Introduction
Medfödda immunceller utgör en väsentlig andel av cellerna inuti tumörmikroomgivningen och har associerats med tumör malignitet hos patienter och djurmodeller av cancer 1. På senare tid har det blivit mer allmänt uppskattat att kroniska immunsvar spelar avgörande roller för att främja tumörprogression, metastas och motståndskraft mot kemoterapier 2. Makrofager är viktiga medfödda immunceller som har visat att direkt reglera tumörcellsvar på kemoterapi 3,4. Dock är betydelsen av neutrofiler, viktiga aktörer i det medfödda immunförsvaret, i reglering av tumörrespons till anticancerbehandling inte känd. Syftet med dessa protokoll är att använda en snabb och trovärdig metod för att separera neutrofiler från CLL patients blodprov och differentiera HL60 celler längs granulocytiska vägen för att studera deras roll vid reglering av känsligheten hos lymfomceller till anti-lymfommedel.
5 och fungera som en första försvarslinje mot invaderande mikroorganismer 6. Neutrofiler har en viktig roll i stigande effektiva medfödda immunsvar utöver variabla effektorfunktioner i flera patologiska tillstånd 7. Därför är en snabb och trovärdig metod för att isolera neutrofiler från andra blodceller, såsom densitetsgradient separationsmetod, krävs för in vitro-studier. Med den här metoden för neutrofil isolering kommer att underlätta ytterligare forskning på neutrofila-medierad immunologiska funktioner in vivo och ex vivo.
Förmågan att erhålla rena populationer av neutrofiler är ett viktigt första steg för att undersöka patienter med immunologiska sjukdomar 8. Densitetsgradient separationsmetod är en idealisk teknik i vilken ett högt utbyte av celler erhålles. den metod innebär tillsättning av densitetsgradientlösningen i botten av ett rör innehållande utspädd humant blod följt av centrifugering vid 300 g under 35 min utan avbrott. Ringen av de mononukleära cellerna visas vid gränsytan och neutrofilerna uppe under det första. Denna metod har betydande fördelar i förhållande till andra tillgängliga metoder såsom neutrofila isoleringssatser, vilka är mycket dyrare 9. Dessutom isolera neutrofiler från humant blod genom kommersiella kit med användning av antikroppar riktade mot en ytmarkör specifik för humana neutrofiler, öka risken för cellaktivering eller differentiering. Densitetsgradient separation metod tillåter isolering av neutrofiler inom en kort tidsperiod. Inom samma steg, är mononukleära celler också separeras och utvinnas. Det är en grundläggande teknik i vilken ett högt utbyte av rena celler erhålls för att uppnå funktionella integritet.
För att efterlikna tumör microenvironment, 3D-experiment utfördes. Med tanke på den korta halveringstiden av neutrofiler in vitro, 3D experiment med färska humana neutrofiler är inte avgörande. Av denna anledning är promyelocytiska (HL60) celler induceras att differentiera till neutrofil-liknande celler med användning av de differentierings inducerare dimetylsulfoxid (DMSO) och retinsyra (RA). Använda differentierade HL60-celler (HL60 diff) kommer att förhindra att ha olika svar av neutrofiler på grund av isolering från olika givare.
In vitro 3D kulturmodeller utgör ett mellansteg mellan 2D in vitro-modeller och in vivo-modeller. I 2D-kultur, cellerna spreds på plastytan bildar onaturliga cell bilagor till deponerade proteiner som denaturerade på denna syntetiska yta. Omvänt cellerna i 3D kultur bildar naturlig cell-cell bilagor eftersom cellerna och den extracellulära matrisen de syntetisera är naturmaterial till vilka de är bundna.Av denna anledning, 3D co-kulturmodeller, särskilt mellan cancerceller och andra celltyper, har varit mycket användbara för att indikera deras bidrag till tumörtillväxt, angiogenes och metastas. Som ett resultat, 3D-kulturer göra cellkulturen härma de fysiologiska förhållanden som råder in vivo 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Neutrofil Isolering och Co-kultur med primära leukemiceller
OBS: Försök genomfördes under godkännande av Lyon sjukhus etikkommitté med alla patienter som undertecknar informerat samtycke.
- Isolering av primära leukemiceller och neutrofiler
- Samla rör med perifert blod på EDTA (1,8 mg EDTA per milliliter blod) från patienter som diagnostiserats med kronisk lymfatisk leukemi (KLL).
- Lägg varje 15 ml blod till ett sterilt 50 ml rör och späd med 15 ml RPMI (spädning 1: 1), sedan försiktigt och tillsätt långsamt 15 ml av densitetsgradientlösningen till botten av röret utan blandning av faserna. Säkerställa att densitetsgradientlösningen är vid RT i beredningen.
- Centrifugera vid 300 xg under 35 min vid RT och utan broms. Blodet bör separera i fyra distinkta faser, såsom visas i figur 1 A, uppifrån och ned: trombocyt och plasma, mononukleära celler (vikthite ring), densitetsgradientlösningen, granulocyter och erytrocyter.
- Uppsamla det vita ringen som representerar de primära leukemiceller med en plast pasteurpipett och förflyttas till en ny 50 ml tub.
- Fyll röret med PBS (innehåller kalcium och magnesium) upp till 50 ml totalt och centrifugera vid 300 g under 10 min vid RT.
- Suspendera pelleten med 5 ml PBS tillsätt sedan PBS upp till 50 ml totalt och centrifugera vid 300 g under 10 min vid RT.
- Suspendera pelleten med fullständigt RPMI-medium (RPMI 1640 kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 2 mM glutamin, 100 U / ml penicillin och 100 mg / ml streptomycin) för räkning med användning av cellviabilitet räknare.
- Sug de övre faserna lämnar granulocyter och erytrocyter fas och lägga PBS upp till 25 ml tillsätt sedan 3% dextran i 0,9% NaClup till 50 ml totalt. Blanda rören 10 gånger och hålla dem under 30 min vid RT utan blandning.
- Samla övre RBC fattiga neutrofil skikt end placera dem i en ren steril 50 ml rör och centrifugera rören vid 300 g under 10 min vid RT. Resuspendera varje pellet med 5 ml PBS tillsätt sedan röda blodkroppar lysbuffert upp till 50 ml totalt.
- Hålla rören i mörker under 15 min vid centrifugera RT sedan vid 500 g under 10 min vid RT. Tvätta nämnda pellets med PBS (lägg PBS upp till 50 ml totalt) centrifugera sedan vid 500 g under 10 min vid RT.
- Resuspendera pellets med komplett RPMI-medium för räkning med hjälp av cellernas livskraft räknare. Hålla 3 x 10 5 av varje celltyp i 50 pl PBS-FBS (4%) i 5 ml plaströr för att bestämma renheten hos deras isolering med användning av flödescytometri.
- Analysera Morfologiska framträdanden av de isolerade cellpopulationer
- För att göra detta, suspendera vardera 3 x 10 4 neutrofiler och 3 x 10 4 mononukleära celler i 150 pl komplett RPMI-medium. Montera glasskivor, filterkort och provkammare i cytospin centrifugen, se till att than centrifugera är väl avvägd.
- Placera varje celltyp i provkammaren och cyto-centrifugera vid 750 xg under 10 min vid RT bort bilderna, filterkort och provkammare från centrifugen. Isär försiktigt, för att inte skada cellerna på bilden. Kasta filterkort och provkammare.
- Färga cellerna med hjälp av Giemsa färgning kit och hålla bilder för en timme för att torka. Undersök cellerna genom mikroskop med 100 gångers förstoring.
- Testa renhet isolerade celler genom FACS
- Märk isolerade primära leukemiceller med antihuman CD19 antikropp konjugerad till APC (5 l / 10 6 celler). Märka de renade neutrofiler med blandning av anti-humana antikroppar som listas i tabell 1 (5 | il / 10 6 celler). Inkubera cellerna i mörker under 30 min vid 4 ° C
- Tvätta cellerna med 500 | il PBS-FBS (4%) centrifugen rören vid 300 g under 5 min vid RT.
- Återsuspendera varje pellet i 200 | il PBS-FBS (4%).
- Analysera på en flödescytometer med användning av följande optiska konfiguration: 488 nm laser: FSC-A (488 nM), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PerCP-Cy5.5 (695/40 BP ), PE (575/26 BP); 633 nm laser: APC (660/20 BP), APC-Cy7 (780/60 BP). Se till att färgkompensation.
- Samodling av primära leukemiceller med Autolog neutrofiler
- Seed 2 x 10 5 celler / ml av enbart eller med autologa neutrofiler vid 1:10 i komplett RPMI-medium primära leukemiceller. För att göra detta, justera cellantalet genom att späda cellsuspensioner och tillsätt 2 x 10 5 celler / ml av primära leukemiceller till 2 x 10 6 celler / ml neutrofiler. Blanda försiktigt.
- Tillsätt 25 | iM av Bruton s tyrosinkinas (Btk) hämmare (ibrutinib) till cellerna. Inkubera i 24 h vid 37 ° C med 5% CO2.
- Cell Harvest och FACS-analys
- Collect cellerna i 5 ml plaströr för FACS-analys och centrifugera rören vid 300 g under 5 min vid RT. Tvätta nämnda pellets med 1 ml PBS-FBS (4%) centrifugera sedan vid 300 g under 5 min vid RT.
- Resuspendera pellets i Annexin V och PI med hjälp av kommersiella kit och Inkubera cellerna i mörker under 10 min vid RT. Analysera på en flödescytometer med användning av grindningsstrategi i figur 2A och följande optiska konfiguration: 488 nm laser: FSC-A (488 nM), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP). Se till att färgkompensation.
2. Differentiering av HL60-celler längs granulocytiska Pathway och deras Coculture med RL lymfom B-celler i 3D-modell
- Differentiering av humana promyelotiska (HL60) Celler i neutrofila liknande celler
- Justera HL60 cellantalet till 3 x 10 5 celler / ml och tillsätt sedan 1 ^ M retinsyra (RA) och 1,25% DMSO för att inducera deras differentiering. Seed varje 3 x 10 5 CO2.
- Senare, samla upp cellerna och centrifugera vid 300 g under 5 min vid RT. Resuspendera celler med komplett RPMI-medium för räkning med hjälp av cellernas livskraft räknare.
- Späd sedan cellsuspensionen i fullständigt RPMI-medium för att justera HL60 cellantalet till 3 x 10 5 celler / ml och inducera igen deras differentiering genom tillsats av 1 ^ M retinsyra (RA) och 1,25% DMSO. Ympa vardera 3 x 10 5 HL60-celler per brunn i 48-brunnars platta och inkubera under ytterligare 48 h vid 37 ° C med 5% CO2.
- Analys av HL60 differentiering (HL60 diff)
- Samla upp cellerna och centrifugera rören vid 300 g under 5 min vid RT. Suspendera pelleten med komplett RPMI-medium för räkning med hjälp av cellernas livskraft räknare.
- För att analysera förändringarna i cell ytmarkörer uttryck med flödescytometri. Placera varje 3 x 10 5 5 HL60 diff-celler i 5 ml plaströr för FACS-analys och centrifugera rören vid 300 g under 5 min vid RT.
- Resuspendera pellets i 50 pl PBS-FBS (4%). Märka cellerna med anti-human CD11b konjugerade till AF700 eller anti-human CD38 konjugerad till APC (5 l / 10 6 celler). Inkubera cellerna i mörker under 30 min vid 4 ° C
- Tvätta med 500 | il PBS-FBS (4%) centrifugera sedan vid 300 g under 5 min vid RT. Resuspendera pellets i 200 | il PBS-FBS (4%).
- Analysera på flödescytometer använder grindstrategi figur 3A och följande optiska konfiguration: 488 nm laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP); 633 nm laser: APC (660/20 BP), Alexa Fluor 700 (730/45 BP).
- För att testa morfologiska förändringar i HL60 diff, immobilisera cellerna på objektglas för mikroskopisk undersökning.
- För att göra detta, resuspendera varje 3 x 10
- Placera varje celltyp i provkammaren och cyto-centrifug vid 1500 rpm under 10 min vid RT. Ta bort bilderna, filterkort och provkammare från centrifugen. Isär försiktigt, för att inte skada cellerna på bilden. Kasta filterkort och provkammare.
- Färga cellerna med hjälp av Giemsa färgning kit och hålla bilder för en timme för att torka. Undersök cellerna genom mikroskop med 100 gångers förstoring.
- För att göra detta, resuspendera varje 3 x 10
- 3-dimensionell (3D) kultur
OBS: Se till att de material som används i detta experiment är kalla och försöket sker på is.- Resuspendera varje 5 x 10 4 RL-celler, antingen ensamt eller blandat med HL60 diff diff 01:10, med 300 pl basalmembranmatrisen med hjälp av en ml pipettspets skära med en steril sax för att vidga öppningen till ca 2-3 mm. Undvika bubblor under detta steg.
- Ympa vardera 300 ul av cellsuspension / brunn i 24-brunnars platta. Undvika bubblor under detta steg. Inkubera plattan i 30 minuter vid 37 ° C med 5% CO2 tillsätt sedan 1 ml fullständigt RPMI-medium för varje brunn och inkubera under 7 dygn vid 37 ° C med 5% CO2. Ändra mediet varannan dag. Tillsätt 10 nM vinkristin vid dag 5.
- FACS-analys
- Efter 7 dagars odling, aspirera mediet och tvätta varje brunn med 1 ml iskall PBS två gånger. Tillsätt 3 ml / brunn av iskall PBS-EDTA (5 mM). Lösgöra gelén från botten av brunnen genom skrapning med hjälp av botten av 200 mikroliter pipettspets. Skaka plattan försiktigt på is under 30 minuter.
- Överför cellsuspension i sterilt 15 ml rör och skaka rören försiktigt ice under ytterligare 30 minuter. Kontrollera om uppkomsten av homogena cellsuspensionen. (Om det inte är fallet, sedan skaka cellerna under längre tid eller lägga till fler PBS-EDTA).
- Centrifugera rören vid 300 xg under 10 min vid RT. Tvätta nämnda pellets med PBS centrifugera sedan vid 300 xg under 10 min vid RT.
- Återsuspendera med PBS-FBS (4%) och märka med anti-human CD19-antikropp konjugerad till PE-Cy7 och anti-human CD38 antikropp konjugerad till APC (5 | il / 10 6 celler). Inkubera i mörker under 30 min vid 4 ° C
- Tvätta med 500 | il PBS-FBS (4%) och därefter centrifugera rören vid 300 g under 5 min vid RT. Resuspendera cellerna med Annexin V och PI med hjälp av kommersiella kit.
- Analysera på flödescytometer använder grindstrategi figur 4A och följande optiska konfiguration: 488 nm laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP); 633 nm laser: APC (660/20 BP). Se till att färgkompensation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Densitetsgradient separation metod som beskrivs här tillhandahåller primära leukemiceller och ostimulerade neutrofiler som isolerats från blodet hos KLL-patienter Figur 1A representerar de olika blodskikten erhållna efter densitetsgradientcentrifugering (från topp till botten:. Plättar och plasma, vita ringen representerar de mononukleära cellerna, densitetsgradientlösningen, granulocyter och erytrocyter). Figur 1B och 1C visar skillnaderna i de morfologiska utseenden mellan neutrofiler (multi-flikig kärnor celler) och mononukleära celler respektive.
Resultaten i fig 1D representerar framåtspridning (FSC) vs sidospridning (SSC) plot av primära leukemiceller (mononukleära celler). Märkning denna population med antihuman CD19 konjugerad till APC visar en fullständig rätt förskjutning av histogrammet (Figur 1E) med endast entopp vilket tyder på att denna patientgrupp är positivt för CD19 och ren. Neutrofiler är också ≥90% ren, vilket verifierats genom flödescytometri efter märkning av isolerade neutrofiler med en blandning av fluorokromkonjugerade monoklonala antikroppar som listas i tabell 1. Figur 1F representerar FSC vs SSC spridningsdiagram av de isolerade neutrofilerna som är positiva för CD45 (figur 1G), positiv för CD15 och negativt för CD14 (figur 1H), positivt för både CD15 och CD16 (figur 1I), positiv för CD16 och negativt för CD56 (figur 1J).
Figur 1. Analys av morfologiska utseenden och renhet av primära leukemiceller och neutrofiler isolerade från patienternas blod. (A) Schematisk bild representerar olika blodlager efter densitet Gradient centrifugering. (BC) Giemsa-färgning representerar de morfologiska skillnaderna mellan (B) neutrofiler och (C) primära leukemiska celler (mononukleära celler). Bilder togs av mikroskop med 100 gångers förstoring. (D) Framåtspridning (FSC) och sidospridning (SSC) plot representerar den isolerade primära leukemicellpopulationen. (E) Isolerade primära leukemiceller märktes med anti-CD19-APC och analyseras med avseende på expression av CD19. Den röda linjen visar de omärkta cellerna och den blå linjen visar celler märkta med anti-CD19-APC. (F) FSC vs SSC spridningsdiagram representerar den isolerade neutrofila populationen. (GJ) Isolerade neutrofiler märktes med en blandning av antikroppar som anges i tabell 1 och analyserades för uttryck av (G) CD45, (H) CD14 och CD15, (i) CD15 och CD16, (J) CD16 end CD56. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| antigener | fluorokrom | Klona |
| CD14 | APC-Vio770 (Cy-7) | TÜK4 |
| CD15 | APC | VIMC6 |
| CD16 | FITC | VEP13 |
| CD45 | PerCP-Vio700 (Cy5.5) | 5B1 |
| CD56 | PE | AF12-7H3 |
Tabell 1. fluorokromkonjugerade Renade monoklonala antikroppar användes för att testa renheten för isolerat Neutrofiler. Alla antikroppar erhölls från Miltenyi Biotech.
figur 2A representerar portar neutrofiler och primära leukemiceller. Neutrofiler är mycket mer detaljerad än de primära leukemiceller så att de visas med högre SSC. Gating på den primära leukemiceller samodlade med neutrofiler i närvaro av ibrutinib, Resultaten visar högre procentandel av levande celler (Figur 2C, 84,8%) jämfört med de celler som odlats enbart (Figur 2B, 53,1%). Lådan grafen i figur 2D visar att decrease av cellviabilitet som inducerats av ibrutinib hämmades signifikant genom närvaron av neutrofiler (40,1 ± 3,1 vs 60,1 ± 3,5, p <0,001, 19 patienter).
Figur 2. Autolog Neutrofiler Skydda Primära leukemiceller mot Ibrutinib. Blod samlades från patienter som diagnostiserats med kronisk lymfatisk leukemi (KLL). Primära leukemiceller isolerades och odlades ensamma eller tillsammans med autologa neutrofiler (N) vid primära leukemiceller: Nratio 01:10 för 24 timmar, i närvaro eller frånvaro av 25 ^ M ibrutinib. Den procentuella andelen levande primära leukemiceller (Annexiv V negativt / PI negativ) mättes genom dubbel färgning med annexin V-FITC och PI, följt av flödescytometrisk analys. (A) Framåtspridning (FSC) och sidospridning (SSC) plot representerar portar neutrofiler och primära leukemiceller. (B) Bi-dimensionell dot-blot visar andelen levande och apoptotiska primära leukemiceller som odlats ensam och behandlades med 25 iM ibrutinib. (C) Bi-dimensionell dot-blot visar andelen levande och apoptotiska primära leukemiceller samarbete odlade med neutrofiler och behandlades med 25 iM ibrutinib. (D) Box plot representerar andelen levande primära leukemiceller av 19 patienter. Data uttrycks som medelvärde ± SD. *** p <0,001 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Den korta halveringstiden för neutrofiler in vitro gör deras användning i 3D kultur ineffektiva. Differentiering av HL60-celler längs granulocytiska vägen framkallades genom differentiering inducerare. Två olika parametrar (cell ytmarkörer uttryck och morfologiska changes) användes för att mäta differentiering av HL60. FSC vs SSC punktdiagram i figur 3A visar att HL60-celler är större i storlek jämfört med HL60 diff celler med högre FSC. Märkning av celler (HL60 eller HL60 diff) med anti-human CD11b antikropp konjugerad till AF700 och anti-human CD38antibody konjugerad till APC visar en ökning av CD11b och CD38 uttryck (figur 3B) vid differentiering som är en indikation på granulocytär differentiering. HL60 diff-celler visar också morfologiska förändringar som upptäckts genom uppträdandet av flera lober kärnor (figur 3C).
Figur 3. strukturella parametrar differentierade HL60-celler. (A) Framåtspridning (FSC) och sidospridning (SSC) tomter representerar HL60 och differentierade HL60-celler (HL60 diff). (B) HL60 och HL60 diff-celler märktes med anti-CD11b-AF700 eller anti-CD38-APC följt av flödescytometrianalys. Efter gating på varje cellpopulation i FSC-A mot SSC-A spridningsdiagram (A), analyserades cellerna för uttryck för CD11b eller CD38. (C) HL60-celler visar morfologiska förändringar som är förenliga med differentiering mot granulocyter. Bilder togs av mikroskop med 100 gångers förstoring. Fet svart pil pekar flera lober kärna. Grafer är representativa för fem oberoende försök. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
För att testa effekten av HL60 diff celler på reglering RL-cellsvar mot vinkristin i 3D-modellen, var RL-celler odlades ensamma eller med HL60 diff i basalmembranmatrisen i närvaro eller frånvaro av vinkristin vid 10 nM. Använda grindningsstrategin som visas i figur 4A, är båda populationerna diskrimineras baserat på CD19 och CD38 uttryck; RL celler positiva för CD19 och HL60 diff celler positiva för CD38. Gating på RL-celler samodlade med HL60 diff-celler i närvaro av vinkristin, Resultaten visar högre procentandel av levande celler (Figur 4C, 35,9%) jämfört med RL-celler odlade enbart (Figur 4B, 19,7%). Stapeldiagrammet i Figur 4D visar en signifikant ökning av andelen levande RL-celler (CD19 positiva Annexin V negativ / PI negativ) i närvaro av HL60 diff-celler (19,5 ± 0,2 mot 33,1 ± 1,0, p <0,001).
Figur 4. neutrofila liknande HL60 diff Celler skyddar RL lymfomceller mot vinkristin i 3D kultur. RL-celler odlades ensamma eller tillsammans med HL60 diff celler vid RL: HL60 diff 1:10 7 dagar i basalmembranmatrisen. På dag 5, var vinkristin (VCR) tillsattes vid en koncentration av 10 nM. Sfäroider dissocierades på dag 7 och celler märktes med anti-CD19-PECy7 och anti-CD38-APC återsuspenderades sedan med annexin V-FITC och PI följt av flödescytometrisk analys. (A) Framåtspridning (FSC) och sidospridning (SSC) plot representerar portar RL-celler och HL60 diff celler. (B) Bi-dimensionell dot-blot visar andelen levande och apoptotiska RL-celler som odlats ensam och behandlades med 10 nM vinkristin. (C) Bi-dimensionell punkt- blot visar andelen levande och apoptotiska RL celler samodlade med HL60 diff och behandlades med 10 nM vinkristin. (D) Stapeldiagrammet visar den procentuella andelen levande RL-celler. Data uttrycks som medelvärde ± SD. *** P ≤0.001.jove.com/files/ftp_upload/53846/53846fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrivs här, en effektiv, enkel, snabb och billig protokoll för isolering av neutrofiler från humant blod med hög renhet med användning av densitetsgradientcentrifugering tillvägagångssätt och inom samma steg mononukleära celler är också separeras och utvinnas. De isolerade cellpopulationer är ≥90% ren.
Flera metoder finns tillgängliga för neutrofila isolering från humant blod. Dessa innefattar liknande metoder med användning av diskontinuerliga gradienter 11,12, eller med hjälp av kommersiella kit för neutrofil isolering genom positiv immuno-magnetisk selektion under vilken neutrofiler är immuno-magnetiska märkta med specifik antikropp såsom anti-human CD16 sedan neutrofiler anrikas genom bindning av den CD16- positiva celler på en magnetisk kolonn 13. Kommersiella kit med negativt immuno-magnetisk selektion är också tillgängliga under vilken helblod eller granulocyt suspension är märkta med en cocktail av antikroppar som binder på celler andra than neutrofiler 9 (dvs antikroppskomplex som märka RBK, blodplättar och oönskade celler, såsom CD2, CD3, CD9, CD19, CD36, CD56, glykoforin A och dextran-belagda magnetiska partiklar), så neutrofiler berikas genom eluering som antikropps negativ fraktion av celler som inte binder på magnet kolumnen. Dessutom kan neutrofiler isoleras genom fluorescensaktiverad cellsortering 14.
Vissa tekniker har visat sig ge höga utbyten av rena neutrofiler, såsom positiv immuno-magnetisk selektion. Emellertid har denna metod nackdelar jämfört med densitetsgradientcentrifugering metoder på grund av de märkningsmedel som binder på ytan av neutrofiler och detta skulle kunna påverka deras funktion genom att inducera deras aktivering eller differentiering. Också med hjälp av positiva immunmagnetiska urvalsmetod, antikropp-märkta neutrofiler binder på en magnetisk kolonn för separation och detta kan också påverka deras funktion.Fluorescensaktiverad cellsortering har en annan begränsning i den mån denna metod kräver längre tid för att samla in de celler som kan påverka neutrofila överlevnad negativt på grund av deras korta halveringstid.
Densitetsgradientcentrifugering metod är mycket jämförbara och den neutrofila renhet kan överstiga 90% med användning av båda förfarandena, men den förstnämnda är en två-lagers gradient, som är tekniskt mindre utmanande jämfört med skiktning gradient lösning som består av 40%, 60% och 80% vol / vol i PBS. Det nämndes av Swamydas et al. 15 att sammanblandning av gränssnitten gradientlösningen sker ofta på grund av att de små densitetsskillnader mellan de tre skikten. Med avseende på de negativa immuno-magnetiska urvalsmetoder, har de också rapporterats vara effektiva för neutrofil isolering med hög renhet och livsduglighet 9. Deras fördel gentemot positiv immunmagnetisk selektion och fluorescensaktiverad cellsortering är att neutrofilerär inte märkta med eventuella märkningsmedel och inte binder till magnetisk kolonn, varigenom man undviker cellaktivering men denna metod är mycket dyrare och mer tidskrävande jämfört med densitetsgradient-metoden.
Neutrofiler genomgår normalt snabb spontan apoptos både in vitro och in vivo 16,17. HL60promyelocyticcells behålla många egenskaper humanleukocytinterferoner progenitorceller, såsom möjligheten att genomgå differentiering till neutrofiler 18. Till skillnad från neutrofiler, HL60 diff celler inte snabbt genomgå apoptos och använda dessa celler löser problemet med att ha olika svar av neutrofiler på grund av deras isolering från olika givare.
Nyligen 3D kulturer blir mer mogen och relevant för människors och djurs fysiologi, och en attraktiv modell för olika biologisk forskning, särskilt när det gäller cancer. Mönstret övergången från 2D till 3D kultur går snabbt since den senare är mer iögonfallande under studera olika patologiska tillstånd, såsom cancer 19. Det finns en ökande medvetenhet om nackdelarna med 2D-kultur där lägga till en tredje dimension till en cell miljö är viktigt för att ta en närmare titt på betydelsen av cellulära interaktioner 20 och att studera skillnaderna i cellulär beteende och egenskaper. 3D kultur skapar en miljö som liknar förhållandena i en levande organism (t ex., Människa) som leder till mer relevant forskning. Men innebär 3D kultur det komplexa samspelet mellan olika partners såsom celler, extracellulära matriser och mellan vätskor vilka inte förekommer i 2D kultur. Således kommer det att krävas insatser för att fastställa metod kalibrering och att räkna med god laboratoriepraxis samt effektiva leveranser särskilt de kommersiella märken som i stor utsträckning är testade och övervakas.
Tumörens mikromiljöbestår av flera celltyper, däribland många immuncellpopulationer som deltar i och reglerar tumörbildning, metastas och svar på anticancermedel 21,22. Flera studier har visat att en ökning av neutrofila infiltration i tumörer är signifikant korrelerad med förvärvad resistens mot flera anticancermedel såsom anti-VEGF terapi 23,24. Vidare höjd i förbehandlings neutrofila granulocyter hos patienter med metastaserad njurcellscancer 25, liksom närvaron av en hög nivå av intratumoral neutrofiler hos patienter med olika solida tumörer, har 26 föreslagits som prognostiska faktorer för dålig överlevnad. Vår studie visar att neutrofiler kan spela en roll för att skydda lymfom B-celler från anticancermedel apoptos.
Sammanfattningsvis kan tillförlitlig och reproducerbar metod som beskrivs här kan användas på alla laboratorier för att samla neutrofiler och mononukleära celler från humen blod. Dessutom är differentieringen av HL60 celler längs granulocytiska vägen fram för att undvika vissa neurophil problem såsom snabb spontan apoptos. Dessa metoder har använts för att studera betydelsen av neutrofiler på känsligheten hos lymfomceller till anti-lymfommedel där neutrofiler visar en skyddande effekt på lymfomceller mot dessa medel genom användning av 2D och 3D-odlingssystem. Dessa tillvägagångssätt kan användas för en mängd olika neutrofila funktionella studier som bör fördjupa förståelsen för neutrofil roll i cancerbiologi. I synnerhet kan denna metod användas för att bättre förstå den överhörning mellan neutrofiler och tumörceller eller mellan neutrofiler och andra komponenter i mikromiljö.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Gibco Invitrogen | 21875-034 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco Invitrogen | 10270-106 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium) | Gibco Invitrogen | 14040-091 | |
| N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine) | Life technologies | 25030-024 | |
| Penicillin streptomycin (Pen Strep) | Life technologies | 15140-122 | |
| Bruton's tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib) | CliniSciences | A3001 | |
| Vincristine | EG labo | ||
| BD Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | Put at 4 oC overnight (O/N) before the day of the experiment |
| Red cell lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Ficoll (Pancoll) | PAN Biotech | P04-60500 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Euromedex | S3014 | |
| Annexing V-FLOUS staining kit | Roche | 11 988 549 001 | |
| Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kit | Cosmos Biomedical | CB361550-0000 | |
| LSRII flow cytometry | BD Biosciences | ||
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | ||
| Leica DMR-XA microscope | Leica Microsystems | ||
| Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter | Nexcelom Bioscience |
References
- Gocheva, V., et al. IL-4 induces cathepsin protease activity in tumor-associated macrophages to promote cancer growth and invasion. Genes Dev. 24, 241-255 (2010).
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M.
- Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).
- DeNardo, D. G., et al. Leukocyte Complexity Predicts Breast Cancer Survival and Functionally Regulates Response to Chemotherapy. Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).
- Di Carlo, E., et al. The intriguing role of polymorphonuclear neutrophils in antitumor reactions. Blood. 97, 339-345 (2001).
- Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. Int. Immunopharmacol. 10, 1325-1334 (2010).
- Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat. Rev. Immunol. 11, 519-531 (2011).
- Kelbaek, H. Sterile isolation of polymorphonuclear leukocytes from large blood volumes. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Z. FürKlin. Chem. Klin. Biochem. 23, 17-20 (1985).
- Aynaud, M. -M., et al. Human Tribbles 3 protects nuclear DNA from cytidine deamination by APOBEC3A. J. Biol. Chem. 287, 39182-39192 (2012).
- Ziòłkowska, K., et al. Long-term three-dimensional cell culture and anticancer drug activity evaluation in a microfluidic chip. Biosens.Bioelectron. 40, 68-74 (2013).
- Eggleton, P., Gargan, R., Fisher, D. Rapid method for the isolation of neutrophils in high yield without the use of dextran or density gradient polymers. J. Immunol. Methods. 121, 105-113 (1989).
- Behnen, M., et al. Immobilized immune complexes induce neutrophil extracellular trap release by human neutrophil granulocytes via FcγRIIIB and Mac-1. J. Immunol. Baltim.Md 1950. 193, 1954-1965 (2014).
- Hirsch, G., Lavoie-Lamoureux, A., Beauchamp, G., Lavoie, J. -P. Neutrophils are not less sensitive than other blood leukocytes to the genomic effects of glucocorticoids. PloS One. 7, 44606 (2012).
- Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J. Leukoc. Biol. 94, 193-202 (2013).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. , e50586 (2013).
- Scaife, H., Woldehiwet, Z., Hart, C. A., Edwards, S. W. Anaplasmaphagocytophilum reduces neutrophil apoptosis in vivo. Infect. Immun. 71, 1995-2001 (2003).
- Maianski, N. A., Maianski, A. N., Kuijpers, T. W., Roos, D.
- Dalton, W. T., et al. HL-60 cell line was derived from a patient with FAB-M2 and not FAB-M3. Blood. 71, 242-247 (1988).
- Hogan, C., Kajita, M., Lawrenson, K., Fujita, Y. Interactions between normal and transformed epithelial cells: Their contributions to tumourigenesis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 496-503 (2011).
- Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell Tissue Res. 352, 123-131 (2013).
- Mantovani, A. Macrophages, Neutrophils, and Cancer: A Double Edged Sword. New J. Sci. , 271940 (2014).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 3, 309-322 (2012).
- Shojaei, F., Ferrara, N. Refractoriness to antivascular endothelial growth factor treatment: role of myeloid cells. Cancer Res. 68, 5501-5504 (2008).
- Liang, J., et al. Neutrophils promote the malignant glioma phenotype through S100A4. Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res. 20, 187-198 (2014).
- Teramukai, S., et al. Pretreatment neutrophil count as an independent prognostic factor in advanced non-small-cell lung cancer: an analysis of Japan Multinational Trial Organisation LC00-03. Eur. J. Cancer Oxf.Engl 1990. 45, 1950-1958 (2009).
- Zhu, Q., et al. The IL-6-STAT3 axis mediates a reciprocal crosstalk between cancer-derived mesenchymal stem cells and neutrophils to synergistically prompt gastric cancer progression. Cell Death Dis. 5, 1295 (2014).
