Introduction
Medfødte immunceller utgjør en vesentlig andel av cellene i tumormikromiljøet, og har vært forbundet med tumorkreftform i pasienter og dyremodeller for kreft 1. Nylig er det blitt mer utbredt verdsatt at kronisk immunresponser spiller avgjørende roller i å fremme tumorprogresjon, metastase og resistens mot kjemoterapi 2. Makrofager er viktige medfødte immunceller som har vist seg å direkte regulere tumor celle respons på kjemoterapi 3,4. Imidlertid er rollen som nøytrofile, sentrale aktører i det medfødte immunsystemet, i regulering tumor respons på anti-kreft behandling ikke kjent. Målene med disse protokollene er å bruke en rask og troverdig metode for å separere nøytrofile celler fra CLL pasientens blodprøver og for å differensiere HL60 celler langs granulocytisk vei for å studere deres rolle i å regulere følsomheten av lymfomceller til anti-lymfom midler.
5 og fungere som en første forsvarslinje mot invaderende mikroorganismer 6. Nøytrofile ha en viktig rolle i stigende effektive medfødte immunresponser i tillegg til variable effektorfunksjoner i flere patologiske tilstander 7. Derfor, er nødvendig for en rask og troverdig metode for å isolere neutrofiler fra andre blodceller, slik som tetthetsgradient separasjonsmetode for in vitro studier. Ved hjelp av denne metoden for nøytrofile isolasjon vil legge til rette for videre forskning på nøytrofilmedierte immunologiske funksjoner in vivo og ex vivo.
Muligheten til å få rene bestander av nøytrofile er et viktig første skritt for å undersøke pasienter med immunologiske sykdommer 8. Densitetsgradient separasjonsmetode er en ideell teknikk der et høyt utbytte av cellene blir oppnådd. den metod innebærer tilsetning av densitetsgradienten oppløsning i bunnen av et rør inneholdende fortynnet humant blod, etterfulgt av sentrifugering ved 300 g i 35 min uten pause. Ringen av de mononukleære celler vises ved grenseflaten og de nøytrofile celler ligge under den førstnevnte. Denne metoden har betydelige fordeler i forhold til andre tilgjengelige metoder som nøytrofile isolasjon kits som er mye dyrere 9. I tillegg isolere neutrofiler fra humant blod ved kommersielle sett ved hjelp av antistoffer rettet mot et overflatemarkør som er spesifikt for humane neutrofiler, øker risikoen for celle-aktivering eller differensiering. Densitetsgradient separasjonsmetode tillater isolering av nøytrofiler i løpet av et kort tidsrom. Innenfor det samme trinnet, blir mononukleære celler også separeres og gjenvinnes. Det er en grunnleggende teknikk i hvilken et høyt utbytte av rene celler blir oppnådd for å oppnå en funksjonell integritet.
For å etterligne tumoren microenvironment, 3D eksperimenter ble utført. Følge av den korte halveringstiden av neutrofiler in vitro, 3D-eksperimenter med friske humane nøytrofile celler er ikke avgjørende. Av denne grunn er promyelocytisk (HL60) celler indusert til å differensiere til nøytrofil-lignende celler ved hjelp av differensieringsinduse dimetylsulfoksid (DMSO) og retinsyre (RA). Ved hjelp av differensierte HL60 celler (HL60 diff) vil hindre at ulike reaksjoner av nøytrofile på grunn av isolasjon fra forskjellige givere.
In vitro 3D kultur modeller representere et mellomstadium mellom in vitro-2D modeller og in vivo-modeller. I 2D-kultur ble cellene spredt på en plastoverflate som danner unaturlige celle vedlegg til deponert proteiner som er denaturert på denne syntetiske overflate. Omvendt cellene i kultur 3D danner naturlig celle-celle vedlegg siden celler og den ekstracellulære matriks de syntetisere er det naturlige materiale til hvilket de er bundet.Av denne grunn, 3D-ko-kulturmodeller, spesielt mellom kreftceller og andre celletyper, har vært meget nyttig for å indikere deres bidrag til tumor vekst, angiogenese og metastase. Som et resultat av 3D-kulturer gjøre cellekulturen etterligne fysiologiske betingelser som finnes in vivo 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. nøytrofile Isolasjon og Co-kultur med Primary leukemiceller
MERK: Prosedyrer ble gjennomført under godkjenning av Lyon Hospital etikk komité med alle pasienter signering informert samtykke.
- Isolering av Primary leukemiceller og nøytrofile
- Samle rør av perifert blod på EDTA (1.8 mg EDTA per milliliter blod) fra pasienter diagnostisert med kronisk lymfatisk leukemi (KLL).
- Legge til hver 15 ml blod til et sterilt 50 ml rør og fortynn med 15 ml RPMI (fortynning 1: 1), deretter forsiktig og tilsett langsomt 15 ml av densitetsgradient oppløsning til bunnen av røret uten å blande fasene. Sørg for at tettheten gradient løsningen er på RT for preparatet.
- Sentrifuger ved 300 xg i 35 min ved RT og uten brems. Blodet bør skille seg i fire distinkte faser som vist i figur 1A, topp til bunn: blodplater og plasma, mononukleære celler (white ring), tettshetsgradient løsning, granulocytter og erytrocytter.
- Samle den hvite ringen som representerer de primære leukemiceller med en plastisk Pasteur pipette og overføres til et nytt 50 ml tube.
- Fylle røret med PBS (inneholder kalsium og magnesium) opp til 50 ml totalt og sentrifuger ved 300 g i 10 minutter ved RT.
- Resuspender pelleten med 5 ml PBS og deretter legge PBS opp til 50 ml totalt og sentrifuger ved 300 g i 10 min ved RT.
- Resuspender pelleten med komplett RPMI-medium (RPMI 1640 supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM glutamin, 100 U / ml penicillin og 100 mg / ml streptomycin) for telling ved anvendelse av cellelevedyktighet teller.
- Aspirer de øvre faser forlater granulocytter og erytrocytter fase og legge PBS opptil 25 ml og deretter legge til 3% dekstran i 0,9% NaClup til 50 ml totalt. Bland rørene 10 ganger og holde dem i 30 minutter ved romtemperatur uten omrøring.
- Samle øvre RBC-dårlig nøytrofile lag end plassere dem i en ren sterilt 50 ml rør og sentrifugere rørene ved 300 g i 10 min ved RT. Resuspender pellet hver med 5 ml PBS og deretter legge til rød cellelyseringsbuffer til 50 ml totalt.
- Holde rørene i mørke i 15 min ved RT og deretter sentrifuger ved 500 g i 10 minutter ved RT. Vask pelleten med PBS (PBS legge opp til 50 ml totalt) og deretter sentrifuger ved 500 g i 10 minutter ved RT.
- Resuspender pellets med komplett RPMI medium for telling ved hjelp av celle levedyktighet teller. Hold 3 x 10 5 av hver celletype i 50 ul PBS-FBS (4%) i 5 ml plastrør for å bestemme renheten av deres isolasjon ved hjelp av flow cytometri.
- Analyser Morfologiske Appearances av den isolerte cellepopulasjoner
- For å gjøre dette, suspendere hver 3 x 10 4 nøytrofile og 3 x 10 4 mononukleære celler i 150 ul komplett RPMI medium. Monter glassplater, filterkort og prøvekamre i cytospin sentrifuge, slik at than sentrifuger er godt balansert.
- Plasser hver celletype inn i prøvekammeret og cytomegalovirus-sentrifuger ved 750 xg i 10 min ved RT fjerne objektglassene, filterkort og prøvekammere fra sentrifugen. Demontere nøye, for ikke å skade cellene på lysbildet. Kast filterkort og prøvekamre.
- Flekk cellene ved hjelp Giemsa farging kit og holde lysbilder for en time å tørke. Undersøke celler ved mikroskop med 100 ganger forstørrelse.
- Test Renheten av isolerte celler ved FACS
- Etiketten de isolerte primære leukemiske celler med anti-humant CD19-antistoff konjugert til APC (5 ul / 10 6 celler). Etiketten de rensede neutrofiler med blanding av anti-humane antistoffer som er oppført i tabell 1 (5 ul / 10 6 celler). Inkuber cellene i mørket i 30 min ved 4 o C.
- Vask cellene med 500 ul PBS-FBS (4%) sentrifugen rørene ved 300 g i 5 min ved RT.
- Resuspender hver pellet i 200 ul PBS-FBS (4%).
- Analyser på et flowcytometer ved hjelp av følgende optiske konfigurasjon: 488 nm laser: FSC-A (488 nM), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PerCP-Cy5.5 (695/40 BP ), PE (575/26 BP); 633 nm laser: APC (660/20 BP), APC-Cy7 (780/60 BP). Kontroller at fargekompensasjon.
- Coculture av Primary leukemiceller med Autolog Neutrophils
- Seed 2 x 10 5 celler / ml for primære leukemiceller alene eller sammen med autologe nøytrofile ved forholdet 01:10 i komplett RPMI-medium. For å gjøre dette, må du justere celle tall ved å fortynne cellesuspensjoner og tilsett 2 x 10 5 celler / ml primære leukemiceller til 2 x 10 6 celler / ml nøytrofile. Bland forsiktig.
- Legg 25 uM av Bruton s tyrosin kinase (BTK) inhibitor (ibrutinib) til cellene. Inkuber i 24 timer ved 37 ° C med 5% CO2.
- Cell Harvest og FACS analyse
- Collect cellene i 5 ml plastrør for FACS-analyse og sentrifuger rørene ved 300 g i 5 min ved RT. Vask pelleten med 1 ml PBS-FBS (4%) og deretter sentrifuger ved 300 g i 5 min ved RT.
- Resuspender pellet i Annexin V og PI ved hjelp av kommersielle kit og Cellene inkuberes i mørke i 10 min ved RT. Analyser på et flowcytometer med gating strategien i figur 2A og følgende optiske konfigurasjon: 488 nm laser: FSC-A (488 nM), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP). Kontroller at fargekompensasjon.
2. Differensiering av HL60 celler langs granulocytisk Pathway og deres coculture med RL lymfom B-celler i 3D-modell
- Differensiering av Menneskelig Promyelocytic (HL60) celler inn i nøytrofile celler lignende
- Juster HL60 celle nummer 3 x 10 5 celler / ml og deretter legge til en mikrometer retinsyre (RA) og 1,25% DMSO å indusere deres differensiering. Seed hver 3 x 10 5 5% CO2.
- Senere, samle celler og sentrifuger ved 300 g i 5 min ved RT. Resuspender cellene med komplett RPMI-medium for telling ved anvendelse av cellelevedyktighet teller.
- Deretter fortynnet cellesuspensjon i fullstendig RPMI-medium for å justere HL60 celle nummer til 3 x 10 5 celler / ml og indusere deres differensiering igjen ved tilsetning av 1 uM retinsyre (RA) og 1,25% DMSO. Seed hver 3 x 10 5 HL60-celler per brønn i 48-brønns plate og inkuberes i en annen 48 timer ved 37 ° C med 5% CO2.
- Analyse av HL60 differensiering (HL60 diff)
- Samle cellene og sentrifugere rørene ved 300 g i 5 min ved RT. Resuspender pelleten med komplett RPMI-medium for telling ved anvendelse av cellelevedyktighet teller.
- For å analysere endringer i celleoverflatemarkører ekspresjon ved strømningscytometri. Plasser hver 3 x 10 5 5 HL60 diff-celler i 5 ml plastrør for FACS-analyse og sentrifuger rørene ved 300 g i 5 min ved RT.
- Resuspender pelleten i 50 ul PBS-FBS (4%). Merke cellene med anti-human CD11b konjugert til AF700 eller anti-human CD38 konjugert til APC (5 ul / 10 6 celler). Inkuber cellene i mørket i 30 min ved 4 o C.
- Vask med 500 ul PBS-FBS (4%) og deretter sentrifuger ved 300 g i 5 min ved RT. Resuspender pelleten i 200 pl PBS-FBS (4%).
- Analyser på strømningscytometer med gating strategien i figur 3A og følgende optiske konfigurasjon: 488 nm laser: FSC-A (488 nM), SSC-A (488 / 10BP); 633 nm laser: APC (660/20 BP), Alexa Fluor 700 (730/45 BP).
- For å teste de morfologiske endringer i HL60 diff, immobilisere cellene på glassplater for mikroskopisk undersøkelse.
- For å gjøre dette, suspendere hver 3 x 10
- Plasser hver celletype inn i prøvekammeret og cytomegalovirus-sentrifuger ved 1500 rpm i 10 min ved RT. Fjern lysbilder, filterkort og prøvekamre fra sentrifugen. Demontere nøye, for ikke å skade cellene på lysbildet. Kast filterkort og prøvekamre.
- Flekk cellene ved hjelp Giemsa farging kit og holde lysbilder for en time å tørke. Undersøke celler ved mikroskop med 100 ganger forstørrelse.
- For å gjøre dette, suspendere hver 3 x 10
- Tre-dimensjonale (3D) Kultur
MERK: Pass på at materialene som brukes i dette eksperimentet er kalde og eksperimentet foregår på is.- Resuspender hver 5 x 10 4 celler RL, enten alene eller blandet med HL60 diff diff 01:10, med 300 pl basalmembran ved å bruke en matrise ml pipette kuttet med en steril saks for å utvide åpningen til ca 2 til 3 mm. Unngå bobler i dette trinnet.
- Seed hver 300 pl cellesuspensjon / brønn i 24-brønns plate. Unngå bobler i dette trinnet. Platen inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C med 5% CO2 og deretter legge til en full ml RPMI-medium til hver brønn og inkuberes i 7 dager ved 37 ° C med 5% CO2. Endre medium annenhver dag. Legg til 10 nM vinkristin på dag fem.
- FACS-analyse
- Etter 7 dagers kultur, aspirere mediet og vask hver brønn med 1 ml iskald PBS to ganger. Tilsett 3 ml / brønn av iskald PBS-EDTA (5 mM). Løsner gel fra bunnen av brønnen ved skraping med den nederste av 200 ul pipettespiss. Rist platen forsiktig på is i 30 min.
- Overfør cellesuspensjon i sterilt 15 ml tube og riste rørene forsiktig på ice i ytterligere 30 minutter. Sjekk for utseendet av homogen cellesuspensjon. (Hvis det ikke er tilfelle, så riste cellene for lengre tid eller legge til mer PBS-EDTA).
- Sentrifuger rørene ved 300 xg i 10 min ved RT. Vask pelleten med PBS og deretter sentrifuger ved 300 xg i 10 min ved RT.
- Resuspender med PBS-FBS (4%) og merke med anti-humant CD19-antistoff konjugert til PE-Cy7 og anti-humant CD38-antistoff konjugert til APC (5 ul / 10 6 celler). Inkuberes i mørket i 30 minutter ved 4 o C.
- Vask med 500 ul PBS-FBS (4%) og deretter sentrifugerør ved 300 g i 5 min ved RT. Suspender cellene med Annexin V og PI bruker kommersielt sett.
- Analyser på strømningscytometer med gating strategien i figur 4A og følgende optiske konfigurasjon: 488 nm laser: FSC-A (488 nM), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP); 633 nm laser: APC (660/20 BP). Kontroller at fargekompensasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Densitetsgradient separasjonsmetode som er beskrevet her gir primærleukemiceller og ikke-stimulerte nøytrofiler isolert fra blodet til CLL pasienter figur 1A viser de forskjellige blod lagene oppnådd etter tetthetsgradient-sentrifugering (fra topp til bunn:. Blodplater og plasma, hvit ring representerer de mononukleære celler, tettshetsgradient løsning, granulocytter og erytrocytter). Figur 1B og 1C viser forskjellene i de morfologiske kamper mellom henholdsvis nøytrofile (multi-flikete kjerner celler) og mononukleære celler.
Resultatene i figur 1D representerer fremtids scatter (FSC) vs side-scatter (SSC) tomt på primærleukemiceller (mononukleære celler). Merking denne populasjonen med anti-human CD19 konjugert til APC viser en fullstendig riktig forskyvning av histogram (figur 1E) med bare éntopp som indikerer at denne befolkningen er positive for CD19 og ren. Nøytrofile er også ≥90% rent som bekreftet ved flowcytometri etter merking av isolerte nøytrofile med en blanding av fluorokromkonjugerte konjugerte monoklonale antistoffer som er oppført i tabell 1. Figur 1F representerer FSC vs SSC punktplott av de isolerte nøytrofile som er positive for CD45 (figur 1G), positive for CD15 og negativ for CD14 (figur 1 H), positiv for både CD15 og CD16 (figur 1i), positive for CD16 og negativ for CD56 (figur 1J).
Figur 1. Analyse av morfologiske Opptredener og renhet av Primary leukemiceller og nøytrofile isolert fra pasienter 'Blood. (A) Skjematisk visning representerer forskjellige blod lag etter tetthet Gradient sentrifugering. (BC) Giemsa-farging representerer de morfologiske forskjeller mellom (B) neutrofiler og (C) primære leukemiske celler (mononukleære celler). Bilder ble tatt av mikroskop med 100X forstørrelse. (D) Forward-scatter (FSC) og side-scatter (SSC) plottet representerer den isolerte primære leukemicellepopulasjonen. (E) Isolerte primære leukemiceller ble merket med anti-CD19-APC og analysert for ekspresjon av CD19. Den røde linje viser de umerkede celler, og den blå linjen indikerer cellene merket med anti-CD19-APC. (F) FSC vs SSC spredningsdiagram representerer den isolerte nøytrofile populasjonen. (GJ) Isolerte neutrofiler ble merket med en blanding av antistoffer som er oppført i tabell 1 og analysert for ekspresjon av (G) CD45, (H) CD14 og CD15, (i), CD15 og CD16, (J) en CD16d CD56. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| antigener | fluorochrome | Clone |
| CD14 | APC-Vio770 (Cy-7) | TÜK4 |
| CD15 | APC | VIMC6 |
| CD16 | FITC | VEP13 |
| CD45 | PerCP-Vio700 (Cy5.5) | 5b1 |
| CD56 | PE | AF12-7H3 |
Tabell 1. fluorokromkonjugerte konjugerte Purified monoklonale antistoffer brukes til å teste Purity av Isolated nøytrofile. Alle antistoffer ble hentet fra Miltenyi bioteknologi.
figur 2A representerer porter nøytrofile og primærleukemiceller. Nøytrofile er mye mer detaljert enn de primære leukemicellene slik at de vises med høyere SSC. Gating på de primære leukemiceller ko-dyrket med nøytrofiler i nærvær av ibrutinib, Resultatene viser høyere prosentandel av levende celler (figur 2C, 84,8%) sammenlignet med celler dyrket alene (figur 2B, 53,1%). Boksen grafen i figur 2D viser at minske av cellelevedyktigheten indusert av ibrutinib ble signifikant inhibert ved nærværet av nøytrofiler (40,1 ± 3,1 vs 60,1 ± 3,5, p <0,001, 19 pasienter).
Figur 2. Autolog Neutrophils Beskytt Primære leukemiceller mot Ibrutinib. Blod ble samlet fra pasienter diagnostisert med kronisk lymfatisk leukemi (KLL). Primære leukemiske celler ble isolert og dyrket alene eller sammen med autologe neutrofiler (N) på primærleukemiceller: Nratio 01:10 i 24 timer, i nærvær eller fravær av 25 pM ibrutinib. Prosentandelen av levende primærleukemiceller (Annexiv V negativ / PI negative) ble målt ved å dobbelt farging med annexin V-FITC og PI, etterfulgt av flowcytometrisk analyse. (A) Forward-scatter (FSC) og side-scatter (SSC) tomten representerer porter nøytrofile og primærleukemiceller. (B) Bi-dimensjonale dot-blot viser prosenter av levende og apoptotiske primære leukemiceller dyrket alene og behandlet med 25 mikrometer ibrutinib. (C) Bi-dimensjonale dot-blot viser prosenter av levende og apoptotiske primære leukemiceller CO- dyrket med nøytrofile og behandlet med 25 mikrometer ibrutinib. (D) Box plot representerer prosentandelen av levende primære leukemiceller av 19 pasienter. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. *** p <0,001 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Den korte halveringstiden til neutrofiler in vitro gjør deres anvendelse i 3D-kultur ineffektiv. Differensiering av HL60 celler langs granulocytic veien ble indusert ved differensiering indusere. To forskjellige parametre (celleoverflatemarkører uttrykk og morfologiske change) ble brukt til å måle differensiering av HL60. FSC vs SSC spredningsdiagram i figur 3A viser at HL60 celler er større i størrelse i forhold til HL60 diff celler med høyere FSC. Merking av celler (HL60 eller HL60 diff) med anti-human CD11b antistoff konjugert til AF700 og anti-human CD38antibody konjugert til APC viser en økning i CD11b og CD38 uttrykk (figur 3B) ved differensiering som er en indikasjon på granulocytic differensiering. HL60 diff celler viser også morfologiske forandringer oppdages av utseendet på multi-flikete kjerner (Figur 3C).
Figur 3. Strukturelle Parametere av Differensiert HL60 celler. (A) Forward-scatter (FSC) og side-scatter (SSC) tomter representerer HL60 og differensierte HL60 celler (HL60 diff). (B) HL60 og HL60 diff-celler ble merket med anti-CD11b-AF700 eller anti-CD38-APC fulgt av strømningscytometri-analyse. Etter gating på hver cellepopulasjon i FSC-A vs. SSC-Et spredningsdiagram (A), ble cellene analysert for de uttrykk for CD11b eller CD38. (C) HL60-celler viser morfologiske forandringer i samsvar med differensiering mot granulocytter. Bilder ble tatt av mikroskop med 100X forstørrelse. Fet svarte pilen peke multi-flikete kjernen. Grafer er representative for fem uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
For å teste effekten av HL60-celler diff på regulering av RL-cellerespons for å vincristin i 3D-modellen, ble RL-celler dyrket alene eller med HL60 diff i basalmembran matriks i nærvær eller fravær av vinkristin ved 10 nM. Bruk av gating strategien vist i figur 4A, er begge populasjoner diskriminert basert på CD19 og CD38 uttrykk; RL celler positive for CD19 og HL60 diff celler positive for CD38. Gating på RL-celler ko-dyrket med HL60 diff-celler i nærvær av vinkristin, Resultatene viser høyere prosentandel av levende celler (figur 4C, 35,9%) i forhold til RL-celler dyrket alene (figur 4B, 19,7%). Den søylediagram i figur 4D viser en betydelig økning i prosentandelen av levende RL-celler (CD19-positiv Annexin V negativ / PI negativ) i nærvær av HL60-celler diff (19,5 ± 0,2 vs 33,1 ± 1,0, p <0,001).
Figur 4. Nøytrofile lignende HL60 diff Cells Beskytt RL lymfom celler mot vinkristin i 3D kultur. RL-celler ble dyrket alene eller sammen med HL60 diff celler på RL: HL60 diff forholdet 1:10 i 7 dager i basalmembran matrix. På dag 5, ble vinkristin (VCR) tilsatt ved en konsentrasjon på 10 nM. Spheroids ble dissosiert på dag 7 og cellene ble merket med anti-CD19-PECy7 og anti-CD38-APC deretter resuspendert med annexin V-FITC og PI fulgt av flowcytometrisk analyse. (A) Forward-scatter (FSC) og side-scatter (SSC) plottet representerer portene til RL celler og HL60 diff celler. (B) Bi-dimensjonale dot-blot viser prosenter av levende og apoptotiske RL celler dyrket alene og behandlet med 10 nM vinkristin. (C) Bi-dimensjonale prikkede blot viser prosenter av levende og apoptotiske RL celler co-dyrket med HL60 diff og behandlet med 10 nM vinkristin. (D) baren diagrammet viser prosentandelen av levende RL celler. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. *** P ≤0.001.jove.com/files/ftp_upload/53846/53846fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er beskrevet her, en effektiv, enkel, rask og billig protokoll for isolering av neutrofiler fra humant blod med høy renhet ved hjelp av tetthetsgradient-sentrifugering tilnærming og innenfor samme trinn mononukleære celler er også separeres og gjenvinnes. De isolerte cellepopulasjoner er ≥90% ren.
Flere metoder er tilgjengelige for nøytrofile isolert fra humant blod. Disse inkluderer lignende metoder ved hjelp av diskontinuerlige gradienter 11,12, eller ved hjelp av kommersielle kits for nøytrofile isolasjon av positive immuno-magnetisk utvalg der nøytrofile er immuno-magnetisk merket med spesifikke antistoffer som anti-human CD16 deretter nøytrofile beriket av binding av CD16- positive celler på en magnetisk kolonne 13. Kommersielle kits med negativ immuno-magnetisk utvalg er også tilgjengelig der hele blod eller granulocytt suspensjon er merket med en cocktail av antistoffer som binder på celler annen than nøytrofile 9 (dvs. antistoffkomplekser denne etiketten RBC, blodplater og uønskede celler som CD2, CD3, CD9, CD19, CD36, CD56, glykoforin A og dekstran-belagte magnetiske partikler), deretter nøytrofile er beriket av eluering som antistoff negativ fraksjon av celler som ikke binder på den magnetiske kolonnen. I tillegg kan nøytrofile celler isoleres ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering 14.
Noen teknikker har vist seg å gi høye utbytter av rene nøytrofiler, så som positiv immuno-magnetisk markering. Imidlertid har denne metode ulemper i forhold til densitetsgradientsentrifugering metoder på grunn av de markørmidler som binder på overflaten av neutrofiler og dette kan potensielt endre deres funksjon ved å indusere deres aktivering eller differensiering. Også ved hjelp av den positive immuno-magnetisk utvelgelsesmetode, antistoff-merkede nøytrofiler binder på en magnetisk kolonne for separasjon og dette kan også påvirke deres funksjon.Fluorescence Activated Cell Sorting har en annen begrensning for så vidt som denne metoden krever lengre tid for å samle cellene som kan negativt påvirke neutrofil overlevelse på grunn av deres korte halveringstid.
Tetthetsgradient-sentrifugeringsmetoden er meget sammenlignbare og de nøytrofile renhet kan overstige 90% ved hjelp av begge fremgangsmåter, men den førstnevnte er en to-lags-gradient som er teknisk mindre krevende forhold til lagdeling gradient løsning som består av 40%, 60% og 80% vol / volum i PBS. Det ble nevnt ved Swamydas et al. 15 at sammenblanding av de gradient løsnings grensesnittene ofte sted på grunn av forskjeller de små densitet mellom de tre lag. Med hensyn til de negative immuno-magnetisk utvelgelsesfremgangsmåter, har de også blitt rapportert å være effektive for nøytrofil isolering med høy renhet og levedyktighet 9. Deres fordel over positive immuno-magnetisk utvalg og Fluorescence Activated Cell Sortering er at nøytrofileer ikke merket med eventuelle markørmidler og binder ikke til magnetisk kolonne, og dermed unngår celleaktivering, men denne metoden er mye mer kostbart og mer tidkrevende i forhold til tetthets-gradient-metoden.
Neutrofiler normalt gjennomgår hurtig spontan apoptose både in vitro og in vivo 16,17. HL60promyelocyticcells beholde mange egenskaper for human leukocytt forløpere, for eksempel potensiale til å gjennomgå differensiering til nøytrofiler 18. I motsetning til nøytrofile, HL60 diff cellene ikke raskt gjennomgå apoptose og bruke disse cellene løser problemet med å ha forskjellige reaksjoner av nøytrofile på grunn av sin isolasjon fra forskjellige givere.
Nylig, 3D Kulturene blir mer modne og relevant for mennesker og dyr fysiologi, og en attraktiv modell for annen biologisk forskning, spesielt i området av kreft. Mønsteret overgang fra 2D til 3D kultur går raskt SiNCE sistnevnte er mer iøynefallende under studere ulike patologiske tilstander som kreft 19. Det er en økende bevissthet om ulempene med 2D kultur der legge til en tredje dimensjon til en celle miljø er viktig for å ta en nærmere titt på viktigheten av cellulære interaksjoner 20 og å studere forskjellene i mobilnettet atferd og egenskaper. 3D kultur skaper et miljø som ligner forholdene i en levende organisme (f.eks., Menneske) som fører til mer relevant forskning. Imidlertid innebærer 3D kultur det komplekse samspillet mellom ulike partnere som celler, ekstracellulære matriser og interstitiell væske som ikke gjør det til stede i 2D kultur. Dermed vil arbeidet være nødvendig for å etablere metoden kalibrering og å telle på god laboratoriepraksis samt effektiv forsyninger spesielt kommersielle merker som er i utstrakt testet og overvåket.
Svulsten mikrobestår av flere celletyper, inkludert mange immun celle populasjoner som deltar i og regulerer tumorigenesis, metastaser og respons på kreftlegemidler 21,22. Flere studier har vist at en økning av nøytrofil infiltrasjon i tumorer er signifikant korrelert med ervervet resistens mot flere antikreftmidler så som anti-VEGF-terapi 23,24. Videre høyde i forbehandlingen antall nøytrofile i pasienter med metastatisk nyrecellekreft 25, så vel som nærvær av et høyt nivå av intra-tumorale nøytrofile celler for pasienter med faste tumorer, er 26 blitt foreslått som prognostiske faktorer for dårlig overlevelse. Vår studie tyder på at nøytrofile kan spille en rolle i å beskytte lymfom B-celler fra antikreftmiddel-indusert apoptose.
Oppsummert kan den pålitelig og reproduserbar metode som er beskrevet her anvendes med en hvilken som helst laboratorium for å samle neutrofiler og mononukleære celler fra humen blod. I tillegg, er differensieringen av HL60 celler langs den granulocytisk veien presentert for å unngå noen neurophil problemer som den raske spontan apoptose. Disse metodene ble anvendt for å studere rollen til nøytrofiler på følsomheten av lymfomceller til anti-lymfom midler hvor neutrofiler viser en beskyttende effekt på lymfomceller mot disse midler ved hjelp av 2D og 3D-kultursystemer. Disse metodene kan brukes for en rekke av nøytrofile funksjonelle studier som bør utdype vår forståelse av nøytrofil rolle i cancerbiologi. Spesielt kan brukes til denne metoden til å bedre forstå den krysstale mellom nøytrofile celler og kreftceller, eller mellom neutrofiler og andre komponenter i mikromiljøet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Gibco Invitrogen | 21875-034 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco Invitrogen | 10270-106 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium) | Gibco Invitrogen | 14040-091 | |
| N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine) | Life technologies | 25030-024 | |
| Penicillin streptomycin (Pen Strep) | Life technologies | 15140-122 | |
| Bruton's tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib) | CliniSciences | A3001 | |
| Vincristine | EG labo | ||
| BD Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | Put at 4 oC overnight (O/N) before the day of the experiment |
| Red cell lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Ficoll (Pancoll) | PAN Biotech | P04-60500 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Euromedex | S3014 | |
| Annexing V-FLOUS staining kit | Roche | 11 988 549 001 | |
| Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kit | Cosmos Biomedical | CB361550-0000 | |
| LSRII flow cytometry | BD Biosciences | ||
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | ||
| Leica DMR-XA microscope | Leica Microsystems | ||
| Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter | Nexcelom Bioscience |
References
- Gocheva, V., et al. IL-4 induces cathepsin protease activity in tumor-associated macrophages to promote cancer growth and invasion. Genes Dev. 24, 241-255 (2010).
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M.
- Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).
- DeNardo, D. G., et al. Leukocyte Complexity Predicts Breast Cancer Survival and Functionally Regulates Response to Chemotherapy. Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).
- Di Carlo, E., et al. The intriguing role of polymorphonuclear neutrophils in antitumor reactions. Blood. 97, 339-345 (2001).
- Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. Int. Immunopharmacol. 10, 1325-1334 (2010).
- Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat. Rev. Immunol. 11, 519-531 (2011).
- Kelbaek, H. Sterile isolation of polymorphonuclear leukocytes from large blood volumes. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Z. FürKlin. Chem. Klin. Biochem. 23, 17-20 (1985).
- Aynaud, M. -M., et al. Human Tribbles 3 protects nuclear DNA from cytidine deamination by APOBEC3A. J. Biol. Chem. 287, 39182-39192 (2012).
- Ziòłkowska, K., et al. Long-term three-dimensional cell culture and anticancer drug activity evaluation in a microfluidic chip. Biosens.Bioelectron. 40, 68-74 (2013).
- Eggleton, P., Gargan, R., Fisher, D. Rapid method for the isolation of neutrophils in high yield without the use of dextran or density gradient polymers. J. Immunol. Methods. 121, 105-113 (1989).
- Behnen, M., et al. Immobilized immune complexes induce neutrophil extracellular trap release by human neutrophil granulocytes via FcγRIIIB and Mac-1. J. Immunol. Baltim.Md 1950. 193, 1954-1965 (2014).
- Hirsch, G., Lavoie-Lamoureux, A., Beauchamp, G., Lavoie, J. -P. Neutrophils are not less sensitive than other blood leukocytes to the genomic effects of glucocorticoids. PloS One. 7, 44606 (2012).
- Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J. Leukoc. Biol. 94, 193-202 (2013).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. , e50586 (2013).
- Scaife, H., Woldehiwet, Z., Hart, C. A., Edwards, S. W. Anaplasmaphagocytophilum reduces neutrophil apoptosis in vivo. Infect. Immun. 71, 1995-2001 (2003).
- Maianski, N. A., Maianski, A. N., Kuijpers, T. W., Roos, D.
- Dalton, W. T., et al. HL-60 cell line was derived from a patient with FAB-M2 and not FAB-M3. Blood. 71, 242-247 (1988).
- Hogan, C., Kajita, M., Lawrenson, K., Fujita, Y. Interactions between normal and transformed epithelial cells: Their contributions to tumourigenesis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 496-503 (2011).
- Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell Tissue Res. 352, 123-131 (2013).
- Mantovani, A. Macrophages, Neutrophils, and Cancer: A Double Edged Sword. New J. Sci. , 271940 (2014).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 3, 309-322 (2012).
- Shojaei, F., Ferrara, N. Refractoriness to antivascular endothelial growth factor treatment: role of myeloid cells. Cancer Res. 68, 5501-5504 (2008).
- Liang, J., et al. Neutrophils promote the malignant glioma phenotype through S100A4. Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res. 20, 187-198 (2014).
- Teramukai, S., et al. Pretreatment neutrophil count as an independent prognostic factor in advanced non-small-cell lung cancer: an analysis of Japan Multinational Trial Organisation LC00-03. Eur. J. Cancer Oxf.Engl 1990. 45, 1950-1958 (2009).
- Zhu, Q., et al. The IL-6-STAT3 axis mediates a reciprocal crosstalk between cancer-derived mesenchymal stem cells and neutrophils to synergistically prompt gastric cancer progression. Cell Death Dis. 5, 1295 (2014).
