Summary
توفير المواد النانوية تنوعاً آليات التسليم المراقب العلاجي للعلوم الأساسية والتطبيقات متعدية الجنسيات، ولكن على تلفيق غالباً ما تتطلب خبرة غير متوفر في المختبرات الطبية الأكثر. نقدم هنا، بروتوكولات قابلة التصنيع وتحميل العلاجية المتنوعة نانوكاريرس الذاتي تجميعها باستخدام نانوبريسيبيتيشن فلاش.
Abstract
المواد النانوية يقدم مجموعة واسعة من الخيارات لتخصيص التسليم المراقب من حمولات الجزيئية مفردة ومجتمعة للتطبيقات العلاجية والتصوير. يمكن أن يكون هذا التحديد زيادة آثار سريرية هامة، بما في ذلك انخفاض الآثار الجانبية والجرعات المنخفضة بفاعلية أكبر. وعلاوة على ذلك، في الموقع استهداف والتحوير التي تسيطر عليها من مجموعات فرعية خلية معينة يمكن تعزيز التحقيقات في المختبر و في فيفو الظواهر البيولوجية الأساسية والتحقيق في وظيفة الخلية. ولسوء الحظ، الخبرة المطلوبة في علوم النانو والكيمياء والهندسة وكثيراً ما تحظر المختبرات دون خبرة في هذه المجالات من اختﻻق وتخصيص المواد النانوية كأدوات لتحقيقاتها أو المركبات لما الاستراتيجيات العلاجية. هنا، نحن نقدم البروتوكولات للتوليف والجمعية قابلة نظام كوبوليمر تنوعاً غير سامة كتلة قابلة لتشكيل السطحية وتحميل مركبات النانو للتطبيقات الطبية الحيوية. ويرد نانوبريسيبيتيشن فلاش كمنهجية للتصنيع السريع من نانوكاريرس متنوعة من poly(ethylene glycol)-bl-البوليمرات الإسهامية بولي (كبريتيد البروبيلين). هذه البروتوكولات سيسمح مختبرات مع مجموعة واسعة من الخبرات والموارد اللازمة لسهولة وتكاثر اختﻻق نظم إيصالها nanocarrier متقدمة للتطبيقات الخاصة بهم. عملية تصميم وتشييد صك المؤتمتة التي تستخدم مضخة الحقن عالية السرعة لتسهيل نانوبريسيبيتيشن فلاش والسماح لتعزيز السيطرة على التجانس، الحجم ومورفولوجيا وتحميل نانوكاريرس بوليميرسومي ووصف.
Introduction
نانوكاريرس تسمح بالتسليم المراقب للشحنات الصغيرة والجزيئات، الكيانات النشطة بما في ذلك، هذا أن لم يكن مغلفة، سيكون أما التحلل بدرجة عالية و/أو مسعور جداً للإدارة في فيفو. مورفولوجيس nanocarrier ملفقة بانتظام، حويصلات البوليمرية يناظر الدهنية (وتسمى أيضا بوليميرسوميس) توفر القدرة على تحميل الشحنات ماء ومسعور1،2في وقت واحد. على الرغم من مزاياها واعدة، بوليميرسوميس ما زالت نادرة في التطبيقات السريرية يرجع، جزئيا، إلى العديد من التحديات الرئيسية في صنعها. للاستخدام السريري، يلزم تركيبات بوليميرسومي على دفعات على نطاق واسع والعقيمة، ومتسقة.
يمكن استخدام عدد من التقنيات للنموذج بوليميرسوميس من كوبوليمر ديبلوك، مثل poly(ethylene glycol)-كتلة-بولي (كبريتيد البروبيلين) (شماعة-bl-ذكر المكتب الصحفي)، التي تشمل المذيبات التشتت3، رقيقة الإماهة1 , 4، 5،ميكروفلويديكس6، وترطيب مباشرة7. تشتت المذيبات تنطوي على حضانة طويلة أوقات حضور المذيبات العضوية، التي قد تؤذي بعض الحمولات النشطة بيولوجيا، مثل البروتينات. لا تقدم الإماهة رقيقة السيطرة على بوليديسبيرسيتي بوليميرسوميس المشكلة، وكثيراً ما تتطلب تقنيات البثق مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً لتحقيق مونوديسبيرسيتي مقبولة. وعلاوة على ذلك، يصعب ميكروفلويدس وترطيب مباشرة إلى مقياس لحجم الإنتاج الأكبر. أساليب تصنيع nanocarrier المختلفة، يقدم نانوبريسيبيتيشن فلاش (تزعمت) القدرة على جعل تركيبات واسعة النطاق واستنساخه8،،من910. بينما تزعمت تم حجزها من قبل لصياغة جسيمات نانوية النواة الصلبة، لدينا مختبر وسعت مؤخرا استخدام تزعمت تشمل تشكيل متسقة المتنوعة شماعة-bl-ذكر المكتب الصحفي نانوستروكتوري مورفولوجيس11، 12، بما في ذلك بوليميرسوميس11 وبيكونتينووس نانوسفيريس12. وجدنا أن تزعمت كان قادراً على تشكيل تركيبات مونوديسبيرسي من بوليميرسوميس دون الحاجة لقذف، أسفر عن قيم الفهرس polydispersity متفوقة مقارنة مع بوليميرسوميس غير مقذوف شكلتها تشتت الإماهة والمذيبات رقيقة 11-نانوسفيريس بيكونتينووس، مع نطاقاتها مسعور كبيرة، لم تكن قادرة على أن تتشكل بواسطة الإماهة رقيقة، وعلى الرغم من تشكيل تحت عدد من الشروط المذيبات مع تزعمت12.
هنا، نحن نقدم وصفاً مفصلاً للتقرير التوليفي الوتد-bl-PPS ديبلوك كوبوليمر المستخدمة في تشكيل بوليميرسومي، خلاط الطائرات (CIJ) اصطدام يقتصر استخدامها للأغذية، تزعمت البروتوكول نفسه، وتنفيذ النظام الآلي الحد من تقلب المستخدم. وشملت هو المعلومات المتعلقة بكيفية تعقيم النظام بما فيه الكفاية لإنتاج مستحضرات خالية من الذيفان للاستخدام في فيفو، وممثله من البيانات المتعلقة بتوصيف بوليميرسوميس التي تزعمت شكلها. مع هذه المعلومات، سيكون قادراً على اختﻻق بهم تركيبات مونوديسبيرسي العقيمة، مع الاهتمام باستخدام بوليميرسوميس للعمل في المختبر و في فيفو القراء. القراء مع خبرة في تركيبات nanocarrier ومع الخبرة توليف البوليمر سوف تكون قادرة على اختبار سرعة نظمها البوليمر استخدام تزعمت كبديل محتمل لتقنيات الصياغة الحالية. بالإضافة إلى ذلك، قد تستخدم البروتوكولات المبينة في هذا التقرير كأدوات تعليمية لصياغة نانوكاريرس في دورات مختبر تكنولوجيا النانو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-تجميع Poly(ethylene glycol)-كتلة-بولي (كبريتيد البروبيلين)-ثيول
- توليف ميثوكس-poly(ethylene glycol) mesylate (Mn: 750) (ميو-شماعة17-مرض التصلب العصبي المتعدد، وأنا).
- حل 10 غم من ميو-شماعة17-OH في 200 مل تولوين 100% داخل قارورة قاع جولة 3-رقبته (المصرف) تحت إثارة المغناطيسية 600 لفة في الدقيقة.
- الاتصال المصرف 3-رقبته بجهاز ستارك عميد، نفسها تعلق على مكثف، والحفاظ على النظام بأكمله تحت غاز خامل، أما من النيتروجين أو الأرجون.
- مكان المصرف 3-رقبته في حمام زيت، الحرارة إلى 165 درجة مئوية بينما التحريك 600 لفة في الدقيقة.
- إزالة المياه تتبع و 100 مل من التولوين استخدام تقطير أزيوتروبي.
- إزالة المصرف 3-رقبته من النفط وفصل جهاز ستارك عميد، مع الحفاظ على شروط غاز خامل، والسماح لتبرد بدرجة حرارة الغرفة.
- إضافة 5.6 مل من إثيل 100% (مكافئ. المولى 3) و 300 مل من اللامائى 100% التولوين إلى ميو-شماعة17-أوه الحل أثناء التحريك 600 لفة في الدقيقة.
- نقل المصرف 3-رقبته إلى حمام الثلج، والحفاظ على إثارة في 600 لفة في الدقيقة والظروف غاز خامل.
- تمييع 3.1 مل كلوريد ميثانيسولفونيل 100% (مكافئ. المولى 3) في 30 مل تولوين 100%، إضافة ببطء إلى المصرف 3-رقبته عبر قمع إضافة حين إثارة 600 لفة في الدقيقة.
- ضجة بين عشية وضحاها 600 لفة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة تحت ظروف خاملة.
- حل التصفية عن طريق قمع بوخنر معبأة مع الأرض مشطوري (انظر الجدول للمواد) لإزالة الأملاح.
- إزالة التولوين عبر مبخر دوراني مع حوض ماء تعيين إلى 40 درجة مئوية، والتناوب في 120 دورة في الدقيقة، والضغوط تعيين بين 50-100 ميليبار.
- حل إعادة المنتج في 200 مل الميثان (DCM) من 100%، وتصفية من خلال قمع بوخنر معبأة مع الأرض مشطوري (انظر الجدول للمواد).
- إزالة DCM عبر مبخر دوراني مع حوض ماء تعيين إلى 40 درجة مئوية، والتناوب في 120 دورة في الدقيقة، والضغوط تعيين بين 450-600 ميليبار.
- ماما حل إعادة المنتج في DCM 100% ويعجل ببطء المنتج بإضافته دروبويسي (عبر ماصة باستور) إلى 500 مل من المثلج الاثير ثنائي إثيل 100%. الحفاظ على إثارة 300 لفة في الدقيقة.
- صب أو نضح لإزالة إثيل الاثير من سرع المنتج، ميو-شماعة17-Mesylate، ومخزن بين عشية وضحاها في فراغ مجففة لتجف تماما.
- استخدام المنتج فورا، أو تخزين تحت غاز خامل في-20 درجة مئوية لعدة أشهر.
- توليف ميثوكس-poly(ethylene glycol) ثيواسيتاتي (ميو-شماعة17-تا، ثانيا).
- حل 5 غ من ميو-شماعة17-مرض التصلب العصبي المتعدد (ط) في 200 مل ديميثيلفورماميدي اللامائى (DMF) 100% في المصرف 3-رقبته، ويقلب 600 لفة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة تحت غاز خامل.
- إضافة 2.5 g كربونات البوتاسيوم 100% (مكافئ. المولى 3) إلى إثارة الحل.
ملاحظة: لا سوف تذوب كربونات البوتاسيوم تماما في الحل. - تمييع 1.3 مل حمض ثيواسيتيك 100% (مكافئ. المولى 3) في 100 مل 100% DMF اللامائى، وإضافة دروبويسي إلى الحل عن طريق قمع إضافة.
ملاحظة: حمض ثيواسيتيك له رائحة قوية، ويرضي. ويجب الحرص على إبقاء كافة الكائنات المتسخة داخل غطاء الأبخرة الكيميائية بين عشية وضحاها قبل التخلص منها أو التنظيف. - يحرك بقوة (600 أو أكبر لفة في الدقيقة) بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: يمكن بسهولة تعطيل تشكيل الملح إثارة هذا الحل. ويجب الحرص على الحفاظ على إثارة بين عشية وضحاها. - حل التصفية عن طريق قمع بوخنر معبأة مع الأرض مشطوري (انظر الجدول للمواد).
- إزالة DMF عبر مبخر دوراني مع حوض ماء تعيين إلى 60 درجة مئوية، والتناوب في 120 دورة في الدقيقة، والضغوط تعيين بين 5-15 ميليبار.
- حل المنتج في 100 مل من رباعي هيدرو الفوران 100% (THF) وإضافة إلى عمود معبأة مع شركة ألومينا محايدة لإزالة الشوائب اللون الأحمر/البرتقالي.
- إزالة THF عبر مبخر دوراني مع حوض ماء تعيين إلى 40 درجة مئوية، والتناوب في 120 دورة في الدقيقة، والضغوط تعيين بين 200-300 ميليبار.
- ماما حل إعادة المنتج في DCM 100%. إذا كان أشكال ترسبات ملح، وحل التصفية عن طريق 6 ميكرومتر المسامية حجم تصفية الورق باستخدام قمع بوخنر.
- يعجل ببطء المنتج عن طريق إضافة dropwise عبر ماصة باستور إلى 500 مل من 100% المثلج إثيل الاثير، إثارة 300 لفة في الدقيقة. إثيل الاثير قد تحتاج أن تكون كذلك مبردة إلى-20 درجة مئوية في الثلاجة الانفجار لعدة ساعات إذا لم تحطم متسرعا من الحل في 4 درجات مئوية.
- صب أو نضح لإزالة إثيل الاثير من سرع المنتج، ميو-PEG17-ثيواسيتاتي. تخزين المنتج بين عشية وضحاها في مجفف فراغ، وفي وقت لاحق تحت غاز خامل في-20 درجة مئوية.
- توليف ديبلوك كوبوليمر poly(ethylene glycol)-كتلة-poly(propylene sulfide)-ثيول (شماعة17-bl-PPS35-ش، الثالث).
- حل ميو-شماعة17-تا (الثاني) في 10 مل من 100% DMF اللامائى داخل قارورة شلينك تحت الأرجون، بينما التحريك 400 لفة في الدقيقة في حمام مائي في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 1.1 مكافئ المولى من ميثوكسيد الصوديوم (0.5 م حل في الميثانول)، السماح لإثارة 400 لفة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
- إضافة 35 مكافئ المولى من كبريتيد البروبيلين 100%، سريعاً، إلى الحل. واسمحوا أن يحرك 400 لفة في الدقيقة لمدة 10 دقائق.
- إضافة مكافئ مولى 10 من 100% حمض الخليك الجليدية، والسماح لتحريك 400 لفة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
- إزالة DMF عبر مبخر دوراني مع حوض ماء تعيين إلى 60 درجة مئوية، والتناوب في 120 دورة في الدقيقة، والضغوط تعيين بين 5-15 ميليبار.
- إعادة حل المنتج اقتصد في DCM 100%، ويعجل في 80 مل ميثانول 100%، انقسام بين اثنان أنابيب الطرد المركزي المخروطية 50 مل.
- أنابيب الطرد المركزي المخروطية في 7500 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح المادة طافية بعيداً.
- تخزين المنتج، شماعة17-bl-PPS35-ش، بين عشية وضحاها في مجفف فراغ، وفي وقت لاحق تحت غاز خامل في-20 درجة مئوية.
2-تجميع شماعة-bl-"ذكر المكتب الصحفي نانوكاريرس" عبر "هاندبوويريد نانوبريسيبيتيشن فلاش"
- (اختياري) تعقيم في خلاط الطائرات (CIJ) اصطدام المحصورة.
- داخل سلامة بيولوجية مجلس الوزراء (BSC)، غمر خلاط مع جميع أجزاء مفككة داخل 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم بين عشية وضحاها.
- يحشدوا CIJ خلاط، وتتدفق المياه خالية من الذيفان باستخدام المحاقن اللوير لوك.
- اختبار الرقم الهيدروجيني للماء، ويستمر تدفق المياه من خلال حتى تسجيلات الأس الهيدروجيني كمحايد.
- حل شماعة17-bl-PPS35-ش البوليمر والشحن مسعور في THF (اصطدام الحل رقم 1).
- تزن 20 ملغ شماعة17-bl-PPS35-SH في أنبوب 1.5 مل.
- إضافة الأصباغ مسعور (مثلاً،دي، ICG)، المخدرات (علىسبيل المثال،ربمسن)، أو البضائع الأخرى.
ملاحظة: قد تكون البضائع الجافة، أو المذابة في مذيب الماء الامتزاج، يفضل أن تكون THF. إذا كانت البضائع غير قابلة للذوبان في THF أو DMF، المذيبات المائية الامتزاج آخر قد تستعمل، لكن ماما، البوليمر من غير المحتمل أن تكون قابلة للذوبان. كمية البضائع التي يمكن تحميل يتوقف على خصائص البضائع نفسها (مثلاً، الوزن الجزيئي، هيدروفوبيسيتي، اعتبارات الفراغية)، وينبغي أن تستكشف على أساس حالة بحالة11،12. - إضافة 500 ميليلتر من 100% THF البوليمر والشحن، دوامة بقوة حل.
- حل الشحن ماء في المخزن المؤقت مائي (اصطدام الحل 2). لهذا، حل شحن ماء يتم تحميلها داخل حويصلات البوليمر في 500 ميليلتر لوجود مخزن مائي (مثلاً، الفوسفات مخزنة المالحة، النقي والمياه، إلخ) حسب الحاجة.
- إضافة المخزن المؤقت إلى الخزان.
- إضافة 2.5 مل من وجود مخزن مائي من خيار (مثلاً، 1 x الفوسفات مخزنة المالحة) إلى خزان مناسب حجم (مثلاً قنينة التﻷلؤ زجاج 20 مل). مكان الخزان تحت خلاط CIJ مثل التدفق من خالط يدخل مباشرة في الخزان.
- تحميل الحلول اصطدام في المحاقن البلاستيكية منفصلة 1 مل.
- تصطدم الحلول ضد بعضها البعض لتشكل النانو وتحميلها مع الحمولة في الوقت نفسه.
- إدراج المحاقن في محولات اللوير لوك في الجزء العلوي من خلاط CIJ.
- في حركة واحدة والسلس والسريع، تخفض كلا المحاقن في نفس الوقت وبنفس القوة.
ملاحظة: إذا كان أداء إيمبينجيمينتس متسلسلة متعددة، أولاً جمع التدفق في خزان فارغ. - (اختياري) أداء إيمبينجيمينتس متعددة. الحل nanostructure الوليدة انقسام بين اثنين من الحقن، وكرر الخطوات 2.6.1-2.6.2 ما يصل إلى 4 مرات أكثر.
- جمع التدفق في خزان مائي تعبئة المخزن المؤقت إعداد 2.4.1 ويقلب برفق التأكد من خلط.
- إزالة تفريغ البضائع والمذيبات العضوية.
- (الخيار 1) دياليزي صياغة nanocarrier في نفس المخزن المؤقت المائية المستخدمة لاصطدام وفي الخزان باستخدام أنابيب ميغاواط المناسبة الانقطاع لمدة 24 ساعة على الأقل مع التغييرات المخزن المؤقت على الأقل 2. وهذا يمكن أن يتم في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: سيتم الاحتفاظ نانوكاريرس بأنابيب مع قطع ميغاواط < كاتشين 100,000 وقد يحتمل أن يكون الاحتفاظ بسقف أعلى، وكذلك. يحتفظ هذا الخيار العقم عند إجراء عملية في بكالوريوس باستخدام المخزن المؤقت العقيمة. - (الخيار 2) تصفية وضع من خلال حجم الاستبعاد أو الملحي/المخزن المؤقت تبادل العمود (مثلاً، سيفاروسي 6B العمود) باستخدام برنامج تلفزيوني x 1 كمخزن مائي.
ملاحظة: هذا الخيار يحافظ على العقم عند إجراء عملية في بكالوريوس مع عمود الذي قد تم تعقيمها جيدا. - (الخيار 3) إزالة المذيبات العضوية المتطايرة استخدام جفاف فراغ بين عشية وضحاها.
- (الخيار 4) تصفية وضع استخدام نظام ترشيح تدفق عرضية استخدام عامل تصفية كاتشين 50-100 بمعدل تدفق 20-60 مل في دقيقة لمدة 15 دقيقة إلى 1 ساعة، اعتماداً على الوزن الجزيئي للبضائع الحاسوبية التي يجري تنقية بعيداً (الشحنات الأكبر سوف يستغرق وقتاً أطول).
- (الخيار 1) دياليزي صياغة nanocarrier في نفس المخزن المؤقت المائية المستخدمة لاصطدام وفي الخزان باستخدام أنابيب ميغاواط المناسبة الانقطاع لمدة 24 ساعة على الأقل مع التغييرات المخزن المؤقت على الأقل 2. وهذا يمكن أن يتم في درجة حرارة الغرفة.
- (اختياري) التركيز في صياغة nanocarrier.
- (الخيار 1) التركيز على استخدام نظام مركزات تدور (مثلاً، تدور في العمود مع ميغاواط استقطاع > 100,000)، وتستخدم كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.
ملاحظة: قد تحتاج إلى أن يكون حراكه بين يدور نانوكاريرس وقد تتطلب عددا من يدور على التركيز وصولاً إلى الحجم المطلوب. قد يقلل من تركيز تدور العقم تركيبات nanocarrier. - (الخيار 2) تقليل حجم استخدام جفاف فراغ.
ملاحظة: تغيير حجم تصعب السيطرة عليها في ظل هذه الظروف، ويجب الحرص على الحفاظ على الاسموليه قبل وبعد الاعتقال.
- (الخيار 1) التركيز على استخدام نظام مركزات تدور (مثلاً، تدور في العمود مع ميغاواط استقطاع > 100,000)، وتستخدم كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.
- تخزين نانوكاريرس في 4 درجات مئوية لمدة أسابيع إلى شهور. قبل الاستخدام بعد التخزين، بإيجاز دوامة nanocarrier الصياغات.
3-تميز تركيبات Nanocarrier
-
قياس كفاءة تحميل
- إذا كانت البضائع الفلورسنت أو يمتص بشدة على طول موجي معين خارج 260-450 نانومتر، قياس الأسفار/امتصاص استخدام فلوريميتير/جهاز المطياف الضوئي.
ملاحظة: شماعة-bl-ذكر المكتب الصحفي يمتص بشدة من 260-310 نانومتر وتركيبات بوليميرسومي استيعاب من 310-450 نانومتر، مما قد يؤدي إلى تعقيد التقدير الكمي للبضائع التي تمتص في موجه مماثلة. - إذا كانت البضائع يمتص داخل نطاق 260-450 نانومتر وهو ماء، تعطيل شماعة-bl-ذكر المكتب الصحفي النانو بإضافة 25 ميكروليتر من الصياغة على حجم تساوي من 1 ٪ ح2س2 أو 1% Triton X-100 وبعد ذلك فصل وتمييز مخازن البضائع من امتصاص البوليمر عن طريق عالية الأداء اللوني السائل ([هبلك]) باستخدام عمود استبعاد حجم متوافقة مع مائي (مثل عمود 6B سيفاروسي) 11.
- إذا كانت البضائع يمتص داخل نطاق 260-450 نانومتر وقابل للذوبان في THF أو DMF، ليوفيليزي الصياغة بتجميد 100 ميكروليتر في أنبوب بلاستيكي 1.5 مل في-80 درجة مئوية بين عشية وضحاها. ثم ضع الأنبوبة إلى حاوية فراغ الزجاج ومكان على ليوفيليزير. السماح لأربع وعشرين ساعة ليوفيليزيشن تحدث، وبعد ذلك إعادة تذوب في 50 ميكروليتر من DMF أو THF قبل الانفصال والكشف عن طريق [هبلك].
- إذا كانت البضائع الفلورسنت أو يمتص بشدة على طول موجي معين خارج 260-450 نانومتر، قياس الأسفار/امتصاص استخدام فلوريميتير/جهاز المطياف الضوئي.
-
مورفولوجيا وقياس حجم nanocarrier
- استخدام تشتت الضوء الحيوي (DLS)11 أو نانوحبيبات تتبع تحليل13 لقياس حجم nanocarrier.
ملاحظة: نانوكاريرس التي تكونت من شماعة17-bl-PPS35-ش يتوقع لها متوسط قطرها بين 100-200 نانومتر، مع polydispersity الفهرس < 0.3. - تحديد مورفولوجيا nanocarrier استخدام النقل المبردة الميكروسكوب الإلكتروني (كريوتيم)14.
ملاحظة: نانوكاريرس التي تكونت من شماعة17-bl-PPS35-ش من المتوقع أن تكون حويصلات البوليمر (بوليميرسوميس) مع الأغشية البوليمرية واضح ملموس وشكل كروي إلى حد كبير.
- استخدام تشتت الضوء الحيوي (DLS)11 أو نانوحبيبات تتبع تحليل13 لقياس حجم nanocarrier.
-
(اختياري) اختبار تركيبات الذيفان
- (الخيار 1) استخدام تحليل يستند إلى الخلية لوجود الذيفان أو خلايا الأزرق الخام مثلاً، أو خلايا TLR4 HEK الأزرق (انظر الجدول للمواد)، كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة، في أما تحليل الكمي أو النوعي ل lipopolysaccharides (LPS)13 .
- (الخيار 2) استخدام أدوات تحليل15 ليساتي ليمولوس أميبوسيتي (ال)، كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.
4-تصنيع مضخة الحقن عالية السرعة للأغذية
- اصطناع مكونات أداة مخصصة.
ملاحظة: تتوفر نماذج ثلاثية الأبعاد لجميع أجزاء مخصصة بالقطع في المواد التكميلية.- آلة هيكل الصك متعدد الطبقات من ¾ "ألواح اﻷكريليك وتجميع (انظر ملفات تكميلية 1-5).
ملاحظة: قد اﻷكريليك ضعف المقاومة الكيميائية. إذا كان الصك ليتم استخدامها مع مذيبات قاسية، وآله القاعدة من معدن تعتبر مناسبة للتطبيق. - طباعة أجزاء الطباعة ثلاثية الأبعاد مع البلاستيك بوليلاكتيدي (جيش التحرير الشعبي).
- طباعة على جهاز 2-جزء الطرد (SE) حقنه: سراج الدين الجزء 1-"تزعمت الخلفي" كتلة عقد النقل (5F الشكل، الجزء الرمادي؛ ملف تكميلي 6) وسراج الدين الجزء 2-دليل "طرد الجبهة" (الشكل 5F، جزء السوداء؛ ملف تكميلي 7). انظر 2 ملف تكميلي للخطط.
- طباعة الأقواس استشعار الأشعة تحت الحمراء (الشكل 5I، مربعات سوداء؛ الملفات التكميلية 8 و 9).
- (اختياري) طباعة قوس المكبس حقنه مزدوجة.
- آلة هيكل الصك متعدد الطبقات من ¾ "ألواح اﻷكريليك وتجميع (انظر ملفات تكميلية 1-5).
- ربط طبقات هيكل الصك جنبا إلى جنب مع البراغي عرافة M5 وإضافة أقدام مطاطية للقاعدة.
- تكوين جهاز كمبيوتر واحد مع نظام التشغيل غنو/لينكس راسببيان 8.0 (جيسي) (استناداً إلى لينكس ديبيان).
ملاحظة: تتوفر برامج لتشغيل الأداة عند الطلب. أداة برنامج شفرة المصدر متاحة عند الطلب. عند تلقي ملف من نوع zip، تحميل كافة التبعيات المحددة في الملف التمهيدي. ويشمل هذا البرنامج واجهة مستخدم الرسومية بسيطة التي تمكن من السيطرة على أداة عملية، بما في ذلك معلمات التشغيل الأساسية (سرعة موتور، الاتجاه، إلخ). يتم تشجيع المستخدمين على التوسع في التعليمات البرمجية المصدر موجود والبرنامج وحدات مخصصة مصممة خصيصا لاستخدامها في التجارب الخاصة بهم. جميع البرامج تمت كتابته باستخدام بيثون 2.7.12، وهو غير متوافق حاليا مع بيثون 3. وتستخدم RPi، بيكوبورجريف، وكيفي، ووحدات المعالجة. الملف التمهيدي يحتوي على معلومات مفصلة بشأن ترخيص توزيع البرنامج. - قم بتثبيت 24 V نحي العاصمة المحرك (الشكل 5A) والشرائح الدقيقة (4.5 "(114.3 مم) السكتة الدماغية؛ المسمار 1.27 ملم يؤدي) (الشكل 5).
ملاحظة: المحرك V DC 24 المستخدمة هنا له دورة في الدقيقةكحد أقصى، أناكحد أقصى، وعزم الدوران الكامل-تحميل 4,252 لفة في الدقيقة، 4.83 A، و ~0.2 N * m، على التوالي.- (اختياري) ضع الحشو تحت المحرك لإخماد الاهتزاز أثناء العملية.
ملاحظة: من المستحسن أن يتم قطع وسادة مطاطية سميكة 2-3 مم تناسب أبعاد قاعدة صك النقل الحركي. - جبل الشريحة الدقة إلى قاعدة الصك.
- إزالة الخيوط قضيب مؤقتاً.
- جبل شريحة باستخدام آلة المسمارين #8-32 شقة.
- المملون موتور DC جبل لشريحة الدقة باستخدام المسمار شعاع اقتران (1-1/4 "طول) تحتوي على 6/16" وقطرها 1/4 ".
ملاحظة: اعتماداً على سمك اﻷكريليك المستخدمة في آلة طبقات قاعدة الصك، يلزم الحشوات إلى مستوى مهاوي الشريحة الحركية والدقة.
- (اختياري) ضع الحشو تحت المحرك لإخماد الاهتزاز أثناء العملية.
- تجميع منصة الطرد من لوحات معدنية وأقواس زاوية على شكل L (الشكل 5). جبل معادن منصة لمنصة انزلاق (ترفق بقضيب الخيوط) باستخدام مسامير #6-32. انظر التخطيطي الشريحة الدقة التي توفرها الشركة المصنعة للحصول على تفاصيل بشأن القيود المتزايدة.
- تجميع حقنه طرد إعداد النظام.
- إرفاق كتل وسادة الحركة الخطية (تركيب منصات + تأثير الحركة الخطية) على M8 مطلي بالكروم الفولاذ المقاوم للصدأ القضبان (القضبان الفولاذية موازية يمكن سهولة ملاحظة في الشكل 5).
- مؤشر ترابط القضبان من خلال القضبان دليل الدعم وتأمين رمح الخطية. استخدم ثلاثة أدلة للسكك الحديدية. جبل سراج الدين الأجزاء 1 و 2 على كتل وسادة استخدام مسامير آلة M4.
- الانضمام إلى سراج الدين الأجزاء 1 و 2 مع M8 عرافة البراغي فضفاضة. تكوين المساحة بين سراج الدين الجزء 1 و 2 مع ضغط حلزونية الينابيع تغطي كل الترباس التي تم تأمينها بين اثنين إلى الداخل التي تواجه النايلون البطانات (انظر الشكل 5F). جبل هذه البطانات في الخارج سراج الدين الجزء 1 والجزء 2 من سراج الدين.
- أسلاك الدائرة (انظر الشكل 6 الرسم التخطيطي الأسلاك الأساسية)
- قم بتوصيل وحدة تحكم المحرك I2C/حزب العمل الديمقراطي، 3.3 V، ودبابيس GND على الكمبيوتر مجلس واحد.
- الاتصال الطرفية موتور DC M-و M + كتل المجلس وحدة تحكم المحرك. الاتصال 24 الخامس، 2.5 بالتيار الكهربائي (الشكل 5B) إلى كتل V + و GND لوحدة تحكم المحرك (هو المغطى التحكم في مربع إلكترونيات بسيطة في التصميم النهائي، انظر الشكل 5 ح).
- قم بتوصيل أطراف 3V3 و 5V الهيئة لمراقبة السيارات دبابيس كل منهما على الكمبيوتر مجلس واحد. قم بتوصيل حزب العمل الديمقراطي و SCL دبابيس لوحدة تحكم المحرك دبابيس 3 و 5 من الكمبيوتر مجلس واحد، على التوالي.
ملاحظة: يتم إصدار الأوامر إلى العاصمة المحرك من الكمبيوتر مجلس واحد من خلال وحدة تحكم محرك. سرعة موتور يسيطر عليه تنظيم الجهد عبر محطات السيارات عن طريق عرض الذبذبات. في هذا الإعداد، الحد الأقصى الحالي من خلال تشغيل المحرك V DC 24 (الكامل-تحميل التيار: 4.83 A) يقتصر على 2.5 ألف من إمدادات الطاقة الخامس 24. من المستحسن أن سلكية على حلبة السيارات من خلال إغلاق عادة (NC) طوارئ وقف (الشكل 5 ياء). القيام بذلك يوفر وسيلة لعرقلة على حلبة السيارات لتمكين عملية إيقاف تشغيل طارئة أساسية. - الاتصال الأمامي والخلفي قرب تحت الحمراء أجهزة الاستشعار (المسافة الرقمية أجهزة الاستشعار، 5I الشكل) بدبابيس جبيو RPi 24 و 23 على التوالي.
- مسار الأسلاك الاستشعار من خلال قنوات في قاعدة الصك.
ملاحظة: أجهزة استشعار الأشعة تحت الحمراء عدم الاتصال فاصل-شعاع أجهزة استشعار الحركة بالكشف عن مجموعة من 2-10 سم. - 4.7.4.2 المفاجئة أجهزة استشعار الأشعة تحت الحمراء السلكية ضمن أقواس طباعة 3D استشعار الأشعة تحت الحمراء (الشكل 5I، مربعات سوداء) وجبل على قاعدة الصك. عند تعيين بشكل صحيح في القوس، وجه استشعار ينبغي أن تبرز إلى الخارج من 14 مم × 7 مم مستطيلة افتتاح القوس.
ملاحظة: هذه الأقواس الاستشعار يمكن مؤقتاً تركيبة استخدام Velcro أو مادة لاصقة (تصاعد مؤقت مفيد بشكل مناسب تعديل وتحسين وضع جهاز استشعار الأشعة تحت الحمراء). بدلاً من ذلك، تحميل بشكل دائم بحفر ثقوب دليل صغير في قاعدة الصك وتأمين الأقواس مع مسامير M2.
- مسار الأسلاك الاستشعار من خلال قنوات في قاعدة الصك.
- توصيل شاشة تعمل بلمس شاشات الكريستال السائل 7 "5V، GND، وعرضها دبابيس واجهة تسلسلية (الطبري) من الكمبيوتر مجلس واحد. 7 "RPi وشاشات الكريستال السائل عرض الجمعية ويرد في الشكل 5.
5-افتعال بوليميرسوميس عبر تزعمت استخدام مضخة الحقن عالية السرعة مصنوعة خصيصا
- (الخيار 1) استخدام الوضع التلقائي تشغيل.
- حدد " تشغيل تلقائي " من القائمة الرئيسية. سيقوم النظام بطلب المستخدمين للسماح للمحرك لوضع منهاج طرد حقنه إلى بداية الشريحة الدقة تلقائياً. تأكد من أن المسار أمام وخلف لوحة معدنية واضحة قبل الشروع.
- تحميل 1 مل المحاقن البلاستيكية كما هو موضح في المقطع 2.5 والمحاقن جبل على الموصلات اللوير الإناث من خلاط CIJ. تحميل خلاط CIJ (مع المحاقن المرفقة) في افتتاح مستطيلة بنقل طرد الخلفي (انظر الشكل 5E).
- تعيين سرعة المحرك المطلوب (وحدات: لفة في الدقيقة) باستخدام شريط التمرير في واجهة المستخدم الرسومية (انظر الملاحظة أدناه للاعتبارات الهامة). سرعة موتور الأمثل سوف تعتمد على ضخ محددة والإعداد ولكن يجب ضمان معدل تدفق على الأقل 1 مل/s لإبعاد قناة خلاط CIJ المقدمة هنا.
ملاحظة: النظر في المسائل التالية أثناء إعداد معدل التدفق. في التكوين الرأسي تزعمت تعمل باليد، كواشف مختبر يطردون من المحاقن بمعدل مل ~ 1/s، ولكن يمكن أن يكون متغير جداً عندما باليد. وهذا هو ببساطة معدل التدفق من خلال فوهة المحقن، الذي تسيطر عليه المعدل الذي تقدم المستخدم المكبس المحاقن. علما بأن معدل 1 مل/ثانية عدم الإشارة إلى معدل تدفق الخروج من فوهة قطرها أصغر. في ما ورد أعلاه تحديد أبعاد القناة، مل ~ 1/ينبغي الإبقاء على s للتأكد من العدد رينولد المناسبة ل خلط مضطربة10. ويمكن استخدام معدلات تدفق مختلف ما دامت قطر القناة تبعاً للحفاظ على رقم رينولد يدعم الأوضاع المضطربة. بلونجيرس حقنه متقدمة بصفيحة معدنية عمودي، التحركات على طول شريحة ألمنيوم عالية الدقة بالإضافة إلى 24 ت نحي موتور DC. في هذا التكوين، ومعدل التدفق الأقصى للبرميل يتأثر بعدد من العوامل، بما في ذلك (1) أقصى سرعة موتور (4,252 لفة في الدقيقة) وقيادة المسمار الدقة الشريحة (1.27 مم) الذي يقترن بالمحرك رمح (2) عزم الدوران للمحرك (~0.2 N * m لكامل-l أقام عزم الدوران)، الذي يلزم للتغلب على المقاومة لتدفق المساهمات الضغط الخلفي (3) من دخول السوائل والخروج من خلاط CIJ، و (4) قوة المحاقن المستخدمة (المستخدمين ينبغي أن تضع في اعتبارها القوى الحقن، واستخدام المحاقن من القوة المناسبة). وفيما يتعلق بالنقطة (2)، عند زيادة تدفق معدل كافية عزم الدوران المطلوب لتجنب توقف المحرك مع الحفاظ على طرد مطرد تحت زيادة الضغط الخلفي. معدلات تدفق البرميل – توضيح تدفق البرميل سعر أن النظام المذكور آنفا يمكن تحقيق، والنظر في القضية حيث تزعمت تتم باستخدام كواشف مختبر تم تحميلها في اثنين واحد-المليلتر المحاقن. يجب أن تقدم معدل من خلال البرميل، المحرك تحقيق تدفق مل/s 1 لوحة معدنية المسافة التي تحددها طول المكبس (~ 68 ملم لحقنه مل واحد نموذجي) في ثانية واحدة. شريطة أن يؤدي المسمار 1.27 ملم من الشرائح الدقيقة، وبالتالي أن محرك DC التشغيل 4,252 لفة في الدقيقة القادرة على النهوض المنصة يصل إلى ~ 90 ملم/s (رؤ 71/s * 1.27 مم/rev). هذا يتوافق مع معدل تدفق برميل ~1.3 مل/s، والذي يتجاوز المعدل المستهدف 1 مل/s. - قبل تشغيل الأداة، التحقق من نظام لضمان أن المسار المنهاج الواضح من العراقيل، وأجهزة الأشعة تحت الحمراء قرب كشف الأمامية والخلفية واضحة من العوائق (أجهزة استشعار الأشعة تحت الحمراء هي المربعات السوداء الصغيرة قرب الشريحة الدقة المحطات؛ انظر 5I الشكل). أيضا التأكد من أن يتم توجيه مأخذ أنابيب شعرية من خلاط CIJ في حاوية جمع مناسب (مثلاً: زجاج الكأس، إلخ).
- لطرد كواشف مختبر من المحاقن وخالط CIJ، اضغط على زر تشغيل في واجهة البرنامج.
- (الخيار 2) استخدام وضع التشغيل اليدوي. تشير إلى اتجاهات وضع تشغيل السيارات المذكورة أعلاه وملاحظة التغيير التالي خطوة 5.1.5: اضغط الزر الأمام الضغط بشكل مستمر من خلال انتهاء التشغيل (أي المنهاج السلف في الاستجابة إلى حدث في الصحافة، والمحرك سيتم إيقاف استجابة لحدث في الإصدار).
- (الخيار 3) استخدام منصة دليل المواقع الوضع؛ هذا الوضع يسمح للمستخدمين بوضع منهاج العمل عن طريق تشغيل المحرك على سرعة منخفضة (20% طاقة) ردا على الأزرار الأمامية والعكسية على واجهة البرنامج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وهنا، وقد قدمنا بروتوكول بسيط لصياغة نانوكاريرس قادرة على تحميل الشحنات ماء ومسعور الآمنة للماوس في فيفو والرئيسيات غير البشرية الإدارة11،13. كما أدرجنا بروتوكول مفصل لتركيب البوليمر المستخدمة في نتائج تمثيلية، جنبا إلى جنب مع وصف لتصنيع أداة مخصصة لاصطدام تسيطر عليها ميكانيكيا للحلول في خلاط CIJ. ويقدم الشكل 1 لمحة عامة عن الخطوات التوليف التي تؤدي إلى إنتاج شماعة17-bl-PPS35-ش، كوبوليمر ديبلوك المستخدمة لتجميع ذاتي نانوكاريرس بوليميرسومي. لمحة عامة عن البروتوكول تزعمت لتجميع بوليميرسوميس شماعة-bl-PPS محملة بالتداوي و/أو وكلاء التصوير هو دياجراميد في الشكل 2. وقد تمس البوليمر في خلاط CIJ (التخطيطي هو موضح في الشكل 3 ألف، وصف أصلاً في 10) لتشكيل بوليميرسوميس مونوديسبيرسي مورفولوجية الإجمالية، التي يمكن أن يصادق عليها الضوء الحيوي (DLS) نثر والمبردة مجهر إلكتروني (كريوتيم) (الشكل 3b-3 ج). بوليميرسوميس التي شكلتها تزعمت يصبح أصغر (3d الشكل) وأكثر مونوديسبيرسي (رقم 3e) مع إيمبينجيمينتس اللاحقة، وقد تكون محملة بالبضائع ماء ومسعور (مثلاً، هل محبتين صبغ، جزيء صغير التداوي، والبروتين إلخ؛ الشكل 4a). نانوكاريرس التي تشكلت تحت ظروف معقمة المذكورة أعلاه هي الذيفان مجاناً بفحوصات الذيفان الأزرق الخام وال وهكذا مناسبة لمجموعة واسعة من التطبيقات في المختبر و في فيفو (الشكل 4 باء، المعطيات غير معروضة).
وأخيراً، أننا قد تصمم وتبني صك ميكانيكيا-التحكم بمعدل تدفق واصطدام الناتجة من الحلول في خلاط CIJ (الشكل 5). إنشاء هذا الصك ضروري، كما مضخات الحقن المتاحة تجارياً لا يمكن تحقيق معدلات التدفق اللازمة للأغذية. باستثناء التعديلات المخصصة، قد المتاحة تجارياً المحاقن مضخات السرعة القيود المفروضة باستخدامهم للسرعة المنخفضة السائر المحركات، التي صممت موثوق بها الاستغناء عن السوائل بطريقة بطيئة ومطردة. ويسيطر طرد مادة التفاعل في الصك، شريحة دقة تحت سيطرة 24 V نحي موتور DC، التي يمكن أن تحقق الكثير بسرعة أكبر (4,252 لفة في الدقيقة) من المحركات السائر البطيء في مضخات الحقن التجارية. يتم استخدام البرمجيات المخصصة التي قيد التشغيل على جهاز كمبيوتر واحد في مجلس على تشغيل الأجهزة (الشكل 6). وقد قدمت الرسومات 2D بالإضافة إلى نماذج ثلاثية الأبعاد من الأجزاء. جميع رسومات ونماذج تم إنشاؤها في فريكاد (برمجيات المصدر المفتوح بارامتريه 3D CAD النمذجة) لضمان الوصول للغاية لمجتمع البحث. كتب البرمجيات لتشغيل الأداة في بايثون 2.7.12، مما يسمح للتطور السريع للإجراءات تزعمت مخصصة لضمان إنتاج ملائمة نانوكاريرس (الحجم، مورفولوجيا، إلخ). سوف تتاح البرامج لتعمل الصك عند الطلب. المستخدمين وينبغي ملاحظة أن البرنامج غير متوافق حاليا مع بيثون 3؛ ولكن هذا قد يتغير في المستقبل التحديثات. بالتحكم في معدل طرد مادة التفاعل، يلغي هذا الصك المتغير للخطأ البشري من ناحية عملية.
رقم 1. مخطط توليف لتوليف شماعة17-bl-الصحفي36-الشيخ الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. الإنتاج من بوليميرسوميس عن طريق تزعمت في خلاط CIJ يحركها اليد. مخطط لتشكيل بوليميرسوميس استخدام تزعمت. بوليمر شماعة-bl-ذكر المكتب الصحفي يذوب في المذيبات العضوية جنبا إلى جنب مع البضائع مسعور، وهي تمس ضد المذيبات المائية مع البضائع ماء المذاب. خلط سريع يحدث داخل خلاط CIJ، ويمكن أن تمس أو السماح بإكمال عملية تشكيل من خلال تمييع في مستودع للمذيبات المائية efflux مرارا وتكرارا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. وصف بوليميرسوميس التي تزعمت شكلها. (أ) التصميم تخطيطي خلاط CIJ المستخدمة في هذه الدراسة. كل القياسات بالمليمترات. (ب) حجم توزيع بوليميرسوميس التي تزعمت شكلتها بعد إيمبينجيمينتس 1 و 5، مقيسة بدائرة الأراضي والمساحة. n = 6 تركيبات، يعني عينات من رسوم بيانية. (ج) تشكيل الصور كريوتيم مثلاً من بوليميرسوميس بعد إيمبينجيمينتس 1 و 5 من خلال خلاط CIJ، مقياس بار = 100 نانومتر. القطر (د) و polydispersity الفهرس (ه) من بوليميرسوميس التي شكلتها تزعمت، يقاس بدائرة الأراضي والمساحة. للمقارنة، شكلتها بوليميرسوميس الإماهة رقيقة، مع (TF-E) أو بدون قذف اللاحقة (TF-شمال شرق)، شكلتها تشتت المذيبات (SD)، كما يقاس، n = 3، أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. سوبفيجوريس (ج)-(ﻫ) أخذ بإذن من ألن et al. 11- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. تحميل وصف الكفاءة والذيفان. (أ) تحميل الكفاءة الصغيرة والجزيئات داخل بوليميرسوميس، n = 3، أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. (ب) "لبس الأزرق" الخام المقايسة من بوليميرسوميس التي شكلتها تزعمت العقيمة، n = 6، أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5. أداة لمراقبة الميكانيكية اصطدام الحل في خلاط CIJ. (أ) 24 V نحي موتور DC. (ب) الطاقة إمداد (24 ت، 2.5 A). (ج) دقة السكتة الدماغية 4.5 "الشريحة مع الرصاص المسمار 1.27 ملم (متصلة برمح السيارات باقتران شعاع المسمار). (د) الطرد منصة مكونة من ألواح معدنية مستطيلة ولام على شكل أقواس زاوية. (ﻫ) خلاط CIJ. (و) نقل الطرد. (ز) مجلس واحد الكمبيوتر و 7 "لمس. (ح) مجلس مراقبة مطر المغطى في الإسكان بلاستيكية (83 ملم × 53 ملم × 35 ملم). (ط) الأشعة تحت الحمراء أجهزة الاستشعار (أجهزة استشعار الحركة عدم الاتصال فاصل-شعاع). (ي) زر الإيقاف الطوارئ (NC). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6. مخطط الأسلاك الأساسية- يتم عرض الاتصالات الأولية بين الكمبيوتر مجلس واحد والتحكم بالسيارات، وأجهزة استشعار الأشعة تحت الحمراء. لا يتم عرض اتصالات تعمل باللمس شاشات الكريستال السائل هنا، كما هذا المكون غير الضرورية (يمكن للمستخدمين اختيار لاستخدام جهاز كمبيوتر قياسية والماوس بدلاً من ذلك). لاحظ أن في التكوين المعروضة، 24 الخامس موتور التيار الكهربائي وإمدادات الطاقة الكمبيوتر مجلس واحد منفصلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقدمنا الإرشادات التفصيلية لتلفيق السريع من بوليميرسوميس استخدام شماعة17-bl-PPS35-ش كوبوليمر ديبلوك. بوليميرسوميس حويصلية هي مورفولوجية الإجمالية الأولية المجتمعون في هذه النسبة شماعة ماء والوزن الجزيئي كتلة الصحفي مسعور. عندما تمس عدة مرات، لديهم قطره و polydispersity يطابق بوليميرسوميس مقذوف من خلال غشاء شمال البحر الأبيض المتوسط 200 بعد أن شكلت عبر ترطيب رقيقة. هذا البروتوكول وبالتالي يلغي الحاجة إلى خطوات إضافية قذف أثناء تصنيع مونوديسبيرسي بوليميرسومي نانوكاريرس. بوليميرسوميس تشكلت عبر تزعمت تحميل البضائع على حد سواء ماء ومسعور، والحفاظ على بيواكتيفيتي تلك الجزيئات من خلال عملية صياغة11. البروتوكولات الإضافية موصوفة لضمان العقم عند الضرورة، السماح بتكوين تركيبات بوليميرسومي التي خالية من الذيفان، وبالتالي مناسبة لفحوصات الكيمياء الحيوية والمناعية، فضلا عن آمنة للإدارة الحية . خلاط CIJ تعمل باليد بسيطة لإعداد وتوفير سهولة الاستخدام للمستخدم، ولكن تطرح قضايا مراقبة الجودة المحتملة بسبب تقلب المستخدم. للحفاظ على اتساق تدفق، سعينا إلى إنشاء أداة قادرة على تحقيق وتكاثر الحفاظ على معدل تدفق قابلة لمقارنة. الأهم من ذلك، على ما ورد أعلاه تحديد أبعاد القناة، ومضخات الحقن تجارية لا يمكن تحقيق معدلات تدفق عالية بما فيه الكفاية (~ 1 مل/s) بسبب يجري مجهزة بسرعة منخفضة السائر المحركات. لمكافحة هذه المشكلة، وتحمل قدر أكبر من التحكم في معدل التدفق، وقد وصفت تصنيع مضخة الحقن عالية السرعة للأغذية. وكان الحرص على الاستفادة من المصدر المفتوح والبرمجيات بسهولة للتخصيص لنظام التشغيل والتعليمات البرمجية.
السيطرة على معدلات التدفق البديل يوفر القدرة على ضبط صياغة nanocarrier ويوفر الفرص لمواصلة استكشاف جمعية مورفولوجيس nanocarrier المتنوعة. عدد رينولدز وما يقابلها من خلط الوقت أبدى سابقا تأثير حجم نانوكاريرس النواة الصلبة التي تشكلت عبر تزعمت9، ولكن ليس من الواضح مدى تأثير ذلك على تكوين بوليميرسوميس. هذا موضوع التحقيق الحالية، مع المعدل الحالي للموصى بها 0.5 إلى 2 مل/ثانية، مع نتائج تمثيلية المؤداة في حوالي 1 مل/ثانية. أبعد من ذلك، زيادة السيطرة على معدل التدفق قد يكون ضروريا لتحل محل نظام التشغيل Linux-تعتمد مع السيطرة في الوقت الحقيقي على المحرك مضخة الحقن.
وبصرف النظر عن ضبط معدل تدفق، هناك عدد من الطرق يمكن تعديل هذا البروتوكول تزعمت للاحتياجات الخاصة بجناح أو التطبيقات. ويمكن استخدام كميات أصغر أو أكبر من البوليمر. وقد استخدمت تركيزات منخفضة تصل إلى 1 مغ/مل وتصل إلى 100 مغ/مل لتشكيل نانوكاريرس مستقرة. ويمكن استخدام وحدات تخزين أكبر لاصطدام، على الرغم من أن التطبيق المتسق للضغط أثناء تحركها ناحية تزعمت أكثر صعوبة في وحدات تخزين أكبر من 1 مل كل حقنه. ويمكن أيضا تعديل حجم الخزان. النهائي العضوية: نسب المذيبات المائية أكبر من 1:3 قد ينتج عن عدم اكتمال تشكيل نانوكاريرس، وعلى هذا النحو ينبغي الحرص على عدم انخفاض حجم الخزان دون تأكيد تشكيل نانوكاريرس. التجميع قد تحدث عند محاولة تحميل تركيزات عالية من الشحنات مسعور، التي يمكن تخفيفها عن طريق زيادة نسبة المولى البوليمر: الشحن عموما.
افتح موضوعا إضافيا للاستكشاف هو التوسع في تشكيل بوليميرسومي تزعمت تشمل أنظمة البوليمر الأخرى خارج شماعة-bl-لالصحفي. وفي الواقع، استخدمت نظم أخرى سابقا في تشكيل المذيلات والمخدرات النواة الصلبة نانوكاريرس16،17. ومع ذلك، هو ليس من الواضح إذا كان هناك مجموعة من المعلمات التي يمكن أن يؤدي إلى تشكيل بوليميرسوميس عبر تزعمت استخدام تلك النظم البوليمر الأخرى. ونظرا للعدد من المتغيرات المحتملة لاستكشاف، فمن الممكن تماما أن البوليمرات الأخرى يمكن أن تشكل بوليميرسوميس أو أخرى نانوارتشيتيكتوريس الناعمة عبر تزعمت مع معلمات التجريبية المعدلة، مثل معدل التدفق، درجة الحرارة، واختيار المذيبات و تركيز البوليمر.
كما مع جميع تقنيات الصياغة، توجد قيود على تزعمت والقيود التي قد تجعل بعض التطبيقات لا يمكن الدفاع عنه. عملية خلط السريع يتطلب أن المذيبات العضوية والمائية أن الامتزاج، مما يحول دون استخدام بعض المذيبات الشائعة المستخدمة لحل العديد من البوليمرات الإسهامية ديبلوك، مثل الميثان وكلوروفورم. بعض البوليمرات قد ولذلك يكون تقديم متوافق مع تزعمت إذا لم تكن قادرة على حلها في المذيبات عضوية مياه الامتزاج. ويستخدم البروتوكول تزعمت الموصوفة هنا بنسبة 1:1 للعضوية للمذيبات المائية، التي قد تؤدي إلى خفض مستوى نشاط حمولات الحساسة لتركيزات عالية من المذيبات العضوية، مثل بعض البروتينات النشطة بيولوجيا. من الجدير أن التأثيرات على بيواكتيفيتي سوف يعتمد على البروتين، كما أننا وجدنا سابقا الحد الأدنى من الآثار على النشاط الأنزيمي الفوسفاتيز القلوية بعد تحميل داخل بوليميرسوميس التي تزعمت11. هي دوامة مدخل متعدد خلاطات18 منصة تزعمت أكثر تكلفة ولكن أكثر للتخصيص توفر تحكم إضافي في نسبة العضوية للمذيبات المائية، تقديم بديل تنوعاً خلاطات CIJ لهذه السياقات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
نعترف بالموظفين والأجهزة الدعم من "مرفق الأحياء الهيكلية" في جامعة نورث وسترن. من المسلم به الدعم من الصحة الإنجابية لوري شاملة سرطان مركز من جامعة "نورث ويسترن" ومرافق الجامعة الهيكلية علم الأحياء الشمالية الغربية. كاشف الإلكترون مباشرة K2 غاتان تم شراؤها بأموال مقدمة من "اتحاد الطب الحيوي في شيكاغو" بدعم من "أموال سيرل" في "ثقة المجتمع شيكاغو". ونشكر أيضا المرافق التالية في جامعة نورث وسترن: كيك متعدد التخصصات سطح العلم المرفق ومرفق الأحياء الهيكلية، مرفق التصوير البيولوجي، مركز "متقدم التصوير الجزيئي"، والتحليلي بيونانوتيتشنولوجي المعدات الأساسية. وأيد هذا البحث منح "المؤسسة الوطنية للعلوم" 1453576، المعاهد الوطنية للصحة المدير "الجديد المبتكر جائزة" 1DP2HL132390-01، مركز التجدد لطب النانوي محفز وجائزة 2014 ماكورميك محفز. وأيد حزب العمل الديمقراطي في الجزء التدريب التكنولوجيا الأحيائية بريدوكتورال المعاهد الوطنية للصحة منحة T32GM008449.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate Starter Kit - 32 GB Edition | CanaKit | UPC 682710991511 | |
| Linear Bearing Platform (Small) - 8mm Diameter | Adafruit | 1179 | |
| Linear Motion 8 mm Shaft, 330 mm Length, Chrome Plated, Case Hardened, Metric | VXB | kit11868 | |
| Linear Rail Shaft Guide/Support - 8 mm Diameter | Adafruit | 1182 | |
| Manual-Position Precision Slide 4.5" Stroke, 15 lb load capacity | McMaster-Carr | 5236A16 | |
| MTPM-P10-1JK43 Iron Horse DC motor | Iron Horse | MTPM-P10-1JK43 | |
| Official Raspberry Pi Foundation 7" Touchscreen LCD Display | Raspberry Pi | B0153R2A9I (ASIN) | |
| PicoBorg Reverse - Advanced motor control for Raspberry Pi | PiBorg | BURN-0011 | |
| Pololu Carrier with Sharp GP2Y0D810Z0F Digital Distance Sensor 10cm | Pololu | 1134 | |
| Ruland PSR16-5-4-A Set Screw Beam Coupling, Polished Aluminum, Inch, 5/16" Bore A Diameter, 1/4" Bore B Diameter, 1" OD, 1-1/4" Length, 44 lb-in Nominal Torque | Ruland | PSR16-5-4-A | |
| Polyethylene glycol monomethyl ether | Sigma Aldrich | 202495 | |
| Methanesulfonyl chloride | Sigma Aldrich | 471259 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 179418 | |
| Toluene, Anhydrous | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | |
| Celite 545 (Diatomaceous Earth) | Sigma Aldrich | 419931 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 320269 | |
| Diethyl ether | Sigma Aldrich | 296082 | |
| N,N-Dimethylformamide, anhydrous | Sigma Aldrich | 227056 | |
| Potassium carbonate | Sigma Aldrich | 791776 | |
| Thioacetic acid | Sigma Aldrich | T30805 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma Aldrich | 360589 | |
| Aluminum oxide, neutral, activated, Brockmann I | Sigma Aldrich | 199974 | |
| Sodium methoxide solution, 0.5 M in methanol | Sigma Aldrich | 403067 | |
| Propylene sulfide | Sigma Aldrich | P53209 | |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 320390 | |
| Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma Aldrich | S2770 | |
| Endotoxin-free water | GE Healthcare Life Sciences | SH30529.01 | |
| Paper pH strips | Fisher Scientific | 13-640-508 | |
| Endotoxin-free Dulbecco's PBS | Sigma Aldrich | TMS-012 | |
| Borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| 1 mL all-plastic syringe | Thermo Scientific | S75101 | |
| Sepharose CL-6B | Sigma Aldrich | CL6B200 | |
| Liquid chromatography column | Sigma Aldrich | C4169 | |
| CIJ mixer, HDPE | Custom | ||
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma Aldrich | 216763 | |
| HEK-Blue hTLR4 | InvivoGen | hkb-htlr4 | |
| RAW-Blue Cells | InvivoGen | raw-sp | |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | |
| PYROGENT Gel Clot LAL Assays | Lonza | N183-125 |
References
- Stano, A., Scott, E. A., Dane, K. Y., Swartz, M. A., Hubbell, J. A. Tunable T cell immunity towards a protein antigen using polymersomes vs. solid-core nanoparticles. Biomaterials. 34 (17), 4339-4346 (2013).
- Discher, B. M., et al. Polymersomes: tough vesicles made from diblock copolymers. Science. 284 (5417), 1143-1146 (1999).
- Vasdekis, A. E., Scott, E. A., O'Neil, C. P., Psaltis, D., Hubbell, J. A. Precision intracellular delivery based on optofluidic polymersome rupture. ACS Nano. 6 (9), 7850-7857 (2012).
- Yi, S., et al. Tailoring Nanostructure Morphology for Enhanced Targeting of Dendritic Cells in Atherosclerosis. ACS Nano. 10 (12), 11290-11303 (2016).
- Shum, H. C., Kim, J. W., Weitz, D. A. Microfluidic fabrication of monodisperse biocompatible and biodegradable polymersomes with controlled permeability. Journal of the American Chemical Society. 130 (29), 9543-9549 (2008).
- Pessi, J., et al. Microfluidics-assisted engineering of polymeric microcapsules with high encapsulation efficiency for protein drug delivery. International Journal of Pharmaceutics. 472 (1-2), 82-87 (2014).
- O'Neil, C. P., Suzuki, T., Demurtas, D., Finka, A., Hubbell, J. A. A novel method for the encapsulation of biomolecules into polymersomes via direct hydration. Langmuir. 25 (16), 9025-9029 (2009).
- Saad, W. S., Prud'homme, R. K. Principles of nanoparticle formation by flash nanoprecipitation. Nano Today. 11 (2), 212-227 (2016).
- Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Mechanism for rapid self-assembly of block copolymer nanoparticles. Physical Review Letters. 91 (11), 118302 (2003).
- Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).
- Allen, S., Osorio, O., Liu, Y. G., Scott, E. Facile assembly and loading of theranostic polymersomes via multi-impingement flash nanoprecipitation. Journal of Controlled Release. 262, 91-103 (2017).
- Bobbala, S., Allen, S. D., Scott, E. A. Flash nanoprecipitation permits versatile assembly and loading of polymeric bicontinuous cubic nanospheres. Nanoscale. 10 (11), 5078-5088 (2018).
- Allen, S. D., et al. Polymersomes scalably fabricated via flash nanoprecipitation are non-toxic in non-human primates and associate with leukocytes in the spleen and kidney following intravenous administration. Nano Research. , (2018).
- Karabin, N. B., et al. Sustained micellar delivery via inducible transitions in nanostructure morphology. Nature Communications. 9 (1), 624 (2018).
- Mascoli, C. C., Weary, M. E. Limulus amebocyte lysate (LAL) test for detecting pyrogens in parenteral injectable products and medical devices: advantages to manufacturers and regulatory officials. Journal of the Parenteral Drug Association. 33 (2), 81-95 (1979).
- Pustulka, K. M., et al. Flash nanoprecipitation: particle structure and stability. Molecular Pharmaceutics. 10 (11), 4367-4377 (2013).
- Tang, C., Amin, D., Messersmith, P. B., Anthony, J. E., Prud'homme, R. K. Polymer directed self-assembly of pH-responsive antioxidant nanoparticles. Langmuir. 31 (12), 3612-3620 (2015).
- Gindy, M. E., Panagiotopoulos, A. Z., Prud'homme, R. K. Composite block copolymer stabilized nanoparticles: simultaneous encapsulation of organic actives and inorganic nanostructures. Langmuir. 24 (1), 83-90 (2008).
