Introduction
As opções de tratamento para doenças infecciosas tem sido complicada pelo aumento rápido em bactérias resistentes a múltiplas drogas que são imunes a uma vasta gama de medicamentos antibióticos 1. Com alta morbidade e mortalidade por infecções de bactérias resistentes mediadas, há uma necessidade de aumentar os processos de desenvolvimento de medicamentos e / ou explorar alternativas melhores anti-bacterianos para melhorar as opções terapêuticas. Ultimamente, a abordagem anti-virulência está ganhando o interesse dado o seu potencial na prevenção de virulência por métodos de não bactericidas, portanto, reduzir os riscos de mecanismos de resistência 2.
Quorum-sensing é um "interruptor mestre" na virulência bacteriana e interrupção desse fenômeno sinalização é um método anti-virulência promissora contra patogênese 3. O aparecimento de virulência exige a acumulação de moléculas de quorum no meio extracelular após uma densidade de população bacteriana crítico é atingido. Como quomoléculas rum difundir de volta para a matriz intracelular, a ligação com os seus receptores cognatos conduz à activação de factores de virulência, bem como os genes de resistência a antibióticos associados com a formação de biofilme e 4. Em geral, a interrupção quorum-sensing envolve inibir a molécula de quorum e interação receptor sem afetar as vias metabólicas primárias. Assim, ele não tem qualquer implicação direta no crescimento celular. Desde aptidão não seja comprometida, não há pressão de seleção mínima para as bactérias a evoluir e ganhar resistência contra tais tratamentos 5. Além disso, o sensor de quorum-perturbação pode interferir com os mecanismos de protecção bacterianas inerentes, como no caso da formação de biofilme, que fornece protecção de agentes anti-bacterianos e resposta imune do hospedeiro.
Estima-se que 99% dos micróbios da Terra existir em matrizes de biofilme complexo semelhante, conferindo sobrevivência vantagens cruciais para os microrganismos que vivem dentro thestruturas ese 6. Mais importante, a formação destes domínios sésseis é a causa de infecções hospitalares mais persistentes e crônicas 7. Acinetobacter baumannii é um dos principais patógenos humanos que está associado a infecções hospitalares globais e sua virulência é largamente atribuído à quorum-sensing a formação de biofilme mediada 8. Enzimas de têmpera de quorum foram usados com sucesso na interrupção de transdução de sinal mediada por quorum destinada a um grupo de compostos conhecidos como N-acil homoserina lactonas (AHLs) que são produzidos por bactérias gram-negativas 9. Vários estudos também expandiu o uso destas enzimas para bloquear patogênese bacteriana através da redução dos números de expressão fator de virulência e de células em biofilmes 10,11. Infelizmente, ainda há uma falta de demonstração palpável da utilização eficaz de enzimas para saciar quórum contra a formação de biofilme por patógenos bacterianos. ore têm sido as tentativas de usar inibidores de quórum (análogos de AHL), em vez de enzimas quórum para saciar, para perturbar A. baumannii formação de biofilme 12. Embora este método de utilização de inibidores de moléculas pequenas é uma aproximação válida, mantendo a sua biodisponibilidade em utilizações de translação pode ser um desafio. Pelo contrário, a utilização de enzimas de têmpera de quorum catalíticos pode contornar o problema de biodisponibilidade como enzimas são mais favorável no sentido de imobilização em superfícies de dispositivos biomédicos para efeitos terapêuticos.
Aqui, descrevemos uma avaliação dos efeitos da lactonases para saciar quórum engenharia de Geobacillus kaustophilus (GKL) 13 sobre a formação de biofilme bacteriano, utilizando a coloração violeta cristal e microscopia confocal de varredura a laser (CLSM). Este estudo é a primeira demonstração bem sucedida de biofilme interrupção em um A. clinicamente relevante estirpe baumannii S1 usando enzimas de quórum para saciar. Os métodos descritosneste estudo são úteis para avaliar a eficácia de outras enzimas para saciar quórum nos esforços de desenvolvimento terapêuticas posteriores contra bactérias Gram-negativas patogénicas.
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Protocol
1. Cristal Violeta quantificação da formação do biofilme em A. baumannii S1
- Crescer uma cultura de 5 ml de A. baumannii S1 em caldo Lisogenia (LB) (triptona 10 g / L, extracto de levedura 5 g / L) a 30 ° C numa incubadora com agitação (220 rpm) durante 16 horas.
- Ajustar a cultura de A. baumannii S1 para uma densidade óptica desejada 600 de 0,8. Usando uma placa de 96 poços, a cultura das bactérias inocular (1: 100 de diluição) em LB fresco contendo 10 ul de enzima purificado GKL (40 mg / ml); volume final da nova cultura é de 100 uL.
- Prepara-se uma cultura de controlo, bem; Isto não irá conter qualquer enzima. Repetir condições semelhantes, para se obter o número desejado de repetições.
- Cobrir a placa com uma tampa e colocá-lo num recipiente de 10 L de plástico selado. Incubar a placa a 30 ° C durante 3 h antes de remover suavemente a mídia.
- Adicionar mais 100 mL de meio LB fresco para o poço e incubar a placa durante 21 horas a 30 ° C. Após o segundo período de incubação, remova cuidadosamente todos os meios de comunicação. Lavar a célula bactérias planctônicas com 200 mL de água estéril. Assegure-se que existe apenas uma perturbação mínima para as células durante a lavagem.
- Adicionar 100 uL de solução de violeta de cristal a 1% a cada poço e incubar durante 15 min à temperatura ambiente. Remover a solução de cristal violeta por lavagem do poço com 200 ul de água estéril. Repita a lavagem por mais duas vezes.
- Adicionar 100 ul de ácido acético a 33% a cada poço e incubar durante 15 min com agitação suave; isto irá dissolver o corante.
- Quantificar a quantidade de biofilme formado através da medição da absorvância de cristal violeta a 600 nm. A quantidade de cristal violeta é proporcional à quantidade de biofilme formado.
2. Confocal Laser Scanning Microscopy de A. baumannii S1 biofilme
- Crescer uma cultura de 5 ml de A. baumannii S1 em LB a 30 ° C numa incubadora com agitação (220 rpm) durante 16 horas.
- de Anúnciosapenas a cultura de A. baumannii S1 para uma densidade óptica desejada 600 de 0,8. Usando um 35 mm μ-lavar com fundo de vidro, inocular a cultura de bactérias (diluição 1: 100) em LB fresco contendo 30 ul de enzima purificado GKL (40 mg / ml); volume final da nova cultura é de 1 ml.
- Cubra o μ-Prato com uma tampa e coloque-o em um recipiente de 10 L de plástico selado. Incubar a μ-louça a 30 ° C durante 3 horas antes de remover suavemente a mídia. Adicionar 30 ul de enzima purificado e GKL meio fresco, trazê-lo para um volume total de 1 ml. Incubar durante mais 21 h a 30 ° C.
- Repetir o passo 2.3 e incubar o μ-Dish durante mais 24 h a 30 ° C. Em seguida, retire cuidadosamente a mídia.
- Adicionar 500 uL de 5 ug / ml de Alex Fluo-488 conjugado com aglutinina de gérmen de trigo (WGA), dissolvido em solução salina equilibrada de Hank (HBSS) para o prato e μ-incubar a 37 ° C durante 30 min; isto irá manchar o biofilme formado. Remover a solução de coloração e lavá tele u-Dish com 2 ml de HBSS. Repetir o passo de lavagem mais uma vez.
- Adicionar 500 ul de 3,7% de formaldeído dissolvido em HBSS e incubar a 37 ° C durante 30 min; isso vai resolver o biofilme para a μ-Dish. Lave o μ-Dish uma vez com 2 ml de HBSS e depois remover a solução completamente. O prato fixo-μ com biofilme pode ser armazenada no escuro a 4 ° C antes da imagiologia CLSM.
- Para imagens CLSM e análise, usar 63 vezes de ampliação para gerar 97 pilhas por imagem, com um intervalo de 0,21 mm por pilha.
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Representative Results
Na quantificação experimento de cristal violeta, duas enzimas quórum para saciar foram usadas para demonstrar viabilidade em perturbar a formação de biofilme: wild-type GKL e um melhorada GKL mutante duplo (E101G / R230C). Ambas as enzimas foram mostrados para demonstrar actividade contra lactonase 3-hidroxi-decanoil-L-homo-serina lactona (3-OH C-10 -HSL), a principal molécula de quorum utilizados por A. baumannii S1 14. Para avaliação válida do biofilme rompimento, seus respectivos enzimas cataliticamente inativos (anteriormente mostrados para não seqüestrar ligantes AHL) também foram incluídos como controles imediatos (GKL D266N mutante E101G e GKL / R230C / mutante D266N). Além de usar o tipo selvagem A. baumannii S1, a capacidade de formação de biofilme de uma estirpe mutante Δ AAI (AHL sintetase deficiente) também foi testada. Ambas as enzimas quórum para saciar, do tipo selvagem GKL e GKL E101G / R230C mutantes foram capazes de reduzir significativamente a formação de biofilme em preA. tratada culturas baumannii S1 (n = 10; p-valor ≤ 0,0001) (Figura 1). No entanto, o grau de perturbação de biofilme para ambas as enzimas não é proporcional à sua eficácia contra o 3-OH C-10 -HSL. A taxa de rotação (kcat) da GKL E101G / R230C mutante é de seis vezes mais rapidamente que o tipo selvagem contra GKL 3-OH C-10 -HSL 14. No entanto, a diferença no ponto de interrupção de biofilme entre as enzimas é apenas duas vezes.
Figura 1. A. formação baumannii ensaio biofilme ruptura. O biofilme foi medido por coloração com violeta de cristal. Colunas vermelhas representam a quantidade de biofilme formado por selvagem tipo A. baumannii e Δ Abai mutante, sem a adição de lactonases quórum para saciar. Colunas azuis representam o amount do biofilme formado por de tipo selvagem A. baumannii na presença de quatro enzimas GKL diferentes: inativa GKL mutantes D266N, do tipo selvagem GKL, inativo GKL E101G / R230C / mutantes D266N e GKL E101G / R230C mutantes. ****, P- valor de ≤ 0,0001. Reproduzido com permissão de Agentes Antimicrobianos e Quimioterapia 58, 1802-1805 (2014). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Imagem confocal de A. a formação de biofilme baumannii S1 foi utilizado para proporcionar uma medida qualitativa e quantitativa dos efeitos de quorum-quenching na morfologia estrutural destes domínios sésseis. O mutante E101G melhorada GKL / R230C e a sua enzima cataliticamente inactivo foram usadas para comparação. O contraste de imagem diferencial imagem (DIC) mostrou que o tratamento com uma maior GKL E101G / R230C mutante resultou numa diminuição no tamanho do biofilme (Figure 2). Análise de as imagens de fluorescência também revelou que houve uma redução na área de superfície, a biomassa e a espessura média de biofilme quando tratados com o melhorada GKL E101G / mutante R230C (Tabela 1).
2. Representante imagens de microscopia confocal de varrimento laser Figura de A. biofilmes baumannii. A. biofilmes baumannii foram tratados com inativos GKL E101G / R230C / mutante D266N (A) e GKL E101G / mutante R230C (B) e corados com Alexa Fluor 488 conjugado de WGA. Imagens DIC dos biofilmes (esquerda) e imagens de fluorescência dos biofilmes (à direita) são mostradas para xy representante (centro), yz (à direita), e xz seções (fundo). Reproduzido com permissão de Agentes Antimicrobianos e Quimioterapia <strong> 58, 1802-1805 (2014). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Valor ± SD um | |||
| Característica | Nenhum tratamento | O tratamento com o mutante inactivo | O tratamento com E101G / mutante R230C |
| Biomassa (uM 3 / uM 2) | 2,57 ± 1,65 | 3,39 ± 1,33 | ** 1,37 ± 0,20 |
| Espessura Média (mm) | 3,68 ± 2,51 | 3,41 ± 1,31 | ** 1,21 ± 0,21 |
| Área (mm) | 235,920.59 79,456.46 ± | 209,872.6 115,094.7 ± | 1* 15,354.9 7,630.3 ± |
| a n = 10 pilhas de imagens. **, P ≤ 0,001; *, P ≤ 0,05, em comparação com o tratamento com inativos E101G / R230C / mutante D266N. | |||
Tabela 1. A. baumannii biofilme quantificação estrutural.
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Discussion
Em ambos os conjuntos de experiência, A. baumannii S1 foi cultivada em meio LB sem NaCl como uma concentração elevada de sal pode reduzir a quantidade de biofilme formado pelas bactérias 15. A presença de tal artefacto pode subestimar a quantidade de biofilme formado, bem como os efeitos de enzimas de têmpera de quorum em diferentes condições de tratamento. O uso de uma enzima cataliticamente inactivo é importante como um controlo negativo para eliminar os possíveis efeitos de sequestro de enzima. A Figura 1 mostra que, mesmo que as enzimas inactivas sequestram moléculas de quorum, a formação de biofilmes não é interrompido.
A. baumannii S1 forma uma estrutura delicada biofilme em forma de anel entre o ar e a interface de líquido na cavidade da placa de 96 poços. Por isso, é crucial para evitar a agitação excessiva durante a remoção e lavagem de mídia medidas para evitar a remoção acidental de biofilme bacteriano. Meio LB foi removido após cada incubação aeliminar células planctônicas. Além disso, a placa de 96 poços foi colocado num recipiente de plástico de 10 L para minimizar perturbações no fluxo de ar e para criar um ambiente micro-anaeróbia, que favorece a formação de biofilme. Quantificação de biofilme em uma placa de 96 poços também é dependente da quantidade de violeta de cristal a cada poço. No caso em que o excesso de violeta de cristal é adicionado dentro de um poço, o número de passos de lavagem pode ser aumentada. O experimento coloração violeta cristal fornece uma comparação relativa da eficiência de quorum-extinção em biofilme interrupções. Embora coloração violeta cristal é quantitativo para medir a formação de biofilme, é apenas semi-quantitativa em termos de eficiência catalítica de enzimas quórum para saciar. Para comparação estatística precisa, os tamanhos das amostras são suficientes importante para os diferentes grupos de tratamento. Outliers também devem ser removidas para evitar a manipulação de resultados.
De imagem e análise de biofilme bacteriano confocal é um useful ferramenta para avaliar os efeitos qualitativos de enzimas para saciar quórum. No entanto, o processo de selecção de biofilme para análise podem ser um canal de potencial de polarização, se o utilizador está ciente do tipo de enzima de quorum-têmpera administrado (activo ou inactivo). Para evitar a possibilidade de polarização, a experiência pode ser concebido para excluir informações enzima do utilizador ou utilizar uma abordagem para a selecção aleatória. Uma estratégia de seleção imparcial também permite uma melhor comparação quantitativa de morfologias de biofilme por CLSM. No entanto, este é o primeiro estudo que descreve um método para avaliar o resultado de enzimas de têmpera de quorum em biofilmes bacterianas. Coloração com violeta de cristal tem demonstrado a utilidade de enzimas de têmpera de quorum em biofilme perturbações e revelou que Modi operandorum 'enzimas não se limitam a reduzir o número de células e expressão de fator de virulência. Enquanto isso, as alterações morfológicas determinadas pela análise CLSM também pode fornecer insights sobre possíveis moleculAR alvos destas enzimas. Embora o experimento foi desenhado para investigar os efeitos de enzimas de pré-tratamento em biofilmes bacterianas, o protocolo pode ser modificado para se avaliar o efeito da enzima no biofilme pré-formado pela adição da enzima após o crescimento bacteriano ou para examinar a sua competência sob condições fisiológicas, através da utilização de soro -como condições para a Cultura. O protocolo usado para estudar as enzimas GKL pode ser alargado a outras enzimas e agentes patogénicos quórum para saciar a investigar sua relação no biofilme interrupções.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast Extract | BD | 212750 | |
| 96-well plate | Costar | 3596 | |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
| Acetic Acid | Lab-Scan | PLA00654X | Caution: Flammable |
| μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Alex Fluo 488-conjugated WGA | Invitrogen | W11261 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 141475095 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Caution: Corrosive |
| Synergy HT Microplate Reader | BioTek | ||
| 1X-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus |
References
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