Introduction
自然免疫細胞は、腫瘍微小環境内の細胞の本質的な割合を構成し、患者や癌1の動物モデルにおいて腫瘍の悪性度と関連しています。最近では、より広く、慢性免疫応答は、化学療法2の腫瘍の進行、転移および抵抗の促進に重要な役割を果たしていることは理解となっています。マクロファージは、直接化学療法3,4に対する腫瘍細胞の応答を調節することが示されてきた重要な自然免疫細胞です。しかしながら、抗癌治療に対する腫瘍応答の調節に好中球、先天性免疫系において重要なプレーヤーの役割は、不明です。これらのプロトコルの目的は、CLL患者の血液サンプルからの好中球を分離し、抗リンパ腫剤に対するリンパ腫細胞の感受性の調節におけるそれらの役割を研究するために、顆粒球経路に沿ったHL60細胞を区別するために、高速かつ信頼できる方法を使用することです。
6の侵入に対する防御の第一線としての血液5と行為における自然免疫系の最も豊富な細胞成分です。好中球は、いくつかの病的状態7に可変エフェクター機能に加えて、効果的な自然免疫応答を上昇中で重要な役割を持っています。したがって、このような密度勾配分離法などの他の血液細胞から好中球を単離するための迅速かつ信頼できる方法は、in vitro試験のために必要とされます。好中球の単離のために、このメソッドを使用すると、インビボおよびex vivo での好中球媒介性の免疫機能に関するさらなる研究を促進します。
好中球の純粋な集団を得る能力は、免疫学的疾患8を有する患者の調査のための重要な第一歩です。密度勾配分離法は、細胞の高い収率が得られる理想的な技術です。メソジスト教徒dは休憩なしで35分間300gで遠心分離した希釈したヒト血液を含む管の底に密度勾配溶液を添加することを含みます。単核細胞のリングは、インターフェイスに表示され、好中球は、前者の下に常駐します。この方法は、はるかに9高価である好中球単離キットなど、他の利用可能な方法に対して大きな利点を持っています。また、ヒト好中球に特異的な表面マーカーに対する抗体を用いて市販のキットによって、ヒト血液から好中球を単離し、細胞の活性化または分化のリスクを高めます。密度勾配分離法は、短時間での好中球の単離を可能にします。同じステップ内では、単核細胞はまた、分離回収されています。これは、純粋な細胞の高い収率を機能的完全性を実現するために取得された基本的な技術です。
腫瘍microenvを模倣するために、ironment、3D実験を行いました。 in vitroでの好中球の半減期が短い考えると、新鮮なヒト好中球と3D実験は決定的なものではありません。このため、前骨髄球（HL60）細胞を、分化誘導剤、ジメチルスルホキシド（DMSO）及びレチノイン酸（RA）を使用して好中球様細胞に分化するように誘導されます。分化したHL60細胞（HL60 デフ）を使用すると、異なるドナーからの単離に起因する好中球の異なる応答を持つ防ぐことができます。
試験管 3D で培養モデルは、in vitroでの2Dモデル間およびin vivoモデル中間段階を表します。 2D培養では、細胞は、この合成表面に変性された堆積タンパク質への不自然な細胞の添付ファイルを形成するプラスチック表面に広がります。逆に、細胞を、それらが合成細胞外マトリックスからの3D培養フォーム天然細胞間添付の細胞は、それらが結合している天然物質です。この理由のために、特に癌細胞および他の細胞型との間の三次元共培養モデルは、腫瘍増殖、血管形成、および転移への寄与を示すために非常に有用でした。その結果、三次元培養は、細胞培養は、 インビボ 10 に存在する生理学的条件を模倣します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
初代白血病細胞1.好中球の単離と共培養
注：手順は、すべての患者がインフォームドコンセントに署名リヨン病院倫理委員会の承認の下で行いました。
- 初代白血病細胞と好中球の単離
- 慢性リンパ性白血病（CLL）と診断された患者からEDTA（血液1ミリリットル当たり1.8ミリグラムのEDTA）に末梢血のチューブを収集します。
- 滅菌50mlチューブに血液の各15ミリリットルを追加し、15ミリリットルRPMI（希釈1：1）で希釈し、その後、慎重にゆっくりと相を混合することなく、チューブの底に密度勾配溶液15mlを加えます。密度勾配液を調製するためにRTであることを確認してください。
- RTでブレーキなしで35分間300×gで遠心分離します。血液は、 図1（a）に示すように 、4つの別個の相に分離底部へ戻るべきである：血小板および血漿、単核細胞（Wハイト環）、密度勾配溶液、顆粒球および赤血球。
- プラスチック製パスツールピペットと新しい50mlチューブへの転送と、一次白血病細胞を表す白いリングを収集します。
- RTで10分間、300gで合計し、遠心分離機で50ミリリットルまでのPBS（カルシウムおよびマグネシウムを含有する）でチューブを埋めます。
- PBSは、その後、室温で10分間、300グラムのPBSを合計し、遠心分離機で最大50ミリリットルを追加5mlでペレットを再懸濁。
- 完全RPMI培地でペレットを再懸濁（RPMI 1640、10％ウシ胎児血清（FBS）、2mMグルタミン、100 Uを補充/ mlのペニシリンおよび100mg / mlストレプトマイシン）細胞生存率カウンターを用いて計数します。
- その後、合計で50ミリリットルに0.9％NaClupの3％デキストランを追加顆粒球および赤血球相を残して、上部相を吸引し、25ミリリットルまでのPBSを追加します。チューブを10回混合し、混合することなく、室温で30分間保管してください。
- 上位RBC-乏しい好中球層ANを収集清潔な無菌50mlチューブ中に置き、室温で10分間、300gで管を遠心dは。 PBSは、その後、合計50 mlまでの赤血球溶解緩衝液を追加5mlで再懸濁し、各ペレット。
- RTで10分間、500gで遠心分離後、室温で15分間、暗所でチューブを保管してください。次いで、室温で10分間、500gで遠心分離する（合計で50ミリリットルまでのPBSを追加）PBSでペレットを洗ってください。
- 細胞生存率カウンターを用いてカウントするための完全RPMI培地でペレットを再懸濁します。フローサイトメトリーを用いて、それらの単離の純度を決定するために、5mlの50μlのPBS-FBS（4％）にプラスチックチューブを、各細胞型の3×10 5を保ちます。
- 単離された細胞集団の形態学的外観を分析
- これを行うには、それぞれ3×10 4の好中球および150μlの完全RPMI培地中で3×10 4の単核細胞を再懸濁します。そのTを確実に、サイトスピン遠心分離機ガラススライド、フィルタカード、およびサンプルチャンバを組み立てます彼はよくバランスが取れて遠心します。
- RTで10分間、750×gで試料室とCYTO-遠心機に各細胞型を置き、遠心分離機からスライドし、フィルタカード、およびサンプル室を削除します。スライド上の細胞を損傷しないように、慎重に分解します。フィルタカードとサンプル室を捨てます。
- ギムザ染色キットを用いて細胞を染色し、乾燥さ1時間のスライドを保ちます。 100Xの倍率の顕微鏡で細胞を調べます。
- FACSによって単離された細胞の純度をテスト
- APCに結 合させた抗ヒトCD19抗体（5μL/ 10 6細胞）を用いて、単離された一次白血病細胞にラベルを付けます。 表1に記載されている抗ヒト抗体（5μL/ 10 6細胞）の混合物で精製した好中球にラベルを付けます。 4 O℃で30分間、暗所で細胞をインキュベート
- 500μlのPBS-FBS（4％）、室温で5分間300グラムでチューブを遠心分離で細胞を洗浄。
- 200μlのPBS-FBS（4％）の各ペレットを再懸濁。
- 、SSC-A（488 / 10BP）、FITC（BP 530/30）、PerCPを-のCy5.5（40分の695 BP FSC-A（488 nM）を：488 nmレーザー：以下の光学構成を使用して、フローサイトメーターで分析）、PE（BPを575/26）; 633 nmレーザー：APC（BPを660/20）、APC-Cy7の（BPを780/60）。色補正を確認してください。
- 自家好中球との一次白血病細胞の共培養
- シード一次白血病細胞の2×10 5細胞/ ml単独または完全RPMI培地中で比1:10での自己好中球です。これを行うには、細胞懸濁液を希釈して細胞数を調整し、2×10 6細胞/ mlの好中球への一次白血病細胞の2×10 5細胞/ mlを追加します。慎重に混ぜます。
- 細胞にブルートンチロシンキナーゼ（Btk）阻害剤（ibrutinib）の25μMを追加します。 5％CO 2、37℃で24時間インキュベートします。
- セルハーベストおよびFACS分析
- コルECT FACS分析5mlのプラスチックチューブ中の細胞、室温で5分間、300gで管を遠心。 1mlのPBS-FBSでペレットを洗浄し（4％）、次いで、室温で5分間300gで遠心分離します。
- 市販のキットを用いて、アネキシンVおよびPIでの再懸濁ペレットとRTで10分間、暗所で細胞をインキュベートします。 488nmレーザー：FSC-A（488 nM）を、SSC-A（488 / 10BP）、FITC（BPを530/30）、PI（610、図2Aおよび以下の光学構成のゲート戦略を使用して、フローサイトメーターで分析/ 20 BP）。色補正を確認してください。
顆粒球経路と3DモデルでRLリンパ腫B細胞との共培養に沿ってHL60細胞の2分化
- 好中球様細胞にヒト前骨髄球性（HL60）細胞の分化
- 3×10 5細胞/ mlにHL60細胞数を調整し、その後、それらの分化を誘導するために、1μMのレチノイン酸（RA）および1.25％DMSOを加えます。各3×10 5をシード2、37℃で48時間インキュベート>まで。
- その後、室温で5分間300グラムで細胞と遠心分離を収集します。細胞生存率カウンターを用いて計数する完全RPMI培地で細胞を再懸濁します。
- 次いで、3×10 5細胞/ mlにHL60細胞数を調整し、1μMのレチノイン酸（RA）および1.25％DMSOを添加することによって再び分化を誘導するために、完全RPMI培地で細胞懸濁液を希釈します。ウェルあたり48ウェルプレートの各3×10 5個のHL60細胞を播種し、5％CO 2、37℃でさらに48時間インキュベートします。
- HL60分化の解析（HL60 デフ ）
- 細胞を収集し、室温で5分間300グラムでチューブを遠心します。細胞生存率カウンターを用いて計数する完全RPMI培地でペレットを再懸濁。
- フローサイトメトリーによる細胞表面マーカー発現の変化を分析します。各3×10 5を配置5 HL60 差分細胞プラスチックチューブ、室温で5分間、300gで管を遠心。
- 50μlのPBS-FBS（4％）でペレットを再懸濁します。 AF700またはAPCに結 合させた抗ヒトCD38（5μL/ 10 6細胞）に結合した抗ヒトのCD11bと細胞を標識。 4 O℃で30分間、暗所で細胞をインキュベート
- その後、室温で5分間、300gで遠心分離（4％）、500μlのPBS-FBSで洗浄します。 200μlのPBS-FBS（4％）でペレットを再懸濁します。
- 488nmレーザー： 図3Aおよび以下の光学構成のゲート戦略を使用して、フローサイトメーター上で分析FSC-A（488 nM）を、SSC-A（488 / 10BP）。 633 nmレーザー：APC（660/20 BP）、アレクサフルオロ700（BPを730/45）。
- HL60 デフの形態変化をテストするには、顕微鏡検査のためのスライドガラス上に細胞を固定化します。
- これを行うには、それぞれ3×10を再懸濁
- RTで10分間、1,500rpmで試料室とCYTO-遠心機に各細胞型を置きます。遠心分離機からのスライド、フィルタカード、およびサンプル室を削除します。スライド上の細胞を損傷しないように、慎重に分解します。フィルタカードとサンプル室を捨てます。
- ギムザ染色キットを用いて細胞を染色し、乾燥さ1時間のスライドを保ちます。 100Xの倍率の顕微鏡で細胞を調べます。
- これを行うには、それぞれ3×10を再懸濁
- 3次元（3D）培養
注：この実験で用いた材料が冷えていることを確認し、実験が氷の上で行われています。- 単独で、またはHL60 デフと混合のいずれかで、それぞれ5×10 4 RL細胞を再懸濁デフ午前1時10分、2〜3mm程度に開口部を広げるために、滅菌はさみで切断し1ミリリットルピペットチップを使用して、300μlの基底膜マトリックスを持ちます。このステップの間に気泡を避けてください。
- 24ウェルプレート中の細胞懸濁液/各300μLをシード。このステップの間に気泡を避けてください。次いで、各ウェルについてRPMI培地を完了し、5％CO 2、37℃で7日間インキュベートML 1を追加、5％CO 2で37℃で30分間、プレートをインキュベートします。 2日毎に培地を変更します。 5日目に10 nMのビンクリスチンを追加します。
- FACS分析
- 7日間の培養後、培地を吸引し、二回1ミリリットルの氷冷PBSで各ウェルを洗浄します。氷冷PBS-EDTA（5ミリモル）の3ミリリットル/ウェルを追加します。 200μlのピペットチップの底を使用して、こすることによってウェルの底からゲルを外します。氷上で30分間静かにプレートを振ります。
- 滅菌15ミリリットルチューブに細胞懸濁液を移し、ICを軽くチューブを振ります別の30分間の電子。均一な細胞懸濁液の外観を確認してください。 （それはケースではない場合には、長い時間のための細胞を振る以上のPBS-EDTAを追加します）。
- RTで10分間、300×gでチューブを遠心。その後、室温で10分間、300×gで遠心分離し、PBSでペレットを洗ってください。
- PBS-FBS（4％）で再懸濁し、PE-Cy7をし、APCに結 合した抗ヒトCD38抗体（5μL/ 10 6細胞）を結合させた抗ヒトCD19抗体で標識します。 4 O℃で30分間、暗所でインキュベート
- RTで5分間300gで、次いで遠心チューブ500μlのPBS-FBS（4％）で洗浄しました。市販のキットを使用してアネキシンVおよびPIで細胞を再懸濁します。
- 図4Aのゲート戦略を使用して、フローサイトメーター上で分析し、以下の光学構成：488 nmレーザー：FSC-A（488 nM）を、SSC-A（488 / 10BP）、FITC（530/30 BP）、PI（610 / 20 BP）、PE-Cy7の（780/60 BP）。 633 nmレーザー：APC（BPを660/20）。色補正を確認してください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
白いリングは、単核細胞を表し、血小板及び血漿：ここに記載の密度勾配分離法は、CLL患者の血液から単離した一次白血病細胞と非刺激好中球は、 図1Aは、上から下に（密度勾配遠心分離後に得られた異なる血液層を表し、提供します密度勾配溶液、顆粒球および赤血球）。 図1B及び1Cは、それぞれ好中球（マルチローブ核細胞）と単核細胞との間の形態学的外観の違いを示します。
図1Dの結果は、一次白血病細胞（単核細胞）の側方散乱（SSC）プロット対前方散乱（FSC）を表します。 APCに結 合した抗ヒトCD19と、この集団のラベリングすることは一つだけで、ヒストグラム（ 図1E）の完全な右シフトを示していますこの集団は、CD19および純粋に陽性であることを示しているピーク。好中球は、純粋な％は、 表1に記載されている蛍光標識モノクローナル抗体の混合物と分離された好中球を標識した後、フローサイトメトリーにより確認した。 図1Fは、CD45陽性である、単離された好中球のSSC散布図（ 図対FSCを表し≥90もありますCD56（ 図1J）のためのCD16のための正と負のCD15およびCD16の両方に陽性CD14（ 図1H）、（ 図1I）のためのCD15のための正と負の1G）、、。
患者の血液から分離図1.初代白血病細胞の形態学的外観および純度の分析と好中球。 （A）の模式図で密度gradi後の異なる血液層を表し、ENTの遠心分離（BC）ギムザ染色（B）、好中球、および（C）一次白血病細胞（単核細胞）との間の形態学的な差を表します。写真は、（D）前方散乱（FSC）。100Xの倍率で顕微鏡で撮影した及び側方散乱（SSC）プロットは、単離された一次白血病細胞の集団を表す。（E）単離された初代白血病細胞を抗CD19-APCで標識したとCD19の発現について分析しました。赤い線は、非標識細胞を示し、青い線は、抗CD19-APCで標識された細胞を示している。（F）FSC SSC散布図対孤立した好中球集団を表す。（GJ）単離された好中球は、表に記載された抗体の混合物で標識しました1および（G）CD45（H）CD14及びCD15、（I）CD15及びCD16、（J）CD16 ANの発現について分析dはCD56。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 抗原 | 蛍光色素 | クローン |
| CD14 | APC-Vio770（CY-7） | TÜK4 |
| CD15 | APC | VIMC6 |
| CD16 | FITC | VEP13 |
| CD45 | PerCPを-Vio700（のCy5.5） | 5B1 |
| CD56 | PE | AF12-7H3 |
表1.蛍光標識精製したモノクローナル抗体は、単離された好中球の純度をテストするために使用します。すべての抗体は、ミルテニーバイオテクノロジーから得ました。
図2AにおけるSSCの散布対FSCは、好中球および一次白血病細胞のゲートを表しています。彼らは高いSSCで表示されるように、好中球は、はるかに粒状の一次白血病細胞よりもあります。 ibrutinibの存在下での好中球と共培養の一次白血病細胞上のゲーティングは、結果は生きている細胞の割合が高い単独で培養した細胞と比較した （ 図2C、84.8パーセント）（ 図2B、53.1パーセント）を示します。 図2Dでのボックスのグラフはdecreasことを示していますibrutinibによって誘導される細胞生存率eは著しく好中球（40.1±3.1対60.1±3.5、p <0.001、19人の患者）の存在によって阻害されました。
2.自己好中球はIbrutinib血液に対する一次白血病細胞を保護する。図は、慢性リンパ性白血病（CLL）と診断された患者から採取しました。初代白血病細胞は、初代白血病細胞で自己の好中球（N）と、単独で、または一緒に単離し、培養した：N比1時10分、24時間、25μMibrutinibの存在下または非存在下で。生の一次白血病細胞（Annexiv Vネガティブ/ PI陰性）の割合は、（A）前方散乱（FSC）。フローサイトメトリー解析に続いて、アネキシンV-FITCおよびPIで二重染色することによって測定および側方散乱（SSC）しました。プロットは、好中球および一次白血病細胞のゲートを表し、。（B）バイ次元ドットブロットは生きているとアポトーシスの一次白血病細胞の割合は、単独で培養し、25μMのibrutinibで処理を示しています。（C）バイ次元ドットブロットは生きているとアポトーシスの一次白血病細胞の割合を示しているコ好中球を用いて培養し、25μMのibrutinibで処理した。（D）ボックスプロットは、19人の患者の生きている一次白血病細胞の割合を表します。データは平均±SDとして表されます。 *** P <0.001 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
in vitroでの好中球の短い半減期は、3D培養におけるそれらの使用は効果がないことができます。顆粒球経路に沿ったHL60細胞の分化は、分化誘導剤によって誘導されました。二つの異なるパラメータ（細胞表面マーカー発現および形態学チャンES）HL60分化を測定しました。 図3AのSSC散布図対FSCはHL60細胞は高いFSCとHL60 デフ細胞に比べてサイズが大きいことを示しています。 AF700およびAPCに結 合させた抗ヒトCD38antibodyにコンジュゲートした抗ヒトのCD11b抗体を用いて細胞（HL60またはHL60の差分）をラベリングすると、顆粒球分化の指標である分化の際のCD11bの増加およびCD38発現（ 図3B）を示しています。 HL60 デフ細胞は、マルチローブ核（ 図3C）の出現によって検出された形態学的変化を示しています。
図3.差別HL60細胞の構造パラメータ。 （A）前方散乱（FSC）および側方散乱（SSC）プロットは、HL60および分化したHL60細胞（HL60の差分）を表す。（B）HL60とHL60 デフ細胞をフローサイトメトリー分析に続いて抗CD11b-AF700または抗CD38-APCで標識しました。 SSC-散布図（A）対FSC-Aにおける各細胞集団についてゲーティングした後、細胞のCD11b又はCD38の発現について分析した。（C）HL60細胞は、顆粒球に向かって分化と一致する形態学的変化を示しています。写真は、100倍の倍率で顕微鏡で撮影しました。太字の黒い矢印は、マルチローブ核を指します。グラフは、5つの独立した実験の代表である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
3Dモデル内のビンクリスチンにRL細胞応答を調節するのHL60 デフ細胞の効果を試験するために、RL細胞は、単独で、または10 Nでのビンクリスチンの存在下または非存在下での基底膜マトリックス中HL60 デフで培養しましたM. 図4（a）に示すゲート戦略を使用して、両方の集団は、CD19およびCD38の発現に基づいて区別されます。 CD38に対する陽性CD19およびHL60 差分細胞に陽性でRL細胞。ビンクリスチンの存在下でのHL60 デフ細胞と共培養したRL細胞上のゲーティングは、結果は生きている細胞の割合が高い単独で培養RL細胞と比較した（図4C、35.9パーセント）（ 図4B、19.7％）を示しています。 図4Dにおける棒グラフは、HL60 デフ細胞 （19.5±0.2対33.1±1.0、P <0.001）の存在下で生きているRL細胞の割合が有意に増加（負のCD19陽性アネキシンV / PIネガティブ）を示しています。
図4.好中球様HL60 デフ 細胞 は、3D文化にビンクリスチンに対するRLリンパ腫細胞を保護します。RL細胞を基底膜マトリックスで7日間HL60 デフ比 1：10：RLでHL60 デフ細胞を単独で、または一緒に培養しました。 5日目には、ビンクリスチン（VCR）は、10nMの濃度で添加しました。スフェロイドは、7日目に分離し、次いで、細胞をフローサイトメトリー分析に続いて、アネキシンV-FITCおよびPIで再懸濁し、抗CD19-PECy7、および抗CD38-APCで標識した。（A）前方散乱（FSC）および側方散乱（SSC）プロットは、RL細胞とHL60 デフセルのゲートを表している。（B）バイ次元ドットブロットは生きているとアポトーシスRL細胞単独で培養し、10nMのビンクリスチンで処理の割合を示している。（C）バイ次元ドット-ブロットは、HL60 デフと共培養し、10nMのビンクリスチンで処理された生きているとアポトーシスRL細胞の割合を示している。（D）棒グラフが生きRL細胞の割合を表します。データは平均±SDとして表されます。 *** P≤0.001。jove.com/files/ftp_upload/53846/53846fig4large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
また、分離回収され、密度勾配遠心分離法を用いて高純度のヒト血液から好中球の単離のために、同じ手順単核細胞内で、ここに有効な、簡単、迅速かつ安価なプロトコルを記載しています。単離された細胞集団は、≥90％純粋です。
いくつかの方法がヒトの血液から好中球の単離のために用意されています。これらは、不連続勾配11,12を使用して、または好中球は、免疫磁気かかるその後CD16-結合することによって濃縮された好中球の抗ヒトCD16のような特定の抗体で標識され、その間に正の免疫磁気選択により好中球を単離するための市販のキットを用いて同様の方法が挙げられます磁気カラム13に陽性細胞。負の免疫磁気選択を市販のキットは、全血または顆粒球懸濁液は、細胞の他の股関節に結合する抗体のカクテルで標識された時にもご利用いただけますnは好中球9（ すなわち、赤血球、血小板などCD2、CD3、CD9、CD19、CD36、CD56、グリコホリンAおよびデキストラン被覆磁性粒子のような望ましくない細胞を標識抗体複合体）、その後、好中球が抗体として溶出によって濃縮されます磁気カラムに結合しない細胞の陰性画分。また、好中球は、蛍光活性化セル14のソートによって単離することができます。
いくつかの技術は、正の免疫磁気選択純粋な好中球の高い収率を提供することが示されています。しかし、この方法は、好中球の表面に結合し、これは潜在的にその活性化または分化を誘導することにより、それらの機能を変化させる可能性標識剤に起因する密度勾配遠心分離法と比較して欠点を有します。また、正の免疫磁気選択方法を使用して、抗体で標識された好中球は、分離のための磁気カラムに結合し、これは、それらの機能に影響を与えることができます。この方法は、負の好中球の生存に影響を与える可能性の細胞を収集するために、より長い時間を必要とする、蛍光活性化細胞選別は、それらの短い半減期に限り、別の制限があります。
密度勾配遠心分離法は、非常に同等であり、好中球の純度は、両方の手順を使用して90％を超えることができ、前者は40％、60％、80体積％から成る積層勾配液と比較して技術的にあまり困難である二層の勾配でありますPBS中/容量。それにより三層の間の小さな密度差にSwamydasら勾配液界面の混合がしばしば起こることが15で述べました。陰性免疫磁気選択アプローチに関しては、それらはまた、高純度および生存率9と好中球の単離のために有効であることが報告されています。正の免疫磁気選択及び蛍光活性化細胞選別の上、その利点は、好中球であります任意の標識剤で標識されておらず、磁気カラムに結合しない、したがって、細胞の活性化を回避するが、この方法は、密度勾配法に比べて、はるかに高価で、より多くの時間がかかります。
好中球は通常、in vitroおよびin vivo 16,17 の両方で迅速な自発的なアポトーシスを受けます。 HL60promyelocyticcellsは、好中球18への分化を受ける可能性のあるヒト白血球前駆体の多くの特徴を、保持しています。好中球とは異なり、HL60 デフ細胞が急速にアポトーシスを受けるし、これらの細胞を使用していない人の異なるドナーからのそれらの単離好中球の異なる応答を持つことの悩みを解決します。
最近、3D培養物は、ヒトおよび動物生理学、特に癌の分野で異なる生物学的研究のための魅力的なモデルに、より成熟したとの関連になります。 3D培養に2Dからパターンシフトが急速に進んでいるSI後者NCE癌19のような様々な病理学的状態を研究する中、より顕著です。細胞の環境に三次元を追加すると、細胞間相互作用20の重要性を詳しく見て取ると細胞の挙動や特性の違いを研究するために重要である2次元文化の欠点の意識の高まりがあります。 3Dの文化は、より関連性の研究につながる生体内の状態に近い環境（ 例えば 、人間）を作成します。しかし、3D培養は、細胞、細胞外マトリックスと2D培養物中に存在しない間質液などのさまざまなパートナーとの間の複雑な相互作用を伴います。このように、努力がメソッドのキャリブレーションを確立するために、良好な実験室での実践だけでなく、効果的なサプライ広範囲にテストされ、監視され、特に商業ブランドをカウントするために必要とされるであろう。
腫瘍内微小環境参加し、腫瘍形成、転移および抗癌剤21,22への応答を調節する多くの免疫細胞集団を含む、複数の細胞型で構成されています。いくつかの研究は、腫瘍中の好中球浸潤の増加は著しく、抗VEGF療法23,24のようないくつかの抗がん剤に対する獲得 耐性と相関することを示しています。さらに、転移性腎細胞癌25、ならびに異なる固形腫瘍を有する患者における腫瘍内の好中球の高いレベルの存在を有する患者における治療前の好中球数の上昇は、26が悪い生存のための予後因子として提案されています。我々の研究は、好中球は、抗がん剤によって誘導されるアポトーシスからリンパ腫B細胞を保護する役割を果たし得ることを示唆しています。
要約すると、ここで説明信頼性と再現性のある方法は、ハムから好中球および単核細胞を収集するために、任意の研究室で採用することができます血液。また、顆粒球経路に沿ったHL60細胞の分化は、このような急速な自発アポトーシスのようないくつかのneurophilの問題を回避するために提示されています。これらのアプローチは、好中球は、2Dおよび3D培養系を使用して、これらの薬剤に対するリンパ腫細胞の保護効果を示す抗リンパ腫剤に対するリンパ腫細胞の感受性に対する好中球の役割を研究するために使用しました。これらのアプローチは、癌生物学における好中球の役割の理解を深めるべきである好中球機能の研究の種々のために使用することができます。特に、この方法は、より優れた好中球および腫瘍細胞との間、または好中球および微小環境の他のコンポーネントとの間のクロストークを理解するために使用することができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Gibco Invitrogen | 21875-034 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco Invitrogen | 10270-106 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium) | Gibco Invitrogen | 14040-091 | |
| N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine) | Life technologies | 25030-024 | |
| Penicillin streptomycin (Pen Strep) | Life technologies | 15140-122 | |
| Bruton's tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib) | CliniSciences | A3001 | |
| Vincristine | EG labo | ||
| BD Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | Put at 4 oC overnight (O/N) before the day of the experiment |
| Red cell lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Ficoll (Pancoll) | PAN Biotech | P04-60500 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Euromedex | S3014 | |
| Annexing V-FLOUS staining kit | Roche | 11 988 549 001 | |
| Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kit | Cosmos Biomedical | CB361550-0000 | |
| LSRII flow cytometry | BD Biosciences | ||
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | ||
| Leica DMR-XA microscope | Leica Microsystems | ||
| Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter | Nexcelom Bioscience |
References
- Gocheva, V., et al. IL-4 induces cathepsin protease activity in tumor-associated macrophages to promote cancer growth and invasion. Genes Dev. 24, 241-255 (2010).
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M.
- Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).
- DeNardo, D. G., et al. Leukocyte Complexity Predicts Breast Cancer Survival and Functionally Regulates Response to Chemotherapy. Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).
- Di Carlo, E., et al. The intriguing role of polymorphonuclear neutrophils in antitumor reactions. Blood. 97, 339-345 (2001).
- Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. Int. Immunopharmacol. 10, 1325-1334 (2010).
- Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat. Rev. Immunol. 11, 519-531 (2011).
- Kelbaek, H. Sterile isolation of polymorphonuclear leukocytes from large blood volumes. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Z. FürKlin. Chem. Klin. Biochem. 23, 17-20 (1985).
- Aynaud, M. -M., et al. Human Tribbles 3 protects nuclear DNA from cytidine deamination by APOBEC3A. J. Biol. Chem. 287, 39182-39192 (2012).
- Ziòłkowska, K., et al. Long-term three-dimensional cell culture and anticancer drug activity evaluation in a microfluidic chip. Biosens.Bioelectron. 40, 68-74 (2013).
- Eggleton, P., Gargan, R., Fisher, D. Rapid method for the isolation of neutrophils in high yield without the use of dextran or density gradient polymers. J. Immunol. Methods. 121, 105-113 (1989).
- Behnen, M., et al. Immobilized immune complexes induce neutrophil extracellular trap release by human neutrophil granulocytes via FcγRIIIB and Mac-1. J. Immunol. Baltim.Md 1950. 193, 1954-1965 (2014).
- Hirsch, G., Lavoie-Lamoureux, A., Beauchamp, G., Lavoie, J. -P. Neutrophils are not less sensitive than other blood leukocytes to the genomic effects of glucocorticoids. PloS One. 7, 44606 (2012).
- Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J. Leukoc. Biol. 94, 193-202 (2013).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. , e50586 (2013).
- Scaife, H., Woldehiwet, Z., Hart, C. A., Edwards, S. W. Anaplasmaphagocytophilum reduces neutrophil apoptosis in vivo. Infect. Immun. 71, 1995-2001 (2003).
- Maianski, N. A., Maianski, A. N., Kuijpers, T. W., Roos, D.
- Dalton, W. T., et al. HL-60 cell line was derived from a patient with FAB-M2 and not FAB-M3. Blood. 71, 242-247 (1988).
- Hogan, C., Kajita, M., Lawrenson, K., Fujita, Y. Interactions between normal and transformed epithelial cells: Their contributions to tumourigenesis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 496-503 (2011).
- Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell Tissue Res. 352, 123-131 (2013).
- Mantovani, A. Macrophages, Neutrophils, and Cancer: A Double Edged Sword. New J. Sci. , 271940 (2014).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 3, 309-322 (2012).
- Shojaei, F., Ferrara, N. Refractoriness to antivascular endothelial growth factor treatment: role of myeloid cells. Cancer Res. 68, 5501-5504 (2008).
- Liang, J., et al. Neutrophils promote the malignant glioma phenotype through S100A4. Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res. 20, 187-198 (2014).
- Teramukai, S., et al. Pretreatment neutrophil count as an independent prognostic factor in advanced non-small-cell lung cancer: an analysis of Japan Multinational Trial Organisation LC00-03. Eur. J. Cancer Oxf.Engl 1990. 45, 1950-1958 (2009).
- Zhu, Q., et al. The IL-6-STAT3 axis mediates a reciprocal crosstalk between cancer-derived mesenchymal stem cells and neutrophils to synergistically prompt gastric cancer progression. Cell Death Dis. 5, 1295 (2014).
