Introduction
Cellule immunitarie innate costituiscono una quota essenziale delle cellule all'interno del microambiente tumorale e sono stati associati con la malignità del tumore nei pazienti e modelli animali di cancro 1. Recentemente, è diventato più ampiamente apprezzati che le risposte immunitarie croniche giocano ruoli critici nella promozione progressione tumorale, metastasi e resistenza alle chemioterapie 2. I macrofagi sono importanti cellule immunitarie innate che hanno dimostrato di regolare direttamente la risposta delle cellule tumorali alla chemioterapia 3,4. Tuttavia, il ruolo dei neutrofili, i principali attori del sistema immunitario innato, nella regolazione della risposta del tumore alla terapia anti-cancro non è noto. Gli obiettivi di questi protocolli sono di utilizzare un metodo veloce e credibile per separare neutrofili da campioni di sangue CLL del paziente e di differenziare le cellule HL60 lungo il percorso granulocitica al fine di studiare il loro ruolo nel regolare la sensibilità delle cellule di linfoma di agenti anti-linfoma.
5 e ad agire come una prima linea di difesa contro i microrganismi invasori 6. I neutrofili hanno un ruolo essenziale nella nascente efficaci risposte immunitarie innate, oltre alle funzioni effettrici variabili in diverse condizioni patologiche 7. Pertanto, un metodo veloce e credibile isolare neutrofili dalle altre cellule del sangue, come metodo di separazione gradiente di densità, è necessaria per gli studi in vitro. Usando questo metodo per l'isolamento dei neutrofili faciliterà ulteriori ricerche sulle funzioni immunologiche neutrofilo-mediata in vivo ed ex vivo.
La possibilità di ottenere popolazioni pure di neutrofili è un primo passo importante per lo studio di pazienti con malattie immunologiche 8. Densità metodo di separazione gradiente è una tecnica ideale in cui si ottiene un elevato rendimento di cellule. il method comporta l'aggiunta di soluzione gradiente di densità nella parte inferiore di un tubo contenente sangue umano diluito seguita da centrifugazione a 300 g per 35 min senza interruzione. L'anello delle cellule mononucleari appare a livello di interfaccia e neutrofili risiedere al di sotto del primo. Questo metodo ha vantaggi significativi rispetto ad altri metodi disponibili come kit di isolamento dei neutrofili che sono molto più costosi 9. Inoltre, isolando neutrofili dal sangue umano da kit commerciali utilizzando anticorpi diretti ad un marcatore di superficie specifico per neutrofili umani, aumentare il rischio di attivazione delle cellule o la differenziazione. Densità metodo di separazione gradiente consente l'isolamento dei neutrofili entro un breve periodo di tempo. Entro lo stesso passo, cellule mononucleari vengono separati e recuperati. E 'una tecnica fondamentale in cui si ottiene un elevato rendimento di cellule puri per conseguire integrità funzionale.
Al fine di simulare il microenv tumoreironment, sono stati effettuati esperimenti di 3D. Data la breve emivita dei neutrofili in vitro, gli esperimenti 3D con neutrofili umani freschi non sono conclusivi. Per questo motivo, promielocitica cellule (HL60) vengono indotte a differenziarsi in cellule neutrofili simili che utilizzano gli induttori di differenziazione dimetilsolfossido (DMSO) e l'acido retinoico (RA). Utilizzando cellule HL60 differenziate (HL60 diff) impedirà avere diverse risposte dei neutrofili a causa di isolamento da diversi donatori.
In 3D vitro modelli di coltura rappresentano una fase intermedia tra i modelli in 2D in vitro e in modelli in vivo. Nella cultura 2D, le cellule sparse sulla superficie di plastica formando allegati cellulari innaturali alle proteine depositati che sono denaturate su questa superficie sintetica. Viceversa, le cellule allegati cellula-cellula naturale forma coltura 3D poiché le cellule e la matrice extracellulare sintetizzano sono il materiale naturale a cui sono attaccati.Per questo motivo, i modelli co-coltura 3D, in particolare tra le cellule tumorali e di altri tipi di cellule, sono stati molto utili per indicare il loro contributo alla crescita del tumore, l'angiogenesi, e le metastasi. Come risultato, culture 3D rendono la coltura cellulare mimare le condizioni fisiologiche che esistono in vivo 10.
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Protocol
1. neutrofili Isolamento e co-coltura con cellule leucemiche primarie
NOTA: Le procedure sono state condotte sotto l'approvazione del comitato etico dell'ospedale di Lione, con tutti i pazienti che firmano un consenso informato.
- Isolamento di cellule leucemiche primarie e neutrofili
- Raccogliere tubi di sangue periferico in EDTA (1,8 mg EDTA per millilitro di sangue) da pazienti con diagnosi di leucemia linfatica cronica (LLC).
- Aggiungere ogni 15 ml di sangue in una provetta sterile 50 ml e diluire con 15 ml di RPMI (diluizione 1: 1), poi accuratamente e aggiungere lentamente 15 ml di soluzione di gradiente di densità al fondo del tubo senza mescolare le fasi. Assicurarsi che la soluzione gradiente di densità è a RT per la preparazione.
- Centrifugare a 300 xg per 35 minuti a temperatura ambiente e senza freno. Il sangue deve separare in quattro fasi distinte, come mostrato in figura 1A, dall'alto verso il basso: piastrine e plasma, cellule mononucleate (wanello Hite), soluzione gradiente di densità, i granulociti ed eritrociti.
- Raccogliere l'anello bianco che rappresenta le cellule leucemiche primarie con una pipetta di plastica Pasteur e trasferire in una nuova provetta da 50 ml.
- Riempire il tubo con PBS (contiene calcio e magnesio) fino a 50 ml in totale e centrifugare a 300 g per 10 min a RT.
- Risospendere il pellet con 5 ml di PBS quindi aggiungere PBS fino a 50 ml in totale e centrifugare a 300 g per 10 minuti a RT.
- Risospendere il pellet con mezzo completo RPMI (RPMI 1640 addizionato con siero fetale bovino 10% (FBS), 2 mM glutammina, 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina) per il conteggio utilizzando contatore vitalità cellulare.
- Aspirare le fasi superiori lasciando la fase di granulociti e eritrociti e aggiungere PBS fino a 25 ml quindi aggiungere 3% di destrano a 0,9% NaClup a 50 ml in totale. Miscelare le provette 10 volte e tenerli per 30 min a temperatura ambiente senza mescolare.
- Raccogliere il superiore RBC-poveri uno strato neutrofilid metterli in una sterile tubo da 50 ml pulita e centrifugare le provette a 300 g per 10 minuti a temperatura ambiente. Risospendere ogni pellet con 5 ml di PBS poi aggiungere rosso tampone di lisi delle cellule fino a 50 ml in totale.
- Conservare le provette al buio per 15 minuti a RT quindi si centrifuga a 500 g per 10 minuti a RT. Lavare il pellet con PBS (PBS aggiungere fino a 50 ml in totale) centrifugare a 500 g per 10 minuti a RT.
- Risospendere il pellet con terreno completo RPMI per il conteggio utilizzando contatore vitalità cellulare. Mantenere 3 x 10 5 di ogni tipo di cellula in 50 microlitri di PBS-FBS (4%) in 5 ml tubi di plastica per determinare la purezza del loro isolamento mediante citometria a flusso.
- Analizzare Aspetti morfologici delle isolate popolazioni di cellule
- Per fare ciò, risospendere ogni 3 x 10 4 neutrofili e 3 x 10 4 cellule mononucleari in 150 ml completo RPMI. Montare i vetrini, carte di filtro, e le camere del campione nella centrifuga cytospin, assicurando che tegli centrifugare è ben equilibrato.
- Posizionare ogni tipo di cellula nella camera del campione e cito-centrifugare a 750 xg per 10 min a RT Rimuovere i vetrini, schede filtro e camere per campioni dalla centrifuga. Smontare con attenzione, in modo da non danneggiare le cellule sul vetrino. Scarta le carte di filtro e le camere del campione.
- Macchiare le cellule utilizzando kit di colorazione Giemsa e mantenere le diapositive per 1 ora a secco. Esaminare le cellule al microscopio con ingrandimento 100X.
- Verificare la purezza di cellule isolate da FACS
- Etichettare le isolate cellule leucemiche primarie con anticorpi CD19 anti-umano coniugato con APC (5 ml / 10 6 celle). Etichetta i neutrofili purificati con una miscela di anticorpi anti-umani elencati nella Tabella 1 (5 microlitri / 10 6 cellule). Incubare le cellule nel buio per 30 min a 4 ° C.
- Lavare le cellule con 500 microlitri di PBS-FBS (4%) la centrifuga le provette a 300 g per 5 minuti a RT.
- Risospendere ogni pellet in 200 microlitri di PBS-FBS (4%).
- Analizzare su un citofluorimetro utilizzando la seguente configurazione ottica: 488 nm laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), coniugati (530/30 BP), PerCP-Cy5.5 (695/40 BP ), PE (575/26 BP); 633 nm laser: APC (660/20 BP), APC-Cy7 (780/60 BP). Assicurarsi che la compensazione del colore.
- Coculture di cellule leucemiche primari con autologo neutrofili
- Seed 2 x 10 5 cellule / ml di solo o con neutrofili autologhe al rapporto 1:10 in mezzo completo RPMI cellule leucemiche primarie. Per fare ciò, regolare il numero di cellule diluendo sospensioni cellulari e aggiungere 2 x 10 5 cellule / ml di cellule leucemiche primarie a 2 x 10 6 cellule / ml neutrofili. Mescolare con cura.
- Aggiungere 25 micron di tirosina chinasi (Btk) inibitore di Bruton (Ibrutinib) alle cellule. Incubare per 24 ore a 37 ° C con 5% di CO 2.
- Cellulare Raccolta e analisi FACS
- Collect le cellule in provette di plastica 5 ml per analisi FACS e centrifugare le provette a 300 g per 5 minuti a RT. Lavare il pellet con 1 ml di PBS-FBS (4%) e centrifugare a 300 g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- pellet Risospendere in annessina V e PI utilizzando kit commerciale e incubare le cellule nel buio per 10 minuti a temperatura ambiente. Analizzare su un citofluorimetro utilizzando la strategia di controllo dell'immagine figura 2A e la seguente configurazione ottica: laser a 488 nm: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), coniugati (530/30 BP), PI (610 / 20 BP). Assicurarsi che la compensazione del colore.
2. differenziazione delle cellule HL60 lungo la granulocitica Pathway e la loro co-coltura con cellule RL linfoma B in 3D del modello
- Differenziazione delle promielocitica umana (HL60), le cellule in cellule simil-neutrofili
- Regolare il numero di cellule HL60 a 3 x 10 5 cellule / ml quindi aggiungere 1 mM acido retinoico (RA) e 1,25% DMSO per indurre la loro differenziazione. Seed ogni 3 x 10 5 2.
- Successivamente, raccogliere le cellule e centrifugare a 300 g per 5 minuti a RT. Risospendere le cellule con terreno completo RPMI per il conteggio utilizzando contatore vitalità cellulare.
- Poi diluire sospensione di cellule in mezzo completo RPMI per regolare il numero di cellule HL60 a 3 x 10 5 cellule / ml e indurre nuovamente la loro differenziazione aggiungendo 1 mM di acido retinoico (RA) e 1,25% DMSO. Seme ogni 3 x 10 5 HL60 cellule per pozzetto nella piastra a 48 pozzetti e incubare per altri 48 ore a 37 ° C con 5% di CO 2.
- Analisi di differenziazione HL60 (HL60 diff)
- Raccogliere le cellule e centrifugare le provette a 300 g per 5 minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet con mezzo completo RPMI per il conteggio utilizzando contatore vitalità cellulare.
- Per analizzare i cambiamenti nell'espressione marcatori di superficie cellulare mediante citometria di flusso. Posizionare ogni 3 x 10 5 5 cellule HL60 diff in provette di plastica 5 ml per analisi FACS e centrifugare le provette a 300 g per 5 minuti a RT.
- Risospendere il pellet in 50 microlitri di PBS-FBS (4%). Etichettare le cellule con CD11b anti-umano coniugati con AF700 o CD38 anti-umano coniugato con APC (5 ml / 10 6 celle). Incubare le cellule nel buio per 30 min a 4 ° C.
- Lavare con 500 microlitri di PBS-FBS (4%) e centrifugare a 300 g per 5 minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet in 200 microlitri di PBS-FBS (4%).
- Analizzare il citofluorimetro utilizzando la strategia di gating della figura 3A e la seguente configurazione ottica: 488 nm laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP); 633 nm laser: APC (660/20 BP), Alexa Fluor 700 (730/45 BP).
- Per testare i cambiamenti morfologici a HL60 diff, immobilizzare le cellule su vetrini per l'esame microscopico.
- Per fare ciò, risospendere ogni 3 x 10
- Posizionare ogni tipo di cellula nella camera del campione e cito-centrifugare a 1500 rpm per 10 minuti a RT. Rimuovere le diapositive, le carte di filtro, e le camere di campioni dalla centrifuga. Smontare con attenzione, in modo da non danneggiare le cellule sul vetrino. Scarta le carte di filtro e le camere del campione.
- Macchiare le cellule utilizzando kit di colorazione Giemsa e mantenere le diapositive per 1 ora a secco. Esaminare le cellule al microscopio con ingrandimento 100X.
- Per fare ciò, risospendere ogni 3 x 10
- 3 dimensioni (3D) Cultura
NOTA: Assicurarsi che i materiali utilizzati in questo esperimento sono freddi e l'esperimento sta prendendo posto sul ghiaccio.- Risospendere ogni 5 x 10 4 cellule RL, da solo o in miscela con HL60 diff diff 01:10, con matrice di membrana basale di 300 ml con 1 ml di punta della pipetta tagliata con una forbice sterile, al fine di ampliare l'apertura di circa 2 a 3 mm. Evitare le bolle durante questa fase.
- Seed ogni 300 ml di sospensione cellulare / bene in 24-pozzetti. Evitare le bolle durante questa fase. Incubare la piastra per 30 minuti a 37 ° C con 5% di CO 2 si aggiunge 1 ml completare terreno RPMI per ciascun pozzetto ed incubare per 7 giorni a 37 ° C con 5% di CO 2. Cambiare la media ogni due giorni. Aggiungere 10 nM vincristina al giorno 5.
- Analisi FACS
- Dopo 7 giorni di coltura, aspirare il terreno e lavare i pozzetti con 1 ml di PBS ghiacciata due volte. Aggiungere 3 ml / pozzetto di PBS ghiacciato-EDTA (5 mm). Rimuovere il gel dal fondo del pozzo raschiando utilizzando il fondo di 200 microlitri punta della pipetta. Agitare delicatamente la piastra in ghiaccio per 30 min.
- Trasferire sospensione cellulare in sterile tubo da 15 ml e agitare i tubi delicatamente ice per altri 30 min. Controllare l'aspetto di sospensione omogenea. (Se non è il caso, quindi agitare le cellule per un tempo più lungo o aggiungere più PBS-EDTA).
- Centrifugare le provette a 300 xg per 10 min a RT. Lavare il pellet con PBS poi centrifugare a 300 xg per 10 min a RT.
- Risospendere con PBS-FBS (4%) e l'etichetta con l'anticorpo CD19 anti-umano coniugato con PE-Cy7 e anticorpi CD38 anti-umano coniugato con APC (5 ml / 10 6 celle). Incubare al buio per 30 minuti a 4 ° C.
- Lavare con 500 microlitri di PBS-FBS (4%) poi provette per centrifuga a 300 g per 5 minuti a temperatura ambiente. Risospendere le cellule con annessina V e PI utilizzando il kit commerciale.
- Analizzare il citofluorimetro utilizzando la strategia di gating della figura 4A e la seguente configurazione ottica: 488 nm laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), coniugati (530/30 BP), PI (610 / 20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP); 633 nm laser: APC (660/20 BP). Assicurarsi che la compensazione del colore.
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Representative Results
Densità metodo di separazione gradiente qui descritto fornisce cellule leucemiche primarie e neutrofili non stimolate isolate dal sangue di pazienti affetti da LLC figura 1A rappresenta i diversi livelli di sangue ottenuti dopo gradiente di densità centrifugazione (dall'alto verso il basso:. Piastrine e plasma, anello bianco rappresenta le cellule mononucleate, gradiente di densità soluzione, granulociti e eritrociti). Figura 1B e 1C mostrano le differenze nelle apparenze morfologiche tra i neutrofili (cellule di multi-lobi nuclei) e le cellule mononucleate rispettivamente.
Risultati in Figura 1D rappresentano il forward-scatter (FSC) vs side-scatter (SSC) appezzamento di cellule leucemiche primarie (cellule mononucleate). Etichettare questa popolazione con CD19 anti-umano coniugato con APC mostra uno spostamento a destra completo dell'istogramma (Figura 1E) con un solopicco che indica che questa popolazione è positiva per CD19 e puro. I neutrofili sono anche puro ≥90% come verificato mediante citometria di flusso dopo l'etichettatura dei neutrofili isolati con una miscela di anticorpi monoclonali coniugati a fluorocromi elencati nella tabella 1. Figura 1F rappresenta FSC vs SSC diagramma a dispersione dei neutrofili isolati che sono positivi per CD45 (Figura 1G), positivo per CD15 e negativo per CD14 (Figura 1 H), positivo sia per CD15 e CD16 (Figura 1I), positivo per CD16 e negativo per CD56 (Figura 1 undecies).
Figura 1. Analisi delle Apparizioni morfologici e la purezza delle cellule leucemiche primarie e neutrofili isolati dal sangue dei pazienti. (A) Rappresentazione schematica rappresenta diversi strati di sangue dopo gradi densitàent centrifugazione. (BC) Giemsa rappresenta le differenze morfologiche tra i neutrofili (B) e (C) cellule leucemiche (cellule mononucleate) primarie. Le foto sono state scattate da microscopio con ingrandimento 100X. (D) Forward-scatter (FSC) e side-scatter (SSC) trama rappresenta il isolato popolazione di cellule leucemiche primarie. (E) isolate cellule leucemiche primarie sono stati etichettati con anti-CD19-APC e analizzati per l'espressione di CD19. La linea rossa indica le cellule senza etichetta e la linea blu indica cellule marcate con anti-CD19-APC. (F) FSC vs trama SSC dispersione rappresenta la popolazione dei neutrofili isolati. (GJ) neutrofili isolati sono stati etichettati con una miscela di anticorpi elencati nella tabella 1 e analizzati per l'espressione di (G) CD45, (H) CD14 e CD15, (I) CD15 e CD16, (J) CD16 und CD56. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Gli antigeni | fluorocromo | Clone |
| CD14 | APC-Vio770 (Cy-7) | TÜK4 |
| CD15 | APC | VIMC6 |
| CD16 | FITC | VEP13 |
| CD45 | PerCP-Vio700 (Cy5.5) | 5B1 |
| CD56 | PE | AF12-7H3 |
Tabella 1. coniugato a un fluorocromo purificati monoclonali anticorpi utilizzati per verificare la purezza isolato neutrofili. Tutti gli anticorpi sono stati ottenuti da Miltenyi biotech.
figura 2A rappresenta le porte di neutrofili e di cellule leucemiche primarie. I neutrofili sono molto più granulari rispetto alle cellule leucemiche primarie in modo da apparire con una maggiore SSC. Gating sulle cellule leucemiche primarie co-coltura con neutrofili in presenza di Ibrutinib, risultati mostrano percentuale di cellule vive (Figura 2C, 84.8%) rispetto alle cellule coltivate solo (Figura 2B, 53,1%). Il grafico di dialogo nella figura 2D mostra che i decrease di vitalità cellulare indotta da Ibrutinib era significativamente inibito dalla presenza di neutrofili (40,1 ± 3,1 vs 60,1 ± 3,5, p <0.001, 19 pazienti).
Figura 2. autologo neutrofili proteggere le cellule leucemiche primaria contro Ibrutinib. Il sangue è stato raccolto da pazienti con diagnosi di leucemia linfatica cronica (LLC). cellule leucemiche primarie sono state isolate e coltivate da soli o insieme con neutrofili autologhe (N) a cellule leucemiche primarie Nratio 01:10 per 24 ore, in presenza o assenza di 25 pM Ibrutinib. La percentuale di cellule leucemiche primarie in tempo reale (Allegato IV V negativo / PI negativo) è stata misurata mediante doppia colorazione con annessina V-FITC e PI, seguita da analisi di citometria di flusso. (A) Forward-scatter (FSC) e side-scatter (SSC) trama rappresenta le porte di neutrofili e di cellule leucemiche primarie. (B) Bi-dimensionale dot-blot mostra la percentuale di cellule leucemiche primarie vivi e apoptotici coltivate solo e trattati con 25 mM Ibrutinib. (C) Bi-dimensionale dot-blot mostra la percentuale di cellule leucemiche primarie vivi e apoptotici cooperazione coltivate con neutrofili e trattati con 25 mM Ibrutinib. trama (D) Box rappresenta la percentuale di vivo cellule leucemiche primarie di 19 pazienti. I dati sono espressi come media ± SD. *** p <0.001 Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
La breve emivita di neutrofili in vitro rende il loro uso nella cultura 3D inefficace. La differenziazione delle cellule HL60 lungo il percorso granulocitica è stata indotta da induttori di differenziazione. Due diversi parametri (marcatori di superficie cellulare espressione e morfologica changes) sono stati utilizzati per misurare la differenziazione di HL60. FSC vs SSC plot dispersione nella figura 3A mostrano che le cellule HL60 sono di dimensioni maggiori rispetto alle cellule HL60 diff con una maggiore FSC. Etichettare le cellule (HL60 o HL60 diff) con anticorpi CD11b anti-umano coniugato con AF700 e CD38antibody anti-umano coniugato con APC mostra un aumento CD11b e CD38 (Figura 3B) su differenziazione, che è indicativo di differenziazione granulocitica. Cellule HL60 diff mostrano anche cambiamenti morfologici rilevati dalla comparsa di nuclei multilobata (Figura 3C).
Figura 3. parametri strutturali di cellule differenziate HL60. (A) Forward-scatter (FSC) e side-scatter (SSC) trame rappresentano HL60 e le cellule HL60 differenziate (HL60 diff). (B) HL60 e HCellule diff L60 sono stati etichettati con anti-CD11b-AF700 o anti-CD38-APC seguita da analisi di citometria a flusso. Dopo gating su ogni popolazione cellulare nel FSC-A vs SSC-A grafico a dispersione (A), le cellule sono state analizzate per le espressioni di CD11b e CD38. Celle (C) HL60 mostrano cambiamenti morfologici coerenti con la differenziazione verso granulociti. Le foto sono state scattate da microscopio con ingrandimento 100X. Bold freccia nera punta il nucleo multi-lobata. I grafici sono rappresentativi di cinque esperimenti indipendenti. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Per testare l'effetto di cellule HL60 diff sulla normalizzazione risposta cellulare RL a vincristina nel modello 3D, cellule RL state coltivate solo o con HL60 diff nella matrice membrana basale in presenza o assenza di vincristina a 10 nM. Usando la strategia di gating mostrato nella Figura 4A, entrambe le popolazioni sono discriminati sulla base di espressione CD19 e CD38; Cellule RL positivi per le cellule CD19 diff e HL60 positive per CD38. Gating su cellule RL co-coltura con cellule HL60 diff in presenza di vincristina, risultati mostrano percentuale di cellule vive (Figura 4C, 35,9%) rispetto alle cellule coltivate RL sola (Figura 4B, 19,7%). Il grafico nella figura 4D mostra un aumento significativo nella percentuale di cellule vive RL (CD19 Annessina V positivo negativo / PI negativo) in presenza di cellule HL60 diff (19,5 ± 0,2 vs 33,1 ± 1.0, p <0.001).
Figura 4. cellule HL60 diff neutrofili come proteggere le cellule RL linfoma contro Vincristina nella cultura 3D. Cellule RL sono state coltivate da soli o insieme con le cellule HL60 diff a RL: rapporto diff HL60 1:10 per 7 giorni a matrice di membrana basale. Il giorno 5, vincristina (VCR) è stato aggiunto ad una concentrazione di 10 nM. Sferoidi sono state dissociate il giorno 7 e cellule sono state marcate con anti-CD19-PECy7 e anti-CD38-APC poi risospeso con annessina V-FITC e PI seguita da analisi di citometria di flusso. (A) Forward-scatter (FSC) e side-scatter (SSC) trama rappresenta le porte delle celle RL e cellule diff HL60. (B) Bi-dimensionale dot-blot mostra la percentuale di cellule RL vivo e apoptotici coltivate solo e trattati con 10 nM vincristina. (C) DOT- Bi-dimensionale macchia mostra le percentuali di cellule RL vivo e apoptotici co-coltura con HL60 diff e trattati con 10 nM vincristina. (D) il grafico a barre rappresenta la percentuale di cellule vive RL. I dati sono espressi come media ± SD. *** P ≤0.001.jove.com/files/ftp_upload/53846/53846fig4large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Descritto qui, un protocollo efficace, semplice, veloce ed economico per l'isolamento dei neutrofili dal sangue umano con elevata purezza mediante centrifugazione in gradiente di densità approccio ed entro le stesse cellule mononucleate passo vengono separati e recuperati. Le popolazioni di cellule isolate sono puri ≥90%.
Sono disponibili diversi metodi per l'isolamento dei neutrofili dal sangue umano. Questi includono metodi simili utilizzando gradienti discontinui 11,12, o usando kit commerciali per l'isolamento dei neutrofili dalla selezione positiva immuno-magnetica durante il quale i neutrofili sono immuno-magnetiche marcato con anticorpi specifici, come CD16 anti-umano poi neutrofili arricchito dal legame del CD16- cellule positive su una colonna magnetica 13. kit commerciali con selezione negativa immuno-magnetico sono disponibili anche durante il quale il sangue intero o di sospensione di granulociti sono etichettati con un cocktail di anticorpi che si legano sulle cellule altro than neutrofili 9 (vale a dire, i complessi di anticorpi che etichettano globuli rossi, piastrine e cellule indesiderati come CD2, CD3, CD9, CD19, CD36, CD56, glicoforina A e particelle magnetiche rivestite di destrano), poi neutrofili sono arricchite da eluizione come anticorpi frazione negativo di cellule che non si legano alla colonna magnetica. Inoltre, i neutrofili possono essere isolati dalla fluorescenza delle cellule Attivato Ordinamento 14.
Alcune tecniche hanno dimostrato di fornire alte rese di neutrofili puri, come la selezione positiva immuno-magnetico. Tuttavia, questo metodo ha svantaggi rispetto alla densità metodi di centrifugazione gradiente dovute agli agenti etichettatura che si legano alla superficie dei neutrofili, che potrebbero alterare la loro funzione inducendo loro attivazione o differenziazione. Inoltre utilizzando il metodo di selezione immuno-magnetica positiva, l'anticorpo marcato neutrofili legato sulla colonna magnetica per la separazione e questo può anche influenzare la loro funzione.Fluorescence Activated Cell Sorting ha un altro limite nella misura in cui questo metodo richiede più tempo per raccogliere le cellule che possono incidere negativamente sulla sopravvivenza dei neutrofili a causa della loro breve emivita.
Metodo di centrifugazione in gradiente di densità sono molto simili e la purezza dei neutrofili può superare il 90% utilizzando entrambe le procedure, ma il primo è un gradiente a due strati che è tecnicamente meno impegnativo rispetto alla soluzione gradiente stratificazione che consistono di 40%, 60% e 80% vol / vol in PBS. E 'stato detto da Swamydas et al. 15 che mescolamento delle interfacce soluzione gradiente avviene spesso a causa delle piccole differenze di densità tra i tre strati. Rispetto agli approcci selezione immuno-magnetico negativi, sono stati segnalati per essere efficace per l'isolamento dei neutrofili con elevata purezza e vitalità 9. Il loro vantaggio rispetto ai selezione immuno-magnetico positivo e Fluorescence Activated ordinamento cellulare è che i neutrofilinon sono etichettati con agenti etichettatura e non si legano a colonna magnetica, evitando così l'attivazione delle cellule, ma questo metodo è molto più costoso e più tempo rispetto al metodo del gradiente di densità.
I neutrofili normalmente subiscono una rapida apoptosi spontanea sia in vitro che in vivo 16,17. HL60promyelocyticcells conservano molte caratteristiche di progenitori dei leucociti umani, come ad esempio la possibilità di sottoporsi a differenziazione in neutrofili 18. A differenza di neutrofili, cellule diff HL60 non lo fanno rapidamente apoptosi e l'utilizzo di queste cellule risolve il problema di avere diverse risposte dei neutrofili a causa del loro isolamento da diversi donatori.
Recentemente, culture 3D diventano più maturi e pertinente alla fisiologia umana e animale, e un modello attraente per la ricerca biologica differente soprattutto nel campo dei tumori. Lo spostamento modello da 2D a 3D cultura sta progredendo rapidamente si saidnce quest'ultimo è più evidente durante lo studio varie condizioni patologiche come il cancro 19. Vi è una crescente consapevolezza degli svantaggi della cultura 2D dove aggiungendo una terza dimensione all'ambiente di una cella è importante per dare un'occhiata più da vicino l'importanza delle interazioni cellulari 20 e studiare le differenze nel comportamento cellulare e caratteristiche. Cultura 3D crea un ambiente simile a condizioni in un organismo vivente (per es., Essere umano) che porta alla ricerca più rilevanti. Tuttavia, la cultura 3D coinvolge la complessa interazione tra i diversi partner come le cellule, matrici extracellulari e fluidi interstiziali che non presenti nella cultura 2D. Così, gli sforzi saranno necessari al fine di stabilire la calibrazione metodo e di contare su buone pratiche di laboratorio e forniture efficaci soprattutto i marchi commerciali che sono ampiamente testati e monitorati.
Il microambiente tumoralesi compone di più tipi di cellule, tra cui molte popolazioni di cellule del sistema immunitario che partecipano e regolano tumorigenesi, metastasi e risposta agli agenti antitumorali 21,22. Diversi studi hanno dimostrato che un aumento di neutrofili infiltrazione nei tumori è significativamente correlata con resistenza acquisita a diversi agenti anti-cancro come terapia anti-VEGF 23,24. Inoltre, elevazione dello neutrofili pretrattamento conteggio in pazienti con carcinoma renale metastatico 25, così come la presenza di un elevato livello di neutrofili intra-tumorale in pazienti con diversi tumori solidi, 26 sono stati proposti come fattori prognostici per scarsa sopravvivenza. Il nostro studio suggerisce che i neutrofili possono svolgere un ruolo nel proteggere le cellule del linfoma B da antitumorale apoptosi agente indotta.
In sintesi, il metodo affidabile e riproducibile qui descritto può essere impiegato da qualsiasi laboratorio per raccogliere neutrofili e cellule mononucleate di ronzioun sangue. Inoltre, la differenziazione di cellule HL60 lungo il percorso granulocitica è presentato per evitare alcuni problemi neurophil come l'apoptosi spontanea rapida. Questi approcci sono stati usati per studiare il ruolo dei neutrofili sulla sensibilità delle cellule di linfoma di agenti anti-linfoma dove neutrofili mostrano un effetto protettivo sulle cellule del linfoma contro questi agenti che utilizzano sistemi di coltura 2D e 3D. Questi approcci possono essere utilizzati per una varietà di studi funzionali neutrofili che dovrebbe approfondire la nostra comprensione del ruolo dei neutrofili nella biologia del cancro. In particolare, questo metodo può essere utilizzato per comprendere meglio il cross-talk tra neutrofili e cellule tumorali o tra neutrofili e altri componenti del microambiente.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Gibco Invitrogen | 21875-034 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco Invitrogen | 10270-106 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium) | Gibco Invitrogen | 14040-091 | |
| N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine) | Life technologies | 25030-024 | |
| Penicillin streptomycin (Pen Strep) | Life technologies | 15140-122 | |
| Bruton's tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib) | CliniSciences | A3001 | |
| Vincristine | EG labo | ||
| BD Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | Put at 4 oC overnight (O/N) before the day of the experiment |
| Red cell lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Ficoll (Pancoll) | PAN Biotech | P04-60500 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Euromedex | S3014 | |
| Annexing V-FLOUS staining kit | Roche | 11 988 549 001 | |
| Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kit | Cosmos Biomedical | CB361550-0000 | |
| LSRII flow cytometry | BD Biosciences | ||
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | ||
| Leica DMR-XA microscope | Leica Microsystems | ||
| Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter | Nexcelom Bioscience |
References
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