Summary
Nanomaterial tillhandahålla mångsidiga mekanismer av kontrollerad terapeutiska leverans för både grundforskning och translationell applikationer, men deras tillverkning ofta kräver expertis som är tillgänglig i de flesta biomedicinska laboratorier. Här presenterar vi protokoll för skalbara fabrication och terapeutiska lastning av olika själv monterade nanocarriers använder flash nanoprecipitation.
Abstract
Nanomaterial presenterar ett brett utbud av alternativ för att anpassa den kontrollerade leveransen av enkel- och kombinerade molekylär nyttolaster för terapeutiska och tänkbar program. Detta ökade specificitet kan ha betydande kliniska konsekvenser, inklusive minskade biverkningar och lägre doser med högre potens. Dessutom kan den i situ inriktning och kontrollerade modulering av viss cell undergrupper förbättra in vitro och i vivo utredningar av grundläggande biologiska fenomen och sond cellernas funktion. Tyvärr, den erforderliga sakkunskapen i nanoskala naturvetenskap, kemi och teknik ofta förbjuder laboratorier utan erfarenhet i dessa fält tillverka och anpassa nanomaterial som verktyg för sina undersökningar eller fordon för deras terapeutiska strategier. Här tillhandahåller vi protokoll för syntes och skalbar montering av en mångsidig giftfri block sampolymer system mottagliga för facile bildandet och lastning av nanoskala fordon för biomedicinska tillämpningar. Flash nanoprecipitation presenteras som en metod för snabb tillverkning av olika nanocarriers från poly(ethylene glycol) -bl-poly (propylen svavelväte) sampolymerer. Dessa protokoll kommer tillåta laboratorier med ett brett utbud av expertis och resurser för att lätt och reproducibly tillverka avancerade nanocarrier leveranssystem för sina program. Design och konstruktion av ett automatiserade instrument som sysselsätter en höghastighets sprutpumpen att underlätta den flash nanoprecipitation bearbeta och för att möjliggöra förbättrad kontroll över homogenitet, storlek, morfologi och lastning av polymersome nanocarriers är beskrivs.
Introduction
Nanocarriers möjliggör den kontrollerade leveransen av små och makromolekylär Last, inklusive aktiva entiteter som, om inte inkapslad, skulle vara antingen mycket nedbrytbara eller alltför hydrofoba för administration i vivo. Av de nanocarrier morfologier regelbundet fabricerade, erbjuder polymera blåsor analogt med liposomer (även kallad polymersomes) möjligheten att samtidigt Ladda hydrofil och hydrofoba Last1,2. Trots deras lovande fördelar är polymersomes fortfarande sällsynt i kliniska tillämpningar, delvis flera viktiga utmaningar i sin tillverkning. För klinisk användning behöver polymersome formuleringar göras i storskaliga, steril och konsekvent partier.
Ett antal tekniker kan användas för att bilda polymersomes från en diblock sampolymer, såsom poly(ethylene glycol) -block-poly (propylen svavelväte) (PEG -bl- PPS), som inkluderar solvent dispersion3, tunn film rehydrering1 , 4, mikrofluidik 5,6och direkt återfuktning7. Solvent dispersion innebär långa inkubationstider i närvaro av organiska lösningsmedel, som kan denaturera vissa bioaktiva nyttolaster, som proteiner. Tunn film rehydrering erbjuder inte kontroll över polydispertion av den bildade polymersomes, som ofta kräver dyra och tidskrävande extrudering tekniker för att uppnå acceptabel monodispersity. Dessutom är både microfluids och direkt återfuktning svåra att skala upp för större produktionsvolymer. Av olika nanocarrier fabrication metoder erbjuder flash nanoprecipitation (FNP) möjligheten att göra storskaliga och reproducerbara formuleringar8,9,10. Medan FNP var tidigare reserverat för formulering av solid-core nanopartiklar, vårt labb har nyligen expanderat användningen av FNP att inkludera konsekvent bildandet av olika PEG -bl- PPS nanostruktur morfologier11, 12, inklusive polymersomes11 och bicontinuous nanospheres12. Vi fann att FNP var kan bilda monodisperse formuleringar av polymersomes utan behov av extrudering, vilket resulterar i överlägsen polydispertion indexvärden jämfört med icke-extruderade polymersomes bildas av tunn film rehydrering och solvent dispersion 11. Bicontinuous nanospheres, med sin stora hydrofoba domäner, har inte kunnat bildas av tunn film rehydrering, trots bildar under ett antal lösningsmedel villkor med FNP12.
Här ger vi en detaljerad beskrivning för syntesen av PEG -bl- PPS diblock sampolymer används i polymersome formation, trånga impingement jets (CIJ) mixern används för FNP, FNP protokoll själv, och genomförandet av ett automatiserat system för att minska användaren variabilitet. Här ingår information om hur du sterilisera systemet tillräckligt för att producera endotoxinfria formuleringar för användning i vivooch representativa uppgifter om karakterisering av polymersomes bildas av FNP. Med denna information, kommer läsare med intresse i att utnyttja polymersomes för in vitro- och in-vivo arbete att kunna tillverka egna sterila, monodisperse formuleringar. Läsare med erfarenhet i nanocarrier formuleringar och med polymer syntes expertis kommer att kunna snabbt testa egna polymera system använder FNP som en potentiella alternativ till sin nuvarande formulering-tekniker. De protokoll som beskrivs häri kan dessutom användas som pedagogiska verktyg för utformningen av nanocarriers i nanoteknik laboratorium kurser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sammanfattning av Poly(ethylene glycol) -block-poly (propylen svavelväte)-Thiol
- Syntetisera metoxi-poly(ethylene glycol) mesylat (Mn: 750) (MeO-PEG17-Ms, jag).
- Lös 10 g MeO-PEG17-OH i 200 mL 100% toluen inom en 3-hals rund botten kolv (RBF) under magnetisk omrörning vid 600 rpm.
- Anslut den 3-hals RBF till en Dean-Stark apparatur, sig själv fäst till en kondensor, hålla hela systemet under inert gas, argon eller kväve.
- Placera den 3-hals RBF i oljebad, värme till 165 ° C under omrörning vid 600 rpm.
- Ta bort spår vatten och 100 mL toluen med azeotropisk destillation.
- Ta bort den 3-hals RBF från olja, lossa Dean-Stark apparaten bibehållen inertgas villkor och låt svalna till rumstemperatur.
- Lägga till 5,6 mL 100% trietylamin (3 molar ekv.) och 300 mL vattenfri 100% toluen MeO-PEG17-OH lösning under omrörning vid 600 rpm.
- Flytta den 3-hals RBF till ett isbad, upprätthålla omrörning vid 600 rpm och inert gas villkor.
- Späd 3,1 mL 100% methanesulfonyl klorid (3 molar ekv.) i 30 mL 100% toluen, långsamt lägga till de 3-hals RBF via ett tillägg tratt under omrörning vid 600 rpm.
- Rör över natten vid 600 rpm vid rumstemperatur under inert förhållanden.
- Filtrera lösningen genom ett Buchner tratt packad med kiselgur (se Tabell för material) för att ta bort salter.
- Ta bort toluen via en roterande indunstare med vattenbad inställt på 40 ° C, rotation vid 120 rpm, och tryck in mellan 50-100 millibar.
- Lös åter upp produkten i 200 mL 100% diklormetan (DCM) och filtrera genom en Buchner tratt packad med kiselgur (se Tabell för material).
- Ta bort DCM via en roterande indunstare med vattenbad inställt på 40 ° C, rotation på 120 rpm och trycket inställd på mellan 450-600 millibar.
- Sparsamt åter upplösa produkt i 100% DCM och långsamt fällningen produkt genom att lägga till det droppvis (via Pasteur-pipett) till 500 mL iskallt 100% dietyleter. Upprätthålla omrörning vid 300 rpm.
- Dekantera eller aspirera för att avlägsna dietyletern från utfällda produkt, MeO-PEG17- mesylat, och store övernattning i vakuum exsickator torka helt.
- Använd produkten omedelbart, eller förvara under inert gas vid-20 ° C under flera månader.
- Syntetisera metoxi-poly(ethylene glycol) thioacetate (MeO-PEG17-TA, II).
- Lös upp 5 g av MeO-PEG17-Ms (I) i 200 mL 100% vattenfri dimetylformamid (DMF) i en 3-hals RBF, rör vid 600 rpm vid rumstemperatur under inert gas.
- Lägga till 2,5 g 100% kaliumkarbonat (3 molar ekv.) under omrörning lösning.
Obs: kaliumkarbonat kommer inte helt lös i lösning. - Späd 1,3 mL 100% thioacetic syra (3 molar ekv.) i 100 mL 100% vattenfri DMF, och tillsätt droppvis till lösning via en tillägg tratt.
Obs: Thioacetic syra har en stark, obehagligt lukt. Var noga med att hålla alla smutsiga objekt inom den kemiska spiskåpa över natten före bortskaffande eller rengöring. - Rör kraftigt (rpm 600 eller större) över natten i rumstemperatur.
Obs: Salt bildandet kan lätt störa omrörningen av lösningen. Var noga med att upprätthålla omrörning över natten. - Filtrera lösningen genom ett Buchner tratt packad med kiselgur (se Tabell för material).
- Ta bort DMF via en roterande indunstare med vattenbad inställt på 60 ° C, rotation vid 120 rpm, och tryck in mellan 5-15 millibar.
- Lös upp produkten i 100 mL 100% tetrahydrofuran (THF) och lägga till en kolumn som packad med neutrala aluminiumoxid ta bort röd/orange färgade orenheter.
- Ta bort THF via en roterande indunstare med vattenbad inställt på 40 ° C, rotation vid 120 rpm, och tryck in mellan 200-300 millibar.
- Sparsamt åter lös produkt i 100% DCM. Om en salt fällning bildas, filtrera lösningen genom 6 μm porstorlek storlek filter papper med hjälp av en Buchner tratt.
- Långsamt fällningen produkt genom att lägga till droppvis via Pasteur-pipett till 500 mL iskallt 100% dietyleter, omrörning vid 300 rpm. Dietyleter kan behöva kylas ytterligare till-20 ° C i en explosionssäker frys i flera timmar om fällningen inte krascha ur lösningen vid 4 ° C.
- Dekantera eller aspirera för att avlägsna dietyletern från utfällda produkt, MeO-PEG17-Thioacetate. Förvara produkten över natten i vakuum exsickator, och därefter under inert gas vid-20 ° C.
- Syntetisera diblock sampolymer poly(ethylene glycol) -block -poly(propylene sulfide)-tiol (PEG17-bl- PPS35-SH, III).
- Lös MeO-PEG17-TA (II) i 10 mL 100% vattenfri DMF inom en Schlenk kolv under argon, under omrörning vid 400 rpm i rumstemperatur vattenbad.
- Lägg till 1.1 molar eq av natrium methoxide (0,5 M lösning i metanol), tillåta för att röra vid 400 rpm i 5 minuter.
- Lägg till 35 molar eq i 100% propen svavelväte, snabbt, till lösningen. Tillåta för att röra vid 400 rpm i 10 minuter.
- Lägg 10 molar eq 100% isättika, tillåta för att röra vid 400 rpm i 5 minuter.
- Ta bort DMF via en roterande indunstare med vattenbad inställt på 60 ° C, rotation vid 120 rpm, och tryck in mellan 5-15 millibar.
- Lös åter upp produkten sparsamt i 100% DCM, fällningen i 80 mL 100% metanol, delas mellan två 50 mL koniskt centrifugrör.
- Koniskt centrifugrör vid 7500 x g i 5 minuter vid 4 ° C. Aspirera bort supernatanten.
- Store produkt, PEG17-bl- PPS35-SH, övernattning i vakuum exsickator, och därefter under inert gas vid-20 ° C.
2. Montera PEG -bl -PPS Nanocarriers via Hand-Powered Flash Nanoprecipitation
- (Valfritt) Sterilisera den trånga impingement jets (CIJ) mixern.
- Inom biologiska säkerhetsdragskåp (BSC), sänk mixer med alla delar demonteras inom 0,1 M NaOH över natten.
- Återmontera CIJ mixer, och flödet genom endotoxinfria vatten med luer-lock sprutor.
- Testa pH-värdet i vattnet, och fortsätta rinna vatten genom tills pH register som neutralt.
- Upplösa PEG17-bl- PPS35-SH polymer och hydrofoba Last i THF (impingement lösning 1).
- Väger 20 mg PEG17-bl- PPS35-SH i ett 1,5 mL rör.
- Lägg till hydrofoba färgämnen (t.ex.,DiI, ICG), narkotika (t.ex.rapamycin) eller annan Last.
Obs: Last kan vara torr eller upplöst i vatten-blandbart lösningsmedel, helst THF. Om lasten är olösligt i THF eller DMF, en annan vatten-blandbart lösningsmedel får användas, men sparsamt, eftersom polymeren är osannolikt att vara lösliga. Mängden gods som kan läsas är beroende på Last egenskaper själv (t.ex. molekylvikt, vattenavvisande egenskaper, sterisk överväganden), och bör undersökas på en fall-till-fall basis11,12. - Tillsätt 500 µL av 100% THF till polymer och last, vortex kraftfullt att upplösa.
- Lös upp hydrofil Last i vattenlösning buffert (impingement lösning 2). Lös upp hydrofil last som ska laddas inom polymer blåsor i 500 µL av en vattenlösning buffert (t.ex. fosfatbuffrad saltlösning, rent vatten, etc.) som behövs för detta.
- Lägg till buffert i reservoaren.
- Tillsätt 2,5 mL en vattenlösning buffert av val (t.ex. 1 x fosfatbuffrad saltlösning) till en passande storlek reservoar (t.ex. en 20 mL injektionsflaska av glas scintillation). Placera behållaren under CIJ mixer så att utflödet från mixern går direkt in i reservoaren.
- Läsa in impingement lösningar i separat 1 mL plast engångssprutor.
- Inkräkta lösningar mot varandra samtidigt bildar nanostrukturer och ladda dem med nyttolasten.
- Sprutor för in Luer-lock adaptrar överst på CIJ mixern.
- I en enda, smidig och snabb rörelse, sänka både sprutor samtidigt och med samma kraft.
Obs: Om utför flera sekventiella impingements, först samla utflöde i en tom behållare. - (Valfritt) Utföra flera impingements. Split begynnande nanostruktur lösning mellan två sprutor, och upprepa steg 2.6.1-2.6.2 upp till 4 gånger.
- Samla utflöde i vattenlösning buffert-fyllda reservoaren beredd i 2.4.1 och rör varsamt för att säkerställa blandning.
- Ta bort lossas last och organiskt lösningsmedel.
- (Alternativ 1) Dialyze nanocarrier formulering i samma vattenlösning bufferten används för impingement och i reservoaren, med slangar en lämplig MW cutoff för minst 24 timmar med minst 2 buffert förändringar. Detta kan utföras vid rumstemperatur.
Obs: Nanocarriers kommer att behållas av slang med en MW cutoff < 100.000 kDa och potentiellt kan behållas av högre cutoffs samt. Detta alternativet upprätthåller sterilitet när de utförs i en BSC med steril buffert. - (Alternativ 2) Filtrera formulering genom en storlek uteslutning eller avsaltning/buffer Jonbytarkolonnen (t.ex. Sepharose 6B kolumn) med 1 x PBS som aqueous bufferten.
Obs: Detta alternativ upprätthåller sterilitet när de utförs i en BSC med en kolumn som har steriliserats grundligt. - (Alternativ 3) Ta bort flyktiga organiska lösningsmedel använder vakuum torkning över natten.
- (Alternativ 4) Filtrera formulering tangentiella flow filtreringssystem med ett 50-100 kDa filter flödeshastighet 20-60 mL/min för 15 minuter till 1 timme, beroende på molekylvikten för oinkapslat lasten som renas bort med (större Last kommer att ta längre tid).
- (Alternativ 1) Dialyze nanocarrier formulering i samma vattenlösning bufferten används för impingement och i reservoaren, med slangar en lämplig MW cutoff för minst 24 timmar med minst 2 buffert förändringar. Detta kan utföras vid rumstemperatur.
- (Valfritt) Koncentrera sig nanocarrier formuleringen.
- (Alternativ 1) Koncentrat med en spin koncentrator system (t.ex. spin kolumn med MW cutoff > 100.000), används som beskrivs av tillverkaren.
Obs: Nanocarriers kan behöva vara resuspended mellan spins och kräva ett antal spins att koncentrera ner till önskad volym. Spin koncentration kan minska sterilitet av nanocarrier formuleringar. - (Alternativ 2) Minska volymen med vakuum uttorkning.
Obs: Volymförändring är svårt att styra under dessa förhållanden, och försiktighet måste iakttas för att upprätthålla osmolaritet före och efter koncentrationen.
- (Alternativ 1) Koncentrat med en spin koncentrator system (t.ex. spin kolumn med MW cutoff > 100.000), används som beskrivs av tillverkaren.
- Lagra nanocarriers vid 4 ° C i veckor till månader. Innan användning efter lagring, kort vortex nanocarrier formuleringar.
3. karakterisera Nanocarrier formuleringar
-
Mäta lastning effektivitet
- Om lasten är fluorescerande eller absorberar starkt vid en viss våglängd utanför 260-450 nm, mäta fluorescens/absorbans med en fluorimeter/spektrofotometer.
Obs: PEG -bl- PPS absorberar starkt från 260-310 nm och polymersome formuleringar absorbera från 310-450 nm, vilket kan komplicera kvantifiering av lasten som absorberar liknande våglängden. - Om Last absorberas inom intervallet 260-450 nm och är hydrofil, störa PEG -bl- PPS nanostrukturer genom att lägga 25 μL av formuleringen till en lika stor volym av antingen 1% H2O2 eller 1% Triton x-100 och därefter separata och skilja Last från polymer absorbans via högpresterande vätskekromatografi (HPLC) använder en utslagning i kolumnen storlek kompatibel med aqueous buffrar (t.ex. en Sepharose 6B kolumn) 11.
- Om Last absorberar inom intervallet 260-450 nm och är lösligt i THF eller DMF, lyophilize formulering genom frysning 100 μL i ett 1,5 mL plaströr vid-80 ° C över natten. Sedan placera röret i en glas vakuum behållare och plats på en lyophilizer. Vänta 24 timmar för frystorka den inträffa och därefter åter lös i DMF eller THF 50 μL före separation och detektion via HPLC.
- Om lasten är fluorescerande eller absorberar starkt vid en viss våglängd utanför 260-450 nm, mäta fluorescens/absorbans med en fluorimeter/spektrofotometer.
-
Åtgärd nanocarrier storlek och morfologi
- Använd dynamiska ljusspridning (DLS)11 eller nanopartiklar spårning analys13 för att mäta nanocarrier storlek.
Obs: Nanocarriers bildas från PEG17-bl- PPS35-SH förväntas ha en genomsnittlig diameter mellan 100-200 nm, med en polydispertion index < 0.3. - Bestämma nanocarrier morfologi med kryogen överföring elektronmikroskopi (cryoTEM)14.
Obs: Nanocarriers bildas från PEG17-bl- PPS35-SH förväntas vara polymer blåsor (polymersomes) med en tydligt urskiljbar polymera membran och till stor del sfärisk form.
- Använd dynamiska ljusspridning (DLS)11 eller nanopartiklar spårning analys13 för att mäta nanocarrier storlek.
-
(Valfritt) Testa formuleringar för endotoxin
- (Alternativ 1) Använda en cell-baserad analys för förekomst av endotoxin, t.ex., rå blå celler eller HEK blå TLR4 celler (se Tabell för material), som beskrivs av tillverkaren, i antingen en kvantitativ eller kvalitativ analys för lipopolysackarider (LPS)13 .
- (Alternativ 2) Använd en Limulus Amebocyte Lysate (LAL)15 assay kit, som beskrivs av tillverkaren.
4. tillverkning av ett höghastighetståg sprutpumpen för FNP
- Fabricera anpassade instrumentdelar.
Obs: 3D-modeller för bearbetning alla anpassade delar tillhandahålls i kompletterande material.- Maskin flerskikts instrument chassi från ¾ ”akrylskivor och montera (se Kompletterande filer 1-5).
Obs: Akryl har dålig kemikaliebeständighet. Om instrumentet ska användas med hårda lösningsmedel, maskin basen från en metall som anses lämplig för tillämpningen. - 3D print delar med tryckt med polylaktid (PLA) plast.
- Skriva ut sprutan utvisning (SE) 2-del apparaten: SE del 1 - bakre FNP blocket holding transport (figur 5F, grå del; Kompletterande fil 6) och SE del 2 - främre utvisning guide (figur 5F, svarta delen; Kompletterande fil 7). Se kompletterande fil 2 för scheman.
- Skriva ut infraröd sensor klammerparenteserna (figur 5I, svarta lådor; Kompletterande filer 8 och 9).
- (Valfritt) Skriva ut dubbla sprutkolven stag.
- Maskin flerskikts instrument chassi från ¾ ”akrylskivor och montera (se Kompletterande filer 1-5).
- Fäst instrument chassi lager tillsammans med M5 hex bultar och lägga gummifötter till basen.
- Konfigurera en single-board dator med operativsystemet Raspbian GNU/Linux 8.0 (Jessie) (baserat på Linux Debian).
Obs: Programvara för drift av instrumentet finns på begäran. Instrumentet programvara källkoden tillgänglig på begäran. Vid mottagande zippad fil, hämta alla beroenden som anges i Readme-filen. Denna programvara innehåller ett enkelt grafiskt användargränssnitt som möjliggör kontroll över instrumentet drift, inklusive kör grundegenskaper (motorns hastighet, riktning, etc.). Användare uppmuntras att expandera på den befintliga källkoden och program anpassade moduler anpassade för använda i sina egna experiment. All programvara skrevs med Python 2.7.12 och är inte för närvarande kompatibel med Python 3. RPi, PicoBorgRev, kivy och multiprocessing moduler utnyttjas. Filen README innehåller detaljerad information om distribution programvarulicensen. - Installera en 24 V borstad likströmsmotor (figur 5A) och precision bild (4,5 ”(114,3 mm) stroke; 1,27 mm skruv leda) (figur 5 c).
Obs: 24 V DC-motor används här har en RPMmax, jagmaxoch full last vridmoment på 4,252 RPM, 4,83 A, och ~0.2 N * m, respektive.- (Valfritt) Placera stoppning under motorn för att dämpa vibrationer under drift.
Obs: Det rekommenderas att en 2-3 mm tjockt gummi pad är skuren för att passa motor transport dimensionerna av instrumentet bas. - Montera precision bilden till instrumentet basen.
- Ta bort den gängade stången tillfälligt.
- Montera bild genom att använda två #8-32 platt maskinskruvar.
- Mount DC-motor till precision bild med skruv balk koppling (1-1/4 ”längd) som innehåller 6/16” och 1/4 ”diameter hål.
Obs: Beroende på tjockleken av akryl som används för att bearbeta de instrument bas lagrarna, shims kan behövas till nivå motor och precision slide axlarna.
- (Valfritt) Placera stoppning under motorn för att dämpa vibrationer under drift.
- Montera utvisning plattform från metallplattor och L-formade hörn hängslen (figur 5 d). Montera oädel metall plattform till glidande plattform (bifogas gängstång) använder #6-32-skruvar. Se precision bild Schematisk som tillhandahålls av tillverkaren för detaljer angående montering begränsningar.
- Montera sprutan utvisning systeminställningsprogrammet.
- Fäst linjär rörelse kudde block (montering plattformar + linjär rörelse bäring) till M8 förkromat rostfritt stål järnvägar (de parallella stålskenor kan observeras lätt i figur 5).
- Trä skenor genom linjär axel guide och support samt lås rails. Använd tre guider per järnväg. Mount SE delarna 1 och 2 till kudde block med M4 maskinskruvar.
- Löst gå SE delarna 1 och 2 med M8 hex bultar. Konfigurera det tillfälliga utrymmet mellan SE del 1 och 2 med spiralformade tryckfjädrar som täcker varje bult som är säkrade mellan två inåt mot nylon bussningar (se figur 5F). Montera dessa bussningar på utsidan av den SE del 1 och SE del 2.
- Wire krets (se figur 6 för core kopplingsschema)
- Anslut MoCo till I2C/SDA, 3,3 V, och GND stift på den enkel bräde computern.
- Anslut DC motor terminaler till M- och M + block styrelsens MoCo. Anslut 24 V, 2,5 A strömförsörjning (figur 5B) till V + och GND block av MoCo (handkontrollen är inkapslad i en enkel elektronik ruta i den slutliga utformningen, se figur 5 H).
- Anslut 3V3 och 5V stiften styrelsens motorstyrning till respektive stift på den enkel bräde computern. Anslut SDA och SCL pins av motor styrenheten till stift 3 och 5 i den enkel bräde computern, respektive.
Obs: Kommandon utfärdas till DC-motor från den enkel bräde computern via en motor controller. Motorns hastighet styrs genom att reglera spänningen över de motoriska terminalerna via puls bredd modulation. I den här installationen den maximala nuvarande löper genom 24 V DC-motor (fullast-strömstyrka: 4,83 A) begränsas till 2,5 ett av 24 V strömförsörjningen. Det rekommenderas att den motoriska kretsen är inkopplad via en normalt stängd (NC) nödstopp (figur 5J). Därigenom tillhandahåller ett sätt att störa den motoriska kretsen för att aktivera en grundläggande nödstopp operation. - Anslut främre och bakre IR närhetssensorer (digital avståndssensorer, figur 5I) till RPi GPIO stift 24 och 23, respektive.
- Rutten sensor ledningar genom störtar i instrumentet basen.
Obs: De IR-sensorerna är beröringsfri paus-beam rörelsesensorer med ett avkänningsområde på 2-10 cm. - 4.7.4.2 snäpper fast IR sensorer på 3D-tryckt infraröd sensor hängslen (figur 5I, svarta lådor) och montera på instrumentet basen. När korrekt inställd till stag, sensor ansiktet ska sticka ut utåt från 14 mm x 7 mm rektangulär öppning av ortosen.
Obs: dessa sensor hängslen kan tillfälligt monteras med Velcro eller klister (tillfällig montering är användbart att på lämpligt sätt justera och optimera placering av IR-sensorn). Alternativt, permanent montera genom borrning liten guide hål i instrumentet basen och säkra klammerparenteserna med M2 skruvar.
- Rutten sensor ledningar genom störtar i instrumentet basen.
- Anslut en 7-tums pekskärm LCD-display till 5V, GND, och Visa seriellt gränssnitt (DSI) stift på den enkel bräde computern. Den 7 ”RPi och LCD-display montering visas i figur 5 g.
5. tillverka Polymersomes via FNP använder skräddarsydda höghastighetståg sprutpumpen
- (Alternativ 1) Använd auto kör-läge.
- Välj Auto Run från huvudmenyn. Systemet vilja snabb förbrukaren till tillåter motorn att automatiskt placera sprutan utvisning plattformen till början av precision bilden. Se till att sökvägen framför och bakom metallplattan är klar innan du fortsätter.
- Ladda 1 mL plast sprutor som beskrivs i avsnitt 2.5 och mount sprutor på kvinnliga Luer anslutningarna till CIJ mixern. Ladda CIJ mixer (med sprutor kopplade) i bakre utvisning transport rektangulär öppning (se figur 5E).
- Ange önskad motor hastighet (enheter: rpm) med hjälp av skjutreglaget i GUI (se not nedan för viktiga överväganden). Det optimala varvtalet beror på specifika pumpen och setup men måste säkerställa ett flöde på minst 1 mL/s för CIJ mixer kanal måtten här.
Överväg följande medan inställningen flöde. I den vertikala handdrivna FNP konfigurationen, reaktanterna förvisas från sprutorna med en hastighet på ~ 1 mL/s, men kan vara mycket varierande när hand driven. Detta är helt enkelt flödet genom sprutkammaren, som kontrolleras av den hastighet med vilken användaren förskott sprutkolven. Observera att 1 mL/s är inte hänvisar till exit flödet från mindre diameter munstycket. Vid ovan angivet kanal dimensioner, ~ 1 mL/s bör bibehållas för att säkerställa en lämplig Reynolds nummer för turbulent blandande10. Olika flöden kan användas så länge kanalen diameter justeras därefter för att upprätthålla en Reynolds nummer som stöder turbulenta förhållanden. Sprutan kolvarna är avancerade av en vinkelrät metallplatta, som flyttas längs en hög precision aluminium bild kopplad till 24 V borstad likströmsmotor. I den här konfigurationen av maximal fat flöde påverkas av ett antal faktorer, inklusive (1) det maximala varvtalet (4,252 rpm) och skruv ledningen av precision bilden (1,27 mm) som är kopplad till motorn skaft (2) vridmoment på motorn (~0.2 N * m full-l OAD vridmoment), som behövs för att övervinna motstånd för att flöda (3) mottryck bidrag från vätska träder i och avsluta från CIJ mixern och (4) styrkan av sprutor används (användare bör vara uppmärksam på de krafter som verkar på sprutorna och använda sprutor med rätt styrka). Angående punkt 2, när ökar flödet krävs klassar tillräckligt vridmoment att undvika stannat motorn samtidigt stadig utvisning under ökande mottryck. Fat flöden – att illustrera den fat flöden Betygsätt att det ovannämnda systemet kan uppnå, överväga fallet där FNP utförs med hjälp av reaktanterna lästs in två en-milliliter sprutor. För att uppnå en 1 mL/s flöde måste genom pipan, motorn avancera metallplattan avståndet definieras av kolven längden (~ 68 mm för en typisk en mL spruta) i en sekund. Förutsatt 1,27 mm skruv ledningen av precision bilden, Härav följer att en DC-motor som arbetar vid 4,252 rpm är kapabel att avancera plattformen upp till ~ 90 mm/s (71 varv/s * 1,27 mm/varv). Detta motsvarar en fat flödeshastighet av ~1.3 mL/s, vilket överstiger andelen för mål 1 mL/s. - Innan du kör instrumentet, kontrollera systemet så att den som sökväg plattformen är fri från hinder, och som de främre och bakre IR närhet detektorerna tydliga hinder (de IR-sensorerna är små svarta lådor nära precision bilden terminaler; Se figur 5I). Också se till att kapillär slangar utloppet från CIJ mixern dirigeras till en lämplig samling container (ex: glas bägare, etc.).
- För att utvisa reaktanterna från sprutor och in CIJ mixern, tryck på knappen Kör i programvarugränssnitt.
- (Alternativ 2) Använda manuell körningsläge. Se Köra autoläge anvisningarna ovan och följande ändring för att stega 5.1.5: Tryck på knappen framåt pressas kontinuerligt genom slutförandet av körningen (dvs plattformen förskott som svar på en händelse som på-press, och motorn kommer sluta som svar på en händelse som på frisättning).
- (Alternativ 3) Använda manuell plattform positionering läge; Detta läge tillåter användare att placera plattformen genom att motorn körs med låg hastighet (20% power) som svar på knapparna framåt och bakåt på programvarugränssnitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här har vi presenterat ett enkelt protokoll för utformningen av nanocarriers kan laddar hydrofil och hydrofoba last som är säkra för i vivo mus och icke-mänskliga primater administration11,13. Vi har även inkluderat ett detaljerat protokoll för syntes av den polymer som används i våra representativa resultat, tillsammans med en beskrivning för tillverkning av ett anpassade instrument för den mekaniskt styrd impingement av lösningar i CIJ mixer. Figur 1 ger en översikt av syntesen steg utförs för att producera PEG17-bl- PPS35-SH, den diblock sampolymer brukade själv montera polymersome nanocarriers. En översikt av protokollet FNP för montering av PEG-bl-PPS polymersomes laddad med therapeutics och/eller imaging agenter är diagramed i figur 2. Polymeren var träffas i en CIJ mixer (schematiska bilden i figur 3a, ursprungligen beskrivs i 10) för att bilda monodisperse polymersomes som samlade morfologi, vilket kan vara validerad av dynamiskt ljus spridning (DLS) och kryogena transmissionselektronmikroskopi (cryoTEM) (figur 3b-3 c). Polymersomes bildas av FNP blivit mindre (figur 3d) och mer monodisperse (figur 3e) med efterföljande impingements, och kan läsas med hydrofil och hydrofoba Last (t.ex. gjorde lipofila dye, liten molekyl Therapeutics, protein osv; Figur 4a). Nanocarriers bildade under sterila förhållandena som beskrivs ovan är endotoxin gratis av både RAW blå och LAL endotoxin analyser och därmed lämplig för ett brett spektrum av in vitro- och in-vivo applikationer (figur 4b, data som inte visas).
Slutligen har vi konstruerat och tillverkat ett instrument till mekaniskt-kontroll flödet och resulterande impingement av lösningar i CIJ mixer (figur 5). Skapandet av detta instrument är viktigt, som kommersiellt tillgängliga sprutpumpar inte kan uppnå de flöden som krävs för FNP. Med undantag för egna ändringar har kommersiellt tillgängliga sprutpumpar hastighetsbegränsningar av deras användning av låg hastighet stegmotorer, som är utformade för att tillförlitligt dispensera vätskan i en långsam och stadig mode. I vårt instrument styrs reaktant utvisning av en precision bild under kontroll av en 24 V borstad DC-motor, som kan uppnå mycket högre hastigheter (4,252 rpm) än de långsamma stegmotorer finns i kommersiella sprutpumpar. Anpassade programvara som körs på en enkel bräde computern används för att driva instrumentet (figur 6). 2D-ritningar har lämnats förutom 3D-modeller av delar. Alla ritningar och modeller skapades i FreeCAD (parametrisk 3D CAD modellering programvara med öppen källkod) att säkerställa att de är mycket tillgängliga för forskarsamhället. Programvaran för drift instrumentet var skriven i Python 2.7.12, vilket möjliggör den snabba utvecklingen av anpassade FNP förfaranden för att säkerställa kongruent produktionen av nanocarriers (storlek, morfologi, etc.). Programvara för drift av instrumentet kommer att göras tillgängliga på begäran. Användare bör Observera att programvaran inte är för närvarande kompatibel med Python 3; men kan detta ändras i framtida uppdateringar. Genom att kontrollera reaktant utvisning rate, eliminerar detta instrument variabeln av mänskliga fel från hand-operation.
Figur 1. Sammanfattande schema för syntesen av PEG17- bl-PPS36-SH. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Produktion av polymersomes via FNP i en hand-driven CIJ mixer. Diagram av bildandet av polymersomes använder FNP. PEG-bl-PPS polymeren löses upp i organiskt lösningsmedel tillsammans med hydrofoba last och är träffas mot aqueous lösningsmedel med upplöst hydrofil Last. Snabba blandning sker inom CIJ mixern och efflux kan vara upprepade gånger träffas eller tillåtet att slutföra bildandet processen genom spädning i en reservoar av aqueous lösningsmedel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Karakterisering av polymersomes bildas av FNP. (a) Design Schematisk CIJ mixerns används i denna studie. Alla mått är i millimeter. (b) storlek distribution av polymersomes bildas av FNP efter 1 och 5 impingements, mätt som DLS. n = 6 formuleringar, medelvärdet av prover återgivningsegenskaper. (c) exempel cryoTEM bilder av polymersomes bildade efter 1 och 5 impingements genom CIJ mixern, skala bar = 100 nm. Diametern (d) och polydispertion index (e) av polymersomes som bildas av FNP, mätt med DLS. För jämförelse, polymersomes bildas av tunn film rehydrering, med (TF-E) eller utan (TF-NE) efterföljande extrudering, och bildas av solvent dispersion (SD) var också mätt, n = 3, felstaplar representera standardavvikelse. Subfigures (c)-(e) tagits med tillstånd från Allen et al. 11. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4. Laddar effektivitet och endotoxin karakterisering. (a) lastning effektivitet av små och makromolekyler inom polymersomes, n = 3, felstaplar representera standardavvikelse. (b) RAW blå LPS haltbestämning av polymersomes bildas av sterila FNP, n = 6, felstaplar representera standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Instrument för mekanisk kontroll av lösning impingement i CIJ mixer. (a) 24 V borstad DC Motor. (b) strömförsörjning (24 V, 2,5 A). (c) 4,5 ”stroke precision bild med 1,27 mm skruv bly (ansluten till motoraxeln med en skruv balk koppling). (d) utvisning plattformen konstrueras från rektangulära metallplattor och L-formade hörn hängslen. (e) (CIJ) mixer. (f) utvisning transport. (g) enda styrelse dator och 7 ”pekskärm. (h) mMotor kontrollstyrelsen inneslutet i plast hölje (83 x 53 x 35 mm). (i) IR-sensorer (beröringsfri paus-beam rörelsesensorer). (j) Emergency stop-knappen (NC). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Core kopplingsschema. De primära anslutningarna mellan enkel bräde computern, MoCo och IR-sensorer visas. LCD pekskärm anslutningar visas inte här, eftersom denna komponent är icke-väsentliga (användare kan välja att använda en vanlig datorskärm och musen istället). Observera att i visas konfigurationen, 24 V motor strömförsörjningen och enda styrelse dator strömförsörjning är separat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har gett detaljerade instruktioner för snabb tillverkning av polymersomes med PEG17-bl- PPS35-SH som den diblock sampolymer. Vesikulär polymersomes är den primära sammanlagda morfologi monteras på detta förhållande hydrofil PEG och hydrofoba PPS block molekylvikt. När träffas flera gånger, de har en diameter och polydispertion som matchar polymersomes extruderade genom en 200 nm membran efter att ha bildat via tunn film återfuktning. Detta protokoll eliminerar därmed behovet av ytterligare extrudering steg under tillverkning av monodisperse polymersome nanocarriers. Polymersomes bildas via FNP lasta både hydrofil och hydrofoba gods och underhålla bioaktiviteten av dessa molekyler genom formulering processen11. Tilläggsprotokollen beskrivs att säkerställa steriliteten vid behov tillåta bildandet av polymersome formuleringar som är endotoxinfria och därför lämplig för biokemiska och immunologiska analyser samt säkra för administration i vivo . Handmanövrerad CIJ mixern är enkel till sätta upp och ger välbefinnande-av-använda för användaren, men introducerar potentiella kvalitetskontroll problem på grund av användaren variabilitet. För att upprätthålla flödet konsistens, försökt vi att skapa ett instrument som kan uppnå och reproducibly upprätthålla en jämförbar flödeshastighet. Ännu viktigare, vid ovan angivet kanal dimensioner, kommersiella sprutpumpar inte kan uppnå tillräckligt höga flöden (~ 1 mL/s) på grund av att vara utrustad med låg hastighet stegmotorer. Att bekämpa problemet, och att ge större kontroll över flödet, beskrevs tillverkning av en höghastighets sprutpumpen för FNP. Var försiktig att använda öppen källkod och lätt anpassningsbar programvara systemet OS och kod.
Kontroll över alternativa flöden ger möjligheter att finjustera nanocarrier formulering och ger möjligheter att utforska montering av olika nanocarrier morfologier. Reynoldstal och motsvarande blandning tid visades tidigare att påverka storleken på solid-core nanocarriers bildas via FNP9, men det är inte klart vilken inverkan det har på bildandet av polymersomes. Detta är ett ämne av nu aktuella undersökningen, med den aktuella rekommendera hastigheten 0,5 till 2 mL/s, med de representativa resultat utförs vid cirka 1 mL/s. För att öka kontroll över flödet ännu längre, kan det nödvändigt att ersätta det Linux-baserat operativsystemet med realtid kontroll över sprutan pumpmotorn.
Bortsett från justera flödet, finns det ett antal sätt detta FNP protokoll kan ändras till svit specifika behov eller applikationer. Mindre eller större mängder polymer kan användas. Koncentrationer som låg som 1 mg/mL och så hög som 100 mg/mL har använts att bilda stabila nanocarriers. Större volymer kan användas för impingement, även om konsekvent tillämpning av trycket under hand-driven FNP är svårare på volymer större än 1 mL per spruta. Volymen av reservoaren kan också ändras. Slutlig organiska: aqueous lösningsmedel nyckeltal som är större än 1:3 kan resultera i ofullständiga bildandet av nanocarriers, och som sådan försiktighet bör iakttas att inte minska volymen av behållaren utan att bekräfta bildandet av nanocarriers. Aggregation kan uppstå när du försöker ladda höga koncentrationer av hydrofoba Last, som vanligtvis kan lindras genom att öka molar förhållandet av polymer: Last.
En ytterligare ämne öppna för prospektering är den ytterligare utvidgningen av FNP polymersome bildandet att inkludera andra polymera system utöver PEG -bl-PPS. Andra system har faktiskt använts tidigare i bildandet av miceller och solid-core drog nanocarriers16,17. Det är dock oklart om det finns en uppsättning parametrar som kan leda till bildandet av polymersomes via FNP använder dessa andra polymera system. Med tanke på antalet potentiella variabler att utforska, är det fullt möjligt att andra polymerer kan bilda polymersomes eller andra mjuka nanoarchitectures via FNP med justerade experimentella parametrar, såsom flöde, temperatur, lösningsmedel urval och polymer koncentrationen.
Som med alla formulering tekniker finns det begränsningar för FNP och begränsningar som kan göra vissa applikationer ohållbar. Snabba blandning processen kräver att de organiska och aqueous lösningsmedel är blandbar, som utesluter användning av några vanliga lösningsmedel som används för upplösning av många diblock sampolymerer, t.ex. diklormetan och kloroform. Vissa polymerer kan därför återges oförenligt med FNP om de inte kunna upplösas i ett vatten-blandbart organiska lösningsmedel. Det FNP-protokollet som beskrivs här använder tredjeparts förhållandet 1:1 av ekologiska till aqueous lösningsmedel, som kan minska aktiviteten av nyttolaster känsliga för höga halter av organiskt lösningsmedel, till exempel vissa bioaktiva proteiner. Det bör noteras att påverkan på bioaktivitet beror på proteinet, som vi har tidigare funnit minimala effekter på den enzymatiska aktiviteten av alkaliskt fosfatas efter lastning inom polymersomes av FNP11. Det är en dyrare men mer anpassningsbara FNP-plattform som ger ytterligare kontroll över förhållandet mellan ekologiska till aqueous lösningsmedel, ett mångsidigt alternativ till CIJ blandare för dessa sammanhang flera inlopp vortex blandare18 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Vi erkänner att personalen och instrumentation stöd från strukturell biologi anläggningen vid Northwestern University. Stödet från det R.H. Lurie omfattande Cancer Center av Northwestern universitetet och Northwestern University strukturell biologi faciliteter är erkänt. Gatan K2 direkt elektron detektorn köptes med medel från Chicago biomedicinsk konsortiet med stöd från Searle fonderna på The Chicago Community Trust. Vi tackar också följande faciliteter vid Northwestern University: anläggningen Keck tvärvetenskapliga yta-vetenskap, strukturell biologi anläggningen, biologiska Imaging anläggningen, Center for Advanced Molecular Imaging och analytiskt Bionanoteknik utrustning Core. Denna forskning stöddes av National Science Foundation bidraget 1453576, nationella institut för hälsa direktörens nya innovatör Award 1DP2HL132390-01, Center for regenerativ nanomedicin katalysator Award och 2014 McCormick katalysator Award. SDA stöddes delvis av NIH pre bioteknik utbildning Grant T32GM008449.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate Starter Kit - 32 GB Edition | CanaKit | UPC 682710991511 | |
| Linear Bearing Platform (Small) - 8mm Diameter | Adafruit | 1179 | |
| Linear Motion 8 mm Shaft, 330 mm Length, Chrome Plated, Case Hardened, Metric | VXB | kit11868 | |
| Linear Rail Shaft Guide/Support - 8 mm Diameter | Adafruit | 1182 | |
| Manual-Position Precision Slide 4.5" Stroke, 15 lb load capacity | McMaster-Carr | 5236A16 | |
| MTPM-P10-1JK43 Iron Horse DC motor | Iron Horse | MTPM-P10-1JK43 | |
| Official Raspberry Pi Foundation 7" Touchscreen LCD Display | Raspberry Pi | B0153R2A9I (ASIN) | |
| PicoBorg Reverse - Advanced motor control for Raspberry Pi | PiBorg | BURN-0011 | |
| Pololu Carrier with Sharp GP2Y0D810Z0F Digital Distance Sensor 10cm | Pololu | 1134 | |
| Ruland PSR16-5-4-A Set Screw Beam Coupling, Polished Aluminum, Inch, 5/16" Bore A Diameter, 1/4" Bore B Diameter, 1" OD, 1-1/4" Length, 44 lb-in Nominal Torque | Ruland | PSR16-5-4-A | |
| Polyethylene glycol monomethyl ether | Sigma Aldrich | 202495 | |
| Methanesulfonyl chloride | Sigma Aldrich | 471259 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 179418 | |
| Toluene, Anhydrous | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | |
| Celite 545 (Diatomaceous Earth) | Sigma Aldrich | 419931 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 320269 | |
| Diethyl ether | Sigma Aldrich | 296082 | |
| N,N-Dimethylformamide, anhydrous | Sigma Aldrich | 227056 | |
| Potassium carbonate | Sigma Aldrich | 791776 | |
| Thioacetic acid | Sigma Aldrich | T30805 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma Aldrich | 360589 | |
| Aluminum oxide, neutral, activated, Brockmann I | Sigma Aldrich | 199974 | |
| Sodium methoxide solution, 0.5 M in methanol | Sigma Aldrich | 403067 | |
| Propylene sulfide | Sigma Aldrich | P53209 | |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 320390 | |
| Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma Aldrich | S2770 | |
| Endotoxin-free water | GE Healthcare Life Sciences | SH30529.01 | |
| Paper pH strips | Fisher Scientific | 13-640-508 | |
| Endotoxin-free Dulbecco's PBS | Sigma Aldrich | TMS-012 | |
| Borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| 1 mL all-plastic syringe | Thermo Scientific | S75101 | |
| Sepharose CL-6B | Sigma Aldrich | CL6B200 | |
| Liquid chromatography column | Sigma Aldrich | C4169 | |
| CIJ mixer, HDPE | Custom | ||
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma Aldrich | 216763 | |
| HEK-Blue hTLR4 | InvivoGen | hkb-htlr4 | |
| RAW-Blue Cells | InvivoGen | raw-sp | |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | |
| PYROGENT Gel Clot LAL Assays | Lonza | N183-125 |
References
- Stano, A., Scott, E. A., Dane, K. Y., Swartz, M. A., Hubbell, J. A. Tunable T cell immunity towards a protein antigen using polymersomes vs. solid-core nanoparticles. Biomaterials. 34 (17), 4339-4346 (2013).
- Discher, B. M., et al. Polymersomes: tough vesicles made from diblock copolymers. Science. 284 (5417), 1143-1146 (1999).
- Vasdekis, A. E., Scott, E. A., O'Neil, C. P., Psaltis, D., Hubbell, J. A. Precision intracellular delivery based on optofluidic polymersome rupture. ACS Nano. 6 (9), 7850-7857 (2012).
- Yi, S., et al. Tailoring Nanostructure Morphology for Enhanced Targeting of Dendritic Cells in Atherosclerosis. ACS Nano. 10 (12), 11290-11303 (2016).
- Shum, H. C., Kim, J. W., Weitz, D. A. Microfluidic fabrication of monodisperse biocompatible and biodegradable polymersomes with controlled permeability. Journal of the American Chemical Society. 130 (29), 9543-9549 (2008).
- Pessi, J., et al. Microfluidics-assisted engineering of polymeric microcapsules with high encapsulation efficiency for protein drug delivery. International Journal of Pharmaceutics. 472 (1-2), 82-87 (2014).
- O'Neil, C. P., Suzuki, T., Demurtas, D., Finka, A., Hubbell, J. A. A novel method for the encapsulation of biomolecules into polymersomes via direct hydration. Langmuir. 25 (16), 9025-9029 (2009).
- Saad, W. S., Prud'homme, R. K. Principles of nanoparticle formation by flash nanoprecipitation. Nano Today. 11 (2), 212-227 (2016).
- Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Mechanism for rapid self-assembly of block copolymer nanoparticles. Physical Review Letters. 91 (11), 118302 (2003).
- Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).
- Allen, S., Osorio, O., Liu, Y. G., Scott, E. Facile assembly and loading of theranostic polymersomes via multi-impingement flash nanoprecipitation. Journal of Controlled Release. 262, 91-103 (2017).
- Bobbala, S., Allen, S. D., Scott, E. A. Flash nanoprecipitation permits versatile assembly and loading of polymeric bicontinuous cubic nanospheres. Nanoscale. 10 (11), 5078-5088 (2018).
- Allen, S. D., et al. Polymersomes scalably fabricated via flash nanoprecipitation are non-toxic in non-human primates and associate with leukocytes in the spleen and kidney following intravenous administration. Nano Research. , (2018).
- Karabin, N. B., et al. Sustained micellar delivery via inducible transitions in nanostructure morphology. Nature Communications. 9 (1), 624 (2018).
- Mascoli, C. C., Weary, M. E. Limulus amebocyte lysate (LAL) test for detecting pyrogens in parenteral injectable products and medical devices: advantages to manufacturers and regulatory officials. Journal of the Parenteral Drug Association. 33 (2), 81-95 (1979).
- Pustulka, K. M., et al. Flash nanoprecipitation: particle structure and stability. Molecular Pharmaceutics. 10 (11), 4367-4377 (2013).
- Tang, C., Amin, D., Messersmith, P. B., Anthony, J. E., Prud'homme, R. K. Polymer directed self-assembly of pH-responsive antioxidant nanoparticles. Langmuir. 31 (12), 3612-3620 (2015).
- Gindy, M. E., Panagiotopoulos, A. Z., Prud'homme, R. K. Composite block copolymer stabilized nanoparticles: simultaneous encapsulation of organic actives and inorganic nanostructures. Langmuir. 24 (1), 83-90 (2008).
