광도를 측정함으로써 바이오 필름 형성의 양을 정량. 크리스탈 바이올렛의 양은 형성된 바이오 필름의 양에 비례한다.
A. 2. 공 초점 레이저 주사 현미경 baumannii가 S1 바이오 필름
- A의 5 ml의 문화를 성장 16 시간 동안 진탕 배양기 (220 RPM)에서 30 ° C에서 LB에서 baumannii의 (S1).
- 광고A의 바로 문화 원하는 OD 0.8 600 baumannii의 (S1). 35mm 유리 바닥 μ-접시를 사용하면, 세균 배양 접종 : 정제 GKL 효소 (40 ㎎ / ㎖)의 30 μl를 포함하는 신선한 LB에 (1 100 희석); 새로운 문화의 최종 부피는 1 ml의입니다.
- 뚜껑 μ-접시를 덮고 밀봉 (10) L 플라스틱 용기에 넣습니다. 부드럽게 용지를 제거하기 전에 3 시간 동안 30 ° C에서 μ-접시를 품어. 1 ML의 총 부피에 데려 정제 GKL 효소와 신선한 매체의 30 μl를 추가합니다. 30 ° C에서 또 다른 21 시간 동안 품어.
- 단계를 반복 2.3 및 30 ℃에서 또 다른 24 시간의 μ-접시를 품어. 그런 다음, 부드럽게 용지를 제거합니다.
- μ-접시에 행크의 균형 소금 용액 (HBSS)에 용해 5 μg의 / ㎖ 알렉스 FLUO 488 - 복합 밀 배아 응집소 (WGA)의 500 μl를 추가하고 30 분 동안 37 ℃에서 배양; 이렇게 형성된 바이오 필름을 염색한다. T 염색 액을 제거하고 세척그는 μ-요리 HBSS 2 ㎖과 함께합니다. 세척 단계를 한 번 더 반복한다.
- 3.7 % 포름 알데히드 HBSS에 용해시키고, 30 분 동안 37 ℃에서 배양의 500 μl를 추가; 이 μ-요리 상 생물막을 수정합니다. HBSS 2 ㎖로 한 번 μ-접시를 세척 한 후 완전히 솔루션을 제거합니다. μ 디시 생물막 고정 전에 CLSM 촬상 4 ℃에서 어둠 속에서 저장 될 수있다.
- CLSM 이미징 및 분석을 위해, 스택 당 0.21 μm의 간격으로 이미지 당 97 스택을 생성하기 위해 63 배 배율을 사용합니다.
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Representative Results
야생형 GKL 및 개선 GKL 이중 돌연변이 (E101G / R230C를) 크리스탈 바이올렛 정량 실험에서는 두 정수 담금질 효소 생물막 형성에 방해 가능성을 보여주기 위해 사용되었다. 두 효소 lactonase 대해 활성을 보여주기 위해 도시 한 3- 하이드 록시 데카 노일-L 호모 세린 락톤 (3-OH-10 C -HSL), A.에 의해 사용되는 주요 정수 분자 baumannii가 (S1) (14). 생물막 중단의 올바른 평가를 위해, (이전 AHL 리간드를 격리시키는하지 않음) 각각의 촉매 비활성 효소는 즉시 컨트롤 (GKL의 D266N 돌연변이와 GKL E101G / R230C / D266N 돌연변이)로 하였다. 야생형 A.를 사용 게다가 baumannii가 S1, 돌연변이 Δ abaI 변형 (AHL 합성 효소 결핍)의 생물막 형성 능력도 테스트했다. 쿼럼 담금질 효소, 야생형 GKL과 GKL E101G / R230C 돌연변이는 모두 크게 사전에 생물막 형성을 감소 할 수 있었다처리 A. baumannii가 S1 문화 (N = 10 0.0001 ≤ P 값) (그림 1). 그럼에도 불구하고, 두 효소 생물막 중단의 범위는 3-OH-C (10) -HSL에 대한 효능에 비례하지 않는다. GKL E101G / R230C 돌연변이의 이직률 (K 고양이) 3-OH-C (10) -HSL (14)에 대한 야생형 GKL에 비해 6 배 더 빠르게입니다. 그러나, 효소 간의 생물막 붕괴의 정도에 차이가 두 배이다.
그림 1. A. baumannii의 바이오 필름 파괴 분석. biofilm 형성는 크리스탈 바이올렛 염색에 의해 측정 하였다. 적색 열이 야생형 A. 의해 형성된 바이오 필름의 양을 나타낸다 쿼럼 담금질 lactonases의 추가없이 baumannii가와 Δ abaI 돌연변이. 블루 열은 AMO를 나타냅니다야생형 A.에 의해 형성된 바이오 필름의 UNT 비활성 GKL의 D266N 돌연변이, 야생형 GKL, 비활성 GKL E101G / R230C / D266N 돌연변이와 GKL E101G / R230C 돌연변이 : 네 가지 GKL 효소의 존재 baumannii가. ****, P-≤ 0.0001의 값입니다. 항균제와 화학 요법 (58)의 허가를 재현, 1,802에서 1,805 사이 (2014). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
A의 공 초점 영상 baumannii의 S1 생물막의 형성은 이러한 정착 도메인의 구조적 형태에 정수 담금질 효과의 질적 및 양적 측정을 제공하기 위해 사용되었다. 향상된 GKL E101G / R230C 변이체 및 촉매 비활성 효소는 비교를 위해 사용 하였다. 차분 화상의 콘트라스트 (DIC) 이미지 (개선 GKL E101G / R230C 변이체 치료는 생물막의 크기의 감소를 초래한다는 Figur 나타났다예 2). 형광 이미지의 분석은 또한 개선 GKL E101G / R230C 변이체 (표 1)으로 처리 할 때 표면적, 바이오 매스 및 생물막의 평균 두께 감소가 있다는 것을 밝혔다.
A.도 2의 대표적인 공 초점 레이저 주사 현미경 이미지 baumannii가 생물막. A. baumannii의 생물막 비활성 GKL E101G / R230C / D266N 돌연변이 (A)와 GKL E101G / R230C 변이체 (B)로 처리하고 염색 하였다 렉 플 루어 WGA를 488-결합. 생물막 (왼쪽)와 생물막 (오른쪽)의 형광 이미지의 DIC 이미지는 대표 XY (센터), YZ (오른쪽)과 XZ (아래) 부분에 대한 표시됩니다. 항균제와 화학 요법 <허가를 재현강한> (58), 1802에서 1805 사이 (2014). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| SD의 ± 값 | |||
| 특성 | 어떤 치료하지 | 비활성 돌연변이와 치료 | E101G / R230C 돌연변이와 치료 |
| 바이오 매스 (μm의 3 / μm의 2) | 2.57 ± 1.65 | 3.39 ± 1.33 | 1.37 ** ± 0.20 |
| 평균 두께 (μm의) | 3.68 ± 2.51 | 3.41 ± 1.31 | 1.21 ** ± 0.21 |
| 표면적 (μm의) | 235,920.59 ± 79,456.46 | 209,872.6 ± 115,094.7 | 115,354.9 * ± 7,630.3 |
| N = 10 이미지 스택. **, P ≤ 0.001; * P ≤ 0.05, 비활성 E101G / R230C / D266N 돌연변이 치료와 비교. | |||
표 1. A. baumannii의 생물막 구조 정량.
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Discussion
실험의 두 세트에서, A. baumannii의 S1은 박테리아 (15)에 의해 형성된 바이오 필름의 양을 줄일 수있다 높은 염 농도의 NaCl없이 LB 배지에서 배양 하였다. 이러한 인공물의 존재는 생물막의 형성 량뿐만 아니라 다른 처리 조건에 걸쳐 정수 담금질 효소의 영향을 과소 있었다. 촉매 비활성 효소의 사용은 효소 격리의 가능한 효과를 제거하기 위해 음성 대조군 중요하다. 비활성 효소 쿼럼 분자를 격리시키는 경우에도 1은 그림, 생물막 형성은 중단되지 않습니다.
A. baumannii의 S1은 96 웰 플레이트의 웰에 공기와 액체의 계면 섬세 생물막 링형 구조를 형성한다. 따라서, 세균의 생물막 우발적 제거를 방지하기 위해 매체의 제거 및 세척 단계 동안 과도한 교반을 피하기 위해 중요하다. LB 미디어는 각 배양 후 제거플랑크톤 세포를 제거 할 수 있습니다. 또한, 96- 웰 플레이트에서 기류의 교란을 최소화하고 biofilm 형성 호의 마이크로 혐기성 환경을 만들기 위해 10 L 플라스틱 용기에 넣었다. 96 웰 플레이트에서 바이오 필름의 정량은 각 웰에 첨가 크리스탈 바이올렛의 양에 따라 달라집니다. 과량 크리스탈 바이올렛은 웰에 첨가되는 경우에는, 세척 단계의 수를 증가시킬 수있다. 크리스탈 바이올렛 염색 실험은 생물막 중단에 쿼럼 담금질 효율성의 상대 비교를 제공합니다. 크리스탈 바이올렛 염색이 바이오 필름의 형성을 측정하는 정량적이지만, 단지 정수 담금질 효소의 촉매 효율면에서 반 정량적이다. 정확한 통계적 비교를 위해 충분한 샘플 크기는 다른 처리 군에 중요하다. 아웃 라이어는 결과의 허위 진술을 방지하기 위해 제거해야합니다.
공 초점 이미지 및 세균성 생물막의 분석이다 USEF쿼럼 담금질 효소의 질적 효과를 평가하기위한 UL 도구입니다. 사용자 (활성 또는 비활성) 투여 정수 담금질 효소의 유형을 인식하는 경우에는 분석에 생물막을 선택하는 과정은, 바이어스 전위 채널 일 수있다. 바이어스의 가능성을 피하기 위해, 실험 효소 사용자로부터 정보를 제외하거나 선택을위한 임의의 방법을 사용하도록 설계 될 수있다. 편견 선택 전략은 CLSM에 의해 생물막 형태학의 더 나은 양적 비교를 할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이는 세균에 생물막 정수 담금질 효소의 결과를 평가하기위한 방법을 설명 첫 번째 연구이다. 크리스탈 바이올렛 염색 생물막 중단에 쿼럼 담금질 효소의 유틸리티를 보여 효소 'MODI의 operandorum은 세포 수 및 독성 인자의 발현을 감소에만 국한되지 않습니다 것을 밝혔다. 한편, CLSM 분석에 의해 결정 형태 학적 변화도 가능 molecul에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다이 효소의 AR 목표로하고있다. 현재 실험 세균 생물막에 효소를 예비 처리의 효과를 조사하기 위해 설계되었지만, 프로토콜은 세균 성장 후 효소를 첨가하여 예비 성형 된 생물막에 효소의 효과를 평가하기 위해 혈청을 사용하여 생리 학적 조건 하에서 그것의 능력을 검사하기 위해 수정 될 수있다 문화 -like 조건. GKL 효소를 연구하는 데 사용되는 프로토콜은 생물막의 중단의 관계를 조사하기 위해 다른 정수 담금질 효소 및 병원균으로 확장 될 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast Extract | BD | 212750 | |
| 96-well plate | Costar | 3596 | |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
| Acetic Acid | Lab-Scan | PLA00654X | Caution: Flammable |
| μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Alex Fluo 488-conjugated WGA | Invitrogen | W11261 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 141475095 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Caution: Corrosive |
| Synergy HT Microplate Reader | BioTek | ||
| 1X-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus |
References
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