Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Hurtig og skalerbar forsamling og læsning af bioaktive proteiner og immunostimulanter i forskellige syntetiske Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation

Published: August 11, 2018 doi: 10.3791/57793
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Interdisciplinary Biological Sciences, Northwestern University, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University

Summary

Nanomaterialer giver alsidig ordninger for kontrolleret terapeutisk levering til både grundforskning og translationel applikationer, men deres fabrikation ofte kræver ekspertise, som ikke er tilgængelig i de fleste biomedicinske laboratorier. Vi præsenterer her, protokoller for skalerbar fabrikation og terapeutiske belastning af forskelligartede selvsamlede nanocarriers ved hjælp af flash nanoprecipitation.

Abstract

Nanomaterialer præsentere en bred vifte af muligheder for at tilpasse kontrolleret levering af enkelt og kombinerede molekylære nyttelast for terapeutiske og tænkelig andragender. Denne øget specificitet kan have stor klinisk betydning, herunder nedsat bivirkninger og lavere doser med højere potens. Derudover kan i situ målretning og kontrolleret graduering af specifikke celle subsets styrke in vitro og i vivo undersøgelser af grundlæggende biologiske fænomener og sonde cellefunktion. Desværre, den nødvendige ekspertise i nanoskala naturvidenskab, kemi og teknik ofte forbyde laboratorier uden erfaring i disse felter fra opdigte og tilpasning af nanomaterialer som værktøjer til deres undersøgelser eller køretøjer til deres terapeutiske strategier. Her give vi protokoller til syntese og skalerbar forsamling af en alsidig giftfri blok copolymer system imødekommenhed over for facile dannelsen og lastning af nanoskala køretøjer for biomedicinske programmer. Flash nanoprecipitation er præsenteret som en metode til hurtig fremstilling af forskellige nanocarriers fra poly(ethylene glycol) -bl-poly (propylen sulfid) copolymere. Disse protokoller vil tillade laboratorier med en bred vifte af ekspertise og ressourcer til let og reproducerbar Fremstil avanceret nanocarrier leveringssystemer til deres programmer. Design og konstruktion af et automatiseret instrument, der beskæftiger en højhastigheds sprøjten pumpe til at lette den flash nanoprecipitation behandle og for at give øget kontrol over homogenitet, størrelse, morfologi og belastning af polymersome nanocarriers er beskrevet.

Introduction

Nanocarriers giver mulighed for kontrolleret levering af små og makromolekylære last, herunder aktive enheder, hvis ikke indkapslet, ville være enten meget nedbrydeligt og/eller for hydrofobe for administration i vivo. Af nanocarrier morfologier regelmæssigt fabrikeret, tilbyde polymere vesikler svarer til Liposomer (også kaldet polymersomes) evnen til at samtidig indlæse hydrofile og hydrofobe cargo1,2. Trods deres lovende fordele er polymersomes stadig sjældne i kliniske applikationer skyldes, dels at flere centrale udfordringer i deres fremstilling. Til klinisk brug skal polymersome formuleringer foretages i store, sterile og konsekvent partier.

En række teknikker kan bruges til form polymersomes fra diblock copolymer, såsom poly(ethylene glycol) -blok-poly (propylen sulfid) (PIND -bl- PPS), som indeholder opløsningsmiddel dispersion3, tynd film rehydrering1 , 4, mikrofluidik 5,6, og direkte hydrering7. Opløsningsmiddel spredning involverer lang inkubationstid gange i nærværelse af organiske opløsningsmidler, som kan denaturere nogle bioaktive nyttelast, ligesom proteiner. Tyndfilm rehydrering tilbyder ikke kontrol over polydispersity af den dannede polymersomes, ofte kræver dyre og tidskrævende ekstrudering teknikker til at opnå acceptable monodispersity. Både microfluids og direkte hydrering er desuden vanskeligt at skala til større produktionsmængder. Af de forskellige nanocarrier fabrikation metoder giver flash nanoprecipitation (FNP) mulighed for at foretage omfattende og reproducerbare formuleringer8,9,10. Mens FNP var tidligere forbeholdt formuleringen af solid core nanopartikler, vores lab har for nylig udvidet brug af FNP medtage konsekvent dannelsen af forskelligartede PIND -bl- PPS nanostrukturer morfologier11, 12, herunder polymersomes11 og bicontinuous nanospheres12. Vi fandt at FNP var i stand til at danne monodisperse formuleringer af polymersomes uden behov for ekstrudering, hvilket resulterer i overlegen polydispersity indeksværdier sammenlignet med ikke-ekstruderet polymersomes dannet af tynde film rehydrering og opløsningsmiddel dispersion 11. Bicontinuous nanospheres, med deres store hydrofobe domæner, ikke var i stand til at være dannet af tynde film rehydrering, trods danner under en række opløsningsmidler betingelser med FNP12.

Her, vi giver en detaljeret beskrivelse til syntese af PEG -bl- PPS diblock copolymer anvendes i polymersome dannelse, begrænset impingement jetfly (CIJ) mixer brugt til FNP, FNP protokol sig selv, og gennemførelsen af et automatiseret system til at reducere bruger variabilitet. Inkluderet er oplysninger om, hvordan til at sterilisere systemet tilstrækkeligt til at producere endotoxin-fri formuleringer til brug i vivoog repræsentative data vedrørende karakterisering af polymersomes dannet af FNP. Med disse oplysninger, vil læsere med interesse i at udnytte polymersomes for in vitro- og i vivo arbejde kunne fremstille deres egen sterile, monodisperse formuleringer. Læsere med erfaring i nanocarrier formuleringer og med polymer syntese ekspertise vil være i stand til hurtigt teste deres egen polymer systemer bruger FNP som en potentiel alternativ til deres nuværende formulering teknikker. Derudover kan de protokoller er beskrevet heri bruges som pædagogiske redskaber til formulering af nanocarriers i nanoteknologi laboratorium kurser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Sammenfatning af Poly(ethylene glycol) -blok-poly (propylen sulfid)-Thiol

  1. Syntetisere methoxy-poly(ethylene glycol) mesylat (Mn: 750) (MeO-PIND17-Ms, jeg).
    1. 10 g MeO-PIND17-OH i 200 mL 100% toluen inden for en 3-hals rund bund kolbe (RBF) opløses under magnetiske omrøring på 600 rpm.
    2. Tilsluttes en Dean-Stark apparater, selv knyttet til en kondensator 3-hals RBF, holde hele systemet under anvendelse af inaktiv gas, enten nitrogen eller argon.
    3. Placer 3-hals RBF i et oliebad, varme til 165 ° C under omrøring på 600 rpm.
    4. Fjerne spor vand og 100 mL toluen ved hjælp af azeotropic destillation.
    5. Fjern 3-hals RBF fra olie, frigøre apparatet Dean-Stark samtidig opretholde inaktiv gas betingelser og afkøles til stuetemperatur.
    6. Tilføje 5,6 mL 100% triethylamin (3 kindtand eq.) og 300 mL af vandfri 100% toluen til MeO-PIND17-OH løsning under omrøring på 600 rpm.
    7. Flytte 3-hals RBF til isbad, opretholde omrøring på 600 rpm og inaktiv gas betingelser.
    8. 3,1 mL 100% methanesulfonyl chlorid (3 kindtand eq.) fortyndes i 30 mL 100% toluen, langsomt tilføje til de 3-hals RBF via en tilføjelse tragt under omrøring på 600 rpm.
    9. Rør natten på 600 rpm ved stuetemperatur inert betingelser.
    10. Filter løsning gennem en Buchner tragt pakket med Diatoméjord (Se Tabel af materialer) at fjerne salte.
    11. Fjerne toluen via en roterende fordamper med vandbad indstillet til 40 ° C, rotation på 120 rpm og trykket indstillet til mellem 50-100 millibar.
    12. Re opløses produkt i 200 mL af 100% dichlormethan (DCM) og filtreres gennem et Buchner tragt pakket med Diatoméjord (Se Tabel af materialer).
    13. Fjerne DCM via en roterende fordamper med vandbad indstillet til 40 ° C, rotation på 120 rpm og trykket indstillet til mellem 450-600 millibar.
    14. Sparsomt re opløses produkt i 100% DCM og langsomt bundfald produkt ved at tilføje det dråbevis (via Pasteur pipette) til 500 mL iskold 100% diethylether. Vedligeholde omrøring på 300 rpm.
    15. Dekanteres eller Aspirér for at fjerne diethylether fra udfældet produkt, MeO-PIND17- mesylat, og butikken natten over i vakuum ekssikkator tørre fuldstændigt.
    16. Bruge produktet straks, eller gemme under anvendelse af inaktiv gas ved-20 ° C i flere måneder.
  2. Syntetisere methoxy-poly(ethylene glycol) thioacetate (MeO-PIND17-TA, II).
    1. Opløses 5 g af MeO-PIND17-Ms (I) i 200 mL af 100% vandfrit dimethylformamid (DMF) i en 3-hals RBF, røre på 600 rpm ved stuetemperatur under anvendelse af inaktiv gas.
    2. Tilføje 2,5 g af 100% kaliumcarbonat (3 kindtand eq.) til omrøring løsning.
      Bemærk: kaliumkarbonat vil ikke helt opløses i løsning.
    3. 1,3 mL af 100% thioacetic syre (3 kindtand eq.) fortyndes i 100 mL 100% vandfrit DMF, og tilføje dråbevis til løsning via en tilføjelse tragt.
      Bemærk: Thioacetic syre har en stærk, mishagelige lugt. Pleje skal tages til at holde alle tilsmudsede genstande inden for den kemiske stinkskab natten inden bortskaffelse eller rensning.
    4. Rør kraftigt (rpm 600 eller større) natten over ved stuetemperatur.
      Bemærk: Salt dannelse kan let forstyrre omrøring af denne løsning. Skal sørges for at opretholde omrøring natten over.
    5. Filter løsning gennem en Buchner tragt pakket med Diatoméjord (Se Tabel af materialer).
    6. Fjerne DMF via en roterende fordamper med vandbad indstillet til 60 ° C, rotation på 120 rpm og trykket sat til mellem 5-15 millibar.
    7. Opløse produkt i 100 mL 100% tetrahydrofuran (THF) og tilføje en kolonne, pakket med neutral alumina at fjerne rød/orange farvede urenheder.
    8. Fjerne THF via en roterende fordamper med vandbad indstillet til 40 ° C, rotation på 120 rpm og trykket indstillet til mellem 200-300 millibar.
    9. Sparsomt re opløses produkt i 100% DCM. Hvis en salt bundfaldet danner, filter løsning gennem 6 μm pore størrelse filter papir ved hjælp af en Buchner tragt.
    10. Langsomt bundfald produkt ved at føje dråbevis via Pasteur pipette til 500 mL iskold 100% diethylether, omrøring på 300 rpm. Diethylether muligvis yderligere afkøles til-20 ° C i en eksplosion-bevis fryser i flere timer hvis bundfaldet ikke crash fra løsning ved 4 ° C.
    11. Dekanteres eller Aspirér for at fjerne diethylether fra udfældet produkt, MeO-PEG17-Thioacetate. Gemme produktet natten over i et vakuum ekssikkator, og efterfølgende under anvendelse af inaktiv gas ved-20 ° C.
  3. Syntetisere diblock copolymer poly(ethylene glycol) -blok -poly(propylene sulfide)-thiol (PIND17-bl- PPS35-SH, III).
    1. Opløses MeO-PIND17-TA (II) i 10 mL 100% vandfrit DMF inden for en Schlenk kolben under argon, mens omrøring på 400 rpm i vandbad stuetemperatur.
    2. Tilføje 1.1 kindtand eq af natrium methoxide (0,5 M opløsning i methanol), giver mulighed for at røre ved 400 rpm i 5 minutter.
    3. Tilføje 35 kindtand eq af 100% propylen sulfid, hurtigt, til løsning. Gør det muligt for at røre ved 400 rpm i 10 minutter.
    4. Tilføje 10 kindtand eq 100% iseddike, mulighed for at røre ved 400 rpm i 5 minutter.
    5. Fjerne DMF via en roterende fordamper med vandbad indstillet til 60 ° C, rotation på 120 rpm og trykket sat til mellem 5-15 millibar.
    6. Re opløses produkt sparsomt i 100% DCM, udfældes i 80 mL 100% methanol, delt mellem to 50 mL konisk centrifugeglas.
    7. Konisk centrifugeglas på 7500 x g i 5 minutter ved 4 ° C. Aspirat lager supernatanten.
    8. Store produkt, PIND17-bl- PPS35-SH, overnatning i et vakuum ekssikkator, og efterfølgende under anvendelse af inaktiv gas ved-20 ° C.

2. Saml PIND -bl -PPS Nanocarriers via Hand-Powered Flash Nanoprecipitation

  1. (Valgfrit) Sterilisere begrænset impingement jetfly (CIJ) mixer.
    1. Inden for en biologisk sikkerhed kabinet (BSC), nedsænkes mixer med alle dele afmonterede inden for 0,1 M NaOH natten over.
    2. Saml CIJ mixer, og strømmen gennem endotoxin-gratis vand ved hjælp af luer-lock sprøjter.
    3. Test pH i vandet, og fortsætte med at flyde vand gennem indtil pH registre som neutral.
  2. Opløse PIND17-bl- PPS35-SH polymer og hydrofobe last i THF (impingement løsning 1).
    1. Vejer 20 mg PIND17-bl- PPS35-SH til en 1,5 mL tube.
    2. Tilføje hydrofobe farvestoffer (fxDiI, regeringskonferencen), narkotika (fxrapamycin) eller anden last.
      Bemærk: Last kan være tør eller opløst i vand-blandbar opløsningsmiddel, helst THF. Hvis lasten er uopløselige i THF eller DMF, kan en anden vand-blandbar anvendes, men sparsomt, da polymeren er usandsynligt at blive opløseligt. Mængden af gods, der kan indlæses er afhængig af egenskaberne cargo selv (fx molekylvægt, hydrophobicity, sterisk overvejelser), og bør undersøges på et sag til sag grundlag11,12.
    3. Tilsættes 500 µL af 100% THF polymer og fragt, vortex energisk at opløse.
  3. Opløse hydrofile last i vandig buffer (impingement løsning 2). For dette, opløse hydrofile ladningen skal lastes inden for polymer vesikler i 500 µL af en vandig buffer (fx fosfatbufferet saltvand, rent vand, osv.), efter behov.
  4. Tilføje buffer til reservoir.
    1. Tilføje 2,5 mL af en vandig buffer af valg (fx 1 x fosfatbufferet saltopløsning) til en passende størrelse reservoir (f.eks. et 20 mL glas scintillation hætteglas). Placer reservoir under CIJ mixer, sådan udstrømning fra mixeren direkte ind i reservoiret.
  5. Indlæse impingement løsninger i separate 1 mL plastic engangsbrug sprøjter.
  6. Kollidere løsninger mod hinanden samtidig danne nanostrukturer og indlæse dem med nyttelast.
    1. Indsæt sprøjter i Luer-lock adaptere på toppen af CIJ mixer.
    2. I en enkelt, jævn og hurtig bevægelse, trykkes begge sprøjter samtidigt og med samme kraft.
      Bemærk: Hvis udfører flere sekventiel impingements, først indsamle udstrømning i en tom reservoir.
    3. (Valgfrit) Udføre flere impingements. Split spirende nanostrukturer løsning mellem to sprøjter, og Gentag trin 2.6.1-2.6.2 op til 4 gange mere.
    4. Indsamle udstrømning i vandig buffer-fyldt beholderen forberedt i 2.4.1 og forsigtigt røre for at sikre blanding.
  7. Fjerne aflæsset fragt og organisk opløsningsmiddel.
    1. (Mulighed 1) Dialyze nanocarrier formulering i den samme vandige buffer, der bruges for impingement og i reservoiret, ved hjælp af slanger på en passende MW cutoff i mindst 24 timer med mindst 2 buffer ændringer. Dette kan udføres ved stuetemperatur.
      Bemærk: Nanocarriers vil blive bevaret af slangen med en MW cutoff < 100.000 kDa og kan potentielt opbevares af højere cutoffs så godt. Denne indstilling bevarer sterilitet når de udføres i et BSC, ved hjælp af steril buffer.
    2. (Mulighed 2) Filtrer formulering gennem en størrelse udstødelse eller udblødning/buffer Ionbytterkolonnen (fx Sepharose 6B kolonne) ved hjælp af 1 x PBS som den vandige buffer.
      Bemærk: Denne indstilling bevarer sterilitet når de udføres i et BSC med en kolonne, der har været grundigt steriliseres.
    3. (Option 3) Fjerne flygtige organiske opløsningsmidler ved hjælp af vakuum udtørring natten over.
    4. (Mulighed 4) Filtrer formulering med en tangential flow filtreringssystem ved hjælp af en 50-100 kDa filter på en 20-60 mL/min. strømningshastighed i 15 minutter til 1 time, afhængig af molekylvægt den unencapsulated last bliver renset væk (større gods vil tage længere tid).
  8. (Valgfrit) Koncentrere nanocarrier formulering.
    1. (Mulighed 1) Koncentrere sig ved hjælp af en spin koncentrator system (fx spin kolonne med MW cutoff > 100.000), som anvendes som beskrevet af fabrikanten.
      Bemærk: Nanocarriers skal være genopslemmes mellem spins og kan kræve en række ture til at koncentrere sig ned til ønskede mængde. Spin koncentration kan reducere sterilitet nanocarrier formuleringer.
    2. (Mulighed 2) Reducere lydstyrken ved hjælp af vakuum udtørring.
      Bemærk: Skift er vanskeligt at kontrollere under disse betingelser, og skal sørges for at opretholde osmolaritet før og efter fusionen.
  9. Butik nanocarriers ved 4 ° C for uger til måneder. Før brug efter opbevaring, kort vortex nanocarrier formuleringer.

3. karakterisere Nanocarrier formuleringer

  1. Måle lastning effektivitet
    1. Hvis lasten er fluorescerende eller absorberer kraftigt ved en givet bølgelængde uden for 260-450 nm, måle fluorescens/absorbans ved hjælp af et fluorimeter/Spektrofotometer.
      Bemærk: PIND -bl- PPS absorberer kraftigt fra 260-310 nm og polymersome formuleringer absorbere fra 310-450 nm, hvilket kan komplicere kvantificering af lasten, der absorberer ved en lignende bølgelængde.
    2. Hvis fragt absorberer inden for 260-450 nm rækkevidde og er hydrofile, forstyrre PIND -bl- PPS nanostrukturer ved at tilføje 25 μL af formuleringen, at en tilsvarende mængde af enten 1% H2O2 eller 1% Triton X-100 og efterfølgende adskille og sondre fragt fra polymer absorbans via high-performance væskekromatografi (HPLC) ved hjælp af en størrelse udstødelse kolonne kompatibel med vandig buffere (f.eks. en Sepharose 6B kolonne) 11.
    3. Hvis fragt absorberer inden for 260-450 nm rækkevidde og er opløseligt i THF eller DMF, lyophilize formulering af frysning 100 μL i 1,5 mL plastik rør ved-80 ° C natten over. Derefter placere røret i en glasbeholder vakuum og sted på en lyophilizer. Tillad 24 timer for ingot opstår og efterfølgende re opløses i 50 μL af DMF eller THF før adskillelse og registrering via HPLC.
  2. Foranstaltning nanocarrier størrelse og morfologi
    1. Bruge dynamisk lysspredning (DLS)11 eller nanopartikel tracking analyse13 til at måle nanocarrier størrelse.
      Bemærk: Nanocarriers dannet fra PIND17-bl- PPS35-SH forventes at have en gennemsnitlig diameter mellem 100-200 nm, med en polydispersity indeks < 0,3.
    2. Bestemme nanocarrier morfologi ved hjælp af kryogene transmissions Elektron Mikroskopi (cryoTEM)14.
      Bemærk: Nanocarriers dannet fra PIND17-bl- PPS35-SH forventes at være polymer vesikler (polymersomes) med et tydeligt mærkbare polymere membran og i vid udstrækning kugleform.
  3. (Valgfrit) Test formuleringer for endotoxin
    1. (Mulighed 1) Bruge en celle-baseret analyse for tilstedeværelse af endotoxin, fx rå blå celler eller HEK blå TLR4 celler (Se Tabel af materialer), som beskrevet af fabrikanten, i enten en kvantitativ eller kvalitativ analyse for lipopolysaccharides (LPS)13 .
    2. (Mulighed 2) Bruge en Limulus Amebocyte Lysate (LAL)15 assay kit, som beskrevet af fabrikanten.

4. fabrikation af en højhastigheds sprøjten pumpe til FNP

  1. Fremstil brugerdefinerede apparatkomponenter.
    Bemærk: 3D modeller til bearbejdning af alle brugerdefinerede dele leveres i supplerende materialer.
    1. Maskine, multi-lag instrument chassis fra ¾" akryl plader og samle (Se Supplerende filer 1-5).
      Bemærk: Akryl har dårlig kemisk resistens. Hvis instrumentet skal bruges med skrappe opløsningsmidler, maskine base fra en metal betragtes som egnede til anvendelsen.
    2. 3D print dele med påtrykt polylaktid (PLA) plast.
      1. Udskrive sprøjte udvisning (SE) 2-del apparater: SE del 1 - bageste FNP blok holding transport (figur 5F, grå del; Supplerende fil 6) og SE del 2 - Front udvisning guide (figur 5F, sorte del; Supplerende fil 7). Se supplerende fil 2 for skemaer.
      2. Udskrive infrarød sensor seler (figur 5I, sorte bokse; Supplerende filer 8 og 9).
      3. (Valgfrit) Udskrive dobbelt sprøjte stemplet tandbøjle.
  2. Fastgør instrument chassis lag sammen med M5 hex bolte og tilføje gummifødder i bunden.
  3. Konfigurere en single-board computer med operativsystemets Raspbian GNU/Linux 8,0 (Jessie) (baseret på Linux Debian).
    Bemærk: Software for at drive instrumentet er tilgængelig efter anmodning. Instrument software kildekoden er tilgængelig efter anmodning. Ved modtagelse af zip-fil, hente alle afhængigheder angivet i readme-filen. Denne software indeholder en enkel grafisk brugergrænseflade, der giver mulighed for kontrol over instrument drift, herunder grundlæggende køre parametre (motor hastighed, retning, osv.). Brugere opfordres til at udvide den eksisterende kildekode og brugerdefinerede programmoduler skræddersyet til brug i deres egne eksperimenter. Alle software blev skrevet ved hjælp af Python 2.7.12 og er ikke i øjeblikket kompatibelt med Python 3. RPi, PicoBorgRev, kivy og multiprocessing moduler er udnyttet. Readme-filen indeholder detaljerede oplysninger om software distribution licens.
  4. Installere en 24 V børstet DC motor (figur 5A) og præcision dias (4,5"(114.3 mm) slagtilfælde; 1,27 mm skrue føre) (figur 5 c).
    Bemærk: Den 24 V DC motor bruges her har et RPMmax, jegmax, og fuld belastning drejningsmoment 4,252 RPM, 4,83 A, og ~0.2 N * m, henholdsvis.
    1. (Valgfrit) Placer padding nedenunder motoren til at dæmpe vibrationer under drift.
      Bemærk: Det anbefales, at en 2-3 mm tyk gummi pad er skåret til at passe motor carriage dimensioner af instrument base.
    2. Mount diaset og præcision instrument base.
      1. Fjerne den gevindstang midlertidigt.
      2. Mount diaset med to #8-32 flat maskinskruer.
    3. Mount DC motor til præcision dias ved hjælp af skrue beam kobling (1-1/4" længde) indeholdende 6/16" og 1/4" diameter boringer.
      Bemærk: Afhængigt af akryl anvendes til maskine instrument base lag tykkelse shims kan være nødvendigt at niveau motor og precision dias skakter.
  5. Samle udvisning platform fra metalplader og L-formet hjørne seler (fig. 5 d). Montere uædle metaller platform til glidende platform (knyttet til gevind stang) ved hjælp af #6-32 skruer. Se præcision dias skematisk fastsat af fabrikanten for detaljer om montering begrænsninger.
  6. Samle sprøjte udvisning systemopsætningen.
    1. Vedhæfte lineær bevægelse pude blokke (montering platforme + lineær bevægelse kugleleje) til M8 forkromet rustfrit stål jernbanen (parallel stål skinnerne kan let ses i figur 5).
    2. Tråd skinner gennem lineær skaft guide/støtte og låse skinner. Brug tre vejledninger pr. jernbane. Mount SE del 1 og 2 på pude blokke ved hjælp af M4 maskinskruer.
    3. Løst Deltag SE del 1 og 2 med M8 hex bolte. Konfigurere rummet mellem SE del 1 og 2 med spiralformet trykfjedre dækker hver bolt der er sikret mellem to indad modstående nylon bøsninger (Se figur 5F). Montere disse bøsninger på ydersiden af SE del 1 og sø del 2.
  7. Wire kredsløb (Se figur 6 core ledningsføring diagram)
    1. Tilsluttes I2C/SDA, 3.3 V, motor-controlleren og GND pins ugifte Råd computer.
    2. Tilslut DC motor terminaler til M- og M + blokke af motor controller bord. Tilslut 24 V, 2,5 magt ved levering (figur 5B) til V + og GND blokke af motor controller (controller er indkapslet i en simpel elektronik boks i det endelige design, se figur 5 H).
    3. Tilsluttes de respektive pins på ugifte Råd computer 3V3 og 5V benene bestyrelsens motorisk kontrol. Tilslut SDA- og SCL stifter af motor controller til ben 3 og 5 i enkelt board computer, henholdsvis.
      Bemærk: Kommandoerne udstedes til DC-motor fra en enkelt board computer gennem en motor controller. Omdrejningstal er kontrolleret ved at regulere spændingen over de motor terminaler via pulse bredde modulation. I denne opsætning, den maksimale nuværende kører gennem den 24 V DC-motor (fuld belastning strømstyrke: 4,83 A) er begrænset til 2,5 et af de 24 V strømforsyning. Det anbefales, at den motoriske kredsløb er kablet gennem en normalt lukket (NC) nødstop (figur 5J). Dermed giver et middel til at forstyrre den motoriske kredsløb for at aktivere en grundlæggende nødsituation lukning operation.
    4. Tilslut forreste og bageste infrarød nærhedsfølere (digital afstand sensorer, figur 5I) til RPi GPIO pins 24 og 23, henholdsvis.
      1. Rute sensor ledninger gennem ledningsanlæg i instrument-base.
        Bemærk: IR sensorer er ikke kontakt pausen-beam bevægelsessensorer med et registreringsområde af 2-10 cm.
      2. 4.7.4.2 snap de kablede IR sensorer i 3D-trykt infrarød sensor seler (figur 5I, sorte bokse) og montere på instrument base. Når indstillet korrekt i skinnen, skal sensor ansigt Rage udad fra 14 mm x 7 mm rektangulære åbning af skinnen.
        Bemærk: disse sensor seler kan midlertidigt monteres ved hjælp af Velcro eller klæbemiddel (midlertidig montering er nyttigt at ordentligt justere og optimere IR sensor placering). Alternativt, permanent montere ved at bore små guide huller i instrument base og sikring af seler med M2 skruer.
    5. Tilsluttes 5V, GND, en 7" touchscreen LCD display og vise serielt interface (DSI) stifter af ugifte Råd computer. 7" RPi og LCD display forsamling er vist i figur 5 g.

5. fremstille Polymersomes via FNP ved hjælp af den skræddersyede højhastigheds sprøjte pumpe

  1. (Mulighed 1) Brug automatisk køre tilstand.
    1. Vælg Auto Run i hovedmenuen. Ordningen vil lynhurtig brugere at lade motoren automatisk placere sprøjte udvisning platform til begyndelsen af diasset præcision. Sikre, at stien foran og bag metalpladen er klar før proceduren.
    2. Indlæse 1 mL plastik sprøjter som beskrevet i afsnit 2.5 og mount sprøjter på de kvindelige Luer stik af CIJ mixer. Indlæse CIJ mixer (med sprøjter fastgjort) i den rektangulære åbning af bageste udvisning transport (Se figur 5E).
    3. Angiv den ønskede omdrejningstal (enheder: rpm) ved hjælp af skyderen i GUI (se note nedenfor for vigtige overvejelser). Den optimale motor hastighed vil afhænge af den specifikke pumpe og setup men skal sikre en gennemstrømningshastighed på mindst 1 mL/s for CIJ mixer kanal dimensioner her.
      Bemærk: Overveje følgende, mens indstillingen strømningshastighed. I den lodrette håndbetjent FNP konfiguration, reaktanter er bortvist fra sprøjter med en sats på ~ 1 mL/s, men kan være meget varierende når hånd drevet. Dette er simpelthen strømningshastigheden gennem sprøjte tønde, som er kontrolleret af den hastighed, hvormed brugeren forskud sprøjte stemplet. Bemærk, at 1 mL/s er ikke henvise til strømningshastighed exit fra mindre diameter dysen. På ovenstående angivet kanal dimensioner, ~ 1 mL/s bør opretholdes for at sikre en passende Reynolds tal for turbulent blanding10. Forskellige strømningshastigheder kan bruges, så længe kanalen diameter er tilpasset i overensstemmelse hermed for at bevare en Reynolds tal, der understøtter turbulente forhold. Sprøjte stemplerne er avancerede af en vinkelret metal plade, som bevæger sig langs en høj præcision aluminium dias koblet til 24 V børstet DC motor. I denne konfiguration, den maksimale tønde flow er påvirket af en række faktorer, herunder (1) den maksimale omdrejningstal (4,252 omdr. / min.) og skrue føringen af præcision-dias (1,27 mm) der er koblet til motoren aksel (2) drejningsmoment på motoren (~0.2 N * m af fuld-l oad drejningsmoment), som er nødvendig for at overvinde modstand mod flow (3) modtryk bidrag fra væske ind i eller forlader CIJ mixer, og (4) styrken af sprøjter anvendes (brugere bør være opmærksomme på de kræfter, der handler på sprøjter og bruge sprøjter af passende styrke). Vedrørende punkt (2), når stigende flow er hastighed tilstrækkelig drejningsmoment forpligtet til at undgå stalling motoren samtidig opretholde steady udvisning under stigende modtryk. Tønde strømningshastigheder – til at illustrere den tønde flow Vurder, at ovennævnte systemet kan nå, overveje sagen hvor FNP udføres ved hjælp af reaktanter indlæses i to en-milliliter sprøjter. For at opnå en 1 mL/s flow skal sats gennem tønde, motoren forhånd metalpladen afstanden defineret af stemplet længde (~ 68 mm for en typisk én mL sprøjte) på ét sekund. Forudsat 1,27 mm skrue føringen af diasset præcision, det følger heraf, at en DC motor opererer ved 4,252 rpm er i stand til at avancere platformen op til ~ 90 mm/s (71 rev/s * 1,27 mm/rev). Dette svarer til en tønde flow ~1.3 mL/s, som overstiger 1 mL/s målbeløbet.
    4. Inden du kører instrumentet, indskrive den ordning for at sikre de der vejen for platformen er ryddet for forhindringer, og at de forreste og bageste IR nærhed detektorer er ryddet for forhindringer (IR sensorer er de små sorte bokse nær præcision dias terminaler; Se figur 5I). Også sikre at kapillær slanger outlet fra CIJ mixer dirigeres ind i en passende samling container (ex: glas bægerglas, osv.).
    5. For at udvise reaktanter fra sprøjter og til CIJ mixer, skal du trykke på knappen Kør i software interfacet.
  2. (Mulighed 2) Brug manuelle kørselstilstand. Henvise til Auto køre tilstand anvisningerne ovenfor og Bemærk følgende ændringer for at øge 5.1.5: tryk fremad-knappen trykket kontinuerligt gennem færdiggørelse af run (dvs. platformen forskud som svar på hændelsen på tryk, og motoren vil stoppe i svar på en hændelse, om frigivelse).
  3. (Option 3) Bruge manuel platform positionering tilstand; denne tilstand tillader brugernes hen til holdning platformen af kører motoren ved lav hastighed (20% effekt) som reaktion på knapperne fremad og omvendt på software interfacet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her har vi præsenteret en enkel protokol for formuleringen af nanocarriers i stand til lastning hydrofile og hydrofobe fragt, der er sikre for i vivo mus og primat administration11,13. Vi har også inkluderet en detaljeret protokol for syntesen af polymeren bruges i vores repræsentative resultater, samt en beskrivelse af fabrikation af en brugerdefineret instrument for den mekanisk styrede impingement løsninger i CIJ mixer. Figur 1 indeholder en oversigt over de sammenfattende trin udføres for at producere PIND17-bl- PPS35-SH, diblock copolymer anvendes til selv samle polymersome nanocarriers. En oversigt over FNP protokol for montage PLØK-bl-PPS polymersomes fyldt med therapeutics og/eller tænkelig agenter er diagramed i figur 2. Polymeren blev berørt i en CIJ mixer (skematiske vist i figur 3a, oprindeligt beskrevet i 10) til at danne monodisperse polymersomes som den samlede morfologi, som kan være godkendt af dynamiske lys spredning (DLS) og kryogene transmissions elektronmikroskopi (cryoTEM) (figur 3b-3 c). Polymersomes dannet af FNP blive mindre (figur 3d) og flere monodisperse (figur 3e) med efterfølgende impingements, og kan være belastet med hydrofile og hydrofobe last (f.eks. gjorde lipofile farvestof, lille molekyle Therapeutics, protein osv.; Figur 4a). Nanocarriers dannet under sterile forhold beskrevet ovenfor er endotoxin gratis af både rå blå og LAL endotoxin assays og dermed egnet til en bred vifte af in vitro- og i vivo applikationer (figur 4b, data ikke vist).

Endelig har vi konstrueret og fremstillet et instrument til mekanisk-kontrol strømningshastigheden og deraf følgende impingement løsninger i CIJ mixer (figur 5). Oprettelsen af dette instrument er væsentlige, som kommercielt tilgængelige sprøjte pumper ikke kan opnå strømningshastigheder til FNP. Med undtagelse af brugerdefinerede ændringer har kommercielt tilgængelige sprøjte pumper hastighedsbegrænsninger af deres brug af lav hastighed steppermotorer, som er designet til at pålideligt dispensere væske i en langsom og støt måde. I vores instrument, er reaktanter udvisning kontrolleret af en præcision dias under kontrol af en 24 V børstet DC-motor, som kan opnå meget større hastigheder (4,252 rpm) end de langsomme steppermotorer fundet i kommercielle sprøjte pumper. Brugerdefinerede software, der kører på en enkelt computer bruges til at betjene instrument (figur 6). 2D-tegninger har været som supplement til 3D-modeller af delene. Alle tegninger og modeller blev skabt i FreeCAD (open source parametrisk 3D CAD modellering software) til at sikre, at de er meget tilgængeligt til forskersamfundet. Software til betjening af apparatet blev skrevet i Python 2.7.12, giver mulighed for hurtig udvikling af brugerdefinerede FNP procedurer til at sikre ens produktionen af nanocarriers (størrelse, morfologi, osv.). Software til betjening af apparatet vil stilles til rådighed efter anmodning. Brugere skal bemærke, at softwaren ikke er i øjeblikket kompatibelt med Python 3; men dette kan ændre i fremtidige opdateringer. Ved at kontrollere reaktant udvisning sats, eliminerer dette instrument variabel af menneskelige fejl fra hånd-operation.

Figure 1
Figur 1. Sammenfattende skema for syntese af PIND17- bl-PPS36-SH. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Produktion af polymersomes via FNP i en hånd-drevne CIJ mixer. Diagram af dannelsen af polymersomes ved hjælp af FNP. PIND-bl-PPS polymer er opløst i organisk opløsningsmiddel sammen med hydrofobe last og er berørt mod vandigt opløsningsmiddel med opløste hydrofile last. Hurtig blanding sker inden CIJ mixer, og efflux kan være gentagne gange berørt eller lov til at fuldføre dannelsen processen gennem fortynding i et reservoir af vandigt opløsningsmiddel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Karakterisering af polymersomes dannet af FNP. (a) Design skematisk af CIJ mixer brugt i denne undersøgelse. Alle målinger er i millimeter. (b) størrelse distribution af polymersomes dannet af FNP efter 1-5 impingements, målt af DLS. n = 6 formuleringer, middelværdi af stikprøver gengivelsesegenskaberne. (c) eksempel cryoTEM billeder af polymersomes dannet efter 1-5 impingements gennem CIJ mixer, skalere bar = 100 nm. Diameter (d) og polydispersity indeks (e) af polymersomes dannet af FNP, målt af DLS. Til sammenligning, polymersomes dannet af tynde film rehydrering, med (TF-E) eller uden (TF-NE) efterfølgende ekstrudering, og dannet af opløsningsmiddel spredningen (SD) blev også afmålt, n = 3, fejllinjer repræsenterer standardafvigelse. Subfigures (c)-(e) taget med tilladelse fra Allen et al. 11. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Indlæsning af effektivitet og endotoxin karakterisering. (a) Loading effektivitet af små og makromolekyler inden for polymersomes, n = 3, fejllinjer repræsenterer standardafvigelse. (b) rå blå LP'ER analysen af polymersomes dannet af sterile FNP, n = 6, fejllinjer repræsenterer standardafvigelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5. Instrument til mekanisk bekæmpelse af løsning impingement i CIJ mixer. (a) 24 V børstet DC Motor. (b) strømforsyning (24 V, 2,5 et). (c) 4,5" slagtilfælde præcision dias med 1,27 mm skrue bly (forbundet til motorakslen ved en skrue beam kobling). (d) udvisning platform bygget fra rektangulære metalplader og L-formet hjørne seler. (e) CIJ mixer. (f) udvisning transport. (g) enkelt board computer og 7" touchscreen. (h) mMotor kontrol bord indkapslet i plast boliger (83 mm x 53 mm x 35 mm). (i) IR sensorer (ikke-kontakt pause-beam bevægelse sensor). (j) nødsituation stopknappen (NC). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6. Core ledningsdiagrammet. De primære forbindelser mellem ugifte Råd computer, motor controller og IR sensorer vises. LCD touchscreen forbindelser ikke vises her, da denne komponent er ikke-væsentlige (brugere kan vælge at bruge en standardcomputerskærm og musen i stedet). Bemærk, at i den viste konfiguration, den 24 V motor strømforsyning og enkelt board computer strømforsyning er separat. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har givet detaljerede instruktioner til den hurtige fabrikation af polymersomes ved hjælp af PIND17-bl- PPS35-SH som diblock copolymer. Vesikulær polymersomes er den primære samlede morfologi samlet på dette forhold på hydrofile PIND og hydrofobe PPS blok molekylvægt. Når berørt flere gange, de har en diameter og polydispersity, der matcher polymersomes ekstruderet gennem en 200 nm membran efter at være blevet dannet via tyndfilm hydrering. Denne protokol eliminerer dermed behovet for yderligere ekstrudering trin under fabrikation af monodisperse polymersome nanocarriers. Polymersomes dannet via FNP indlæse hydrofile og hydrofobe fragt, og fastholde bioactivity af disse molekyler gennem formulering proces11. Supplerende protokoller er beskrevet til at sikre, at steriliteten nødvendigt giver dannelse af polymersome formuleringer, der er endotoxin-fri og dermed egnet til biokemiske og immunologiske assays samt sikkert for administration in vivo . Håndbetjent CIJ mixer er enkel at sætte op og giver lethed-i-hjælp til brugeren, men introducerer potentielle kvalitetskontrol problemer på grund af brugeren variabilitet. For at opretholde strømmen konsistens, søgte vi at skabe et instrument, der kan opnås og reproducerbar fastholdes en sammenlignelig strømningshastighed. Vigtigere, på ovenstående angivet kanal dimensioner, kommercielle sprøjte pumper ikke kan opnå tilstrækkelig høj strømningshastigheder (~ 1 mL/s) på grund af at være udstyret med lav hastighed steppermotorer. At bekæmpe dette problem, og at yde større kontrol over flowet, blev fabrikation af en højhastigheds sprøjten pumpe til FNP beskrevet. Omhu at udnytte open source og nemt tilpasses softwaren til system OS og kode.

Kontrol over alternative strømningshastigheder tilbyder mulighed for at finjustere nanocarrier formuleringen og giver muligheder for at yderligere udforske samling af forskelligartede nanocarrier morfologier. Reynolds tal og tilsvarende blanding tid var tidligere vist sig at påvirke størrelsen af solid core nanocarriers dannet via FNP9, men det er ikke klart, hvilken betydning det ville have på dannelsen af polymersomes. Dette er et emne af aktuel undersøgelse, med den nuværende anbefalede dosis er 0,5 til 2 mL/s, med de repræsentative resultater udføres på ca. 1 mL/s. For at øge kontrol over strømningshastighed endnu, kan det være nødvendigt at erstatte den Linux-baseret OS med real-time kontrol over sprøjten pumpe motor.

Bortset fra justering strømningshastighed, er der en række måder denne FNP protokol kan ændres til suite særlige behov eller programmer. Mindre eller større mængder af polymer kan bruges. Koncentrationer som lavt som 1 mg/mL og så højt som 100 mg/mL er blevet brugt til at danne stabile nanocarriers. Større mængder kan anvendes for impingement, selv om konsekvent anvendelse af pres under hånd-drevne FNP er vanskeligere i mængder større end 1 mL per sprøjte. Mængden af reservoiret kan også ændres. Endelig økologisk: vandigt opløsningsmiddel nøgletal på mere end 1:3 kan resultere i ufuldstændig dannelsen af nanocarriers, og som sådan pleje bør tages ikke fald omfanget af reservoiret uden bekræfter dannelsen af nanocarriers. Sammenlægning kan opstå, når du forsøger at indlæse høje koncentrationer af hydrofobe last, som generelt kan afhjælpes ved at øge kindtand forholdet mellem polymer: Last.

En yderligere emne åbner for udforskning er en yderligere udvidelse af FNP polymersome dannelse til også at omfatte andre polymer systemer ud over PIND -bl-PPS. Andre systemer har faktisk tidligere benyttet i dannelsen af micelles og solid core drug nanocarriers16,17. Det er imidlertid ikke klart, om der er et sæt af parametre, der kan føre til dannelsen af polymersomes via FNP bruger disse andre polymer systemer. I betragtning af antallet af potentielle variabler til at udforske, er det helt muligt, at andre polymerer kan danne polymersomes eller andre bløde nanoarchitectures via FNP med justerede eksperimentelle parametre, såsom strømningshastighed, temperatur, opløsningsmiddel udvalg og polymer koncentration.

Som med alle formulering teknikker, der er begrænsninger for FNP og begrænsninger, der kan gøre visse programmer uholdbar. Hurtig miksningen kræver, at de økologiske og vandig opløsningsmidler er blandbar, som er til hinder for anvendelsen af visse fælles opløsningsmidler anvendes til opløsningen af mange diblock Copolymerer, f.eks., dichlormethan og chloroform. Nogle polymerer kan derfor gengives uforenelig med FNP, hvis de ikke er stand til at blive opløst i en vand-blandbar organisk opløsningsmiddel. FNP protokollen beskrevet her udnytter en 1:1 ratio af økologisk til vandigt opløsningsmiddel, som kan nedsætte aktiviteten af nyttelast følsomme over for høje koncentrationer af organiske opløsningsmidler, såsom nogle bioaktive proteiner. Det skal bemærkes, at påvirkninger på bioactivity vil afhænge af proteinet, som vi har tidligere fundet minimal indvirkning på den enzymatiske aktivitet af alkalisk fosfatase efter lastning inden for polymersomes af FNP11. Multi inlet vortex blandere18 er en dyrere men mere tilpasselig FNP-platform, der giver yderligere styring over forholdet mellem organisk til vandige opløsningsmidler, tilbyder en alsidig alternativ til CIJ blandere for disse sammenhænge.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi anerkender personale og instrumentation støtte fra strukturel biologi anlægget ved Northwestern University. Støtte fra R.H. Lurie omfattende Cancer Center i det nordvestlige Universitet og Northwestern University strukturel biologi faciliteter er anerkendt. Gatan K2 direkte elektron detektor blev købt med midler fra Chicago biomedicinsk konsortiet med støtte fra Searle midler på The Chicago Fællesskabet Trust. Vi takker også følgende faciliteter på Northwestern University: Keck tværfaglige overflade videnskab facilitet, strukturel biologi faciliteten, den biologiske Imaging facilitet, Center for avanceret Molekylær Imaging og analytisk Bionanotechnology udstyr kerne. Denne forskning blev støttet af National Science Foundation grant 1453576, nationale institutter for Health direktør ny Innovator pris 1DP2HL132390-01, Center for regenerativ Nanomedicin katalysator Award og 2014 McCormick katalysator Award. SDA var delvist understøttet af NIH predoctoral bioteknologi uddannelse Grant T32GM008449.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate Starter Kit - 32 GB Edition CanaKit UPC 682710991511
Linear Bearing Platform (Small) - 8mm Diameter Adafruit 1179
Linear Motion 8 mm Shaft, 330 mm Length, Chrome Plated, Case Hardened, Metric VXB kit11868
Linear Rail Shaft Guide/Support - 8 mm Diameter Adafruit 1182
Manual-Position Precision Slide 4.5" Stroke, 15 lb load capacity McMaster-Carr 5236A16
MTPM-P10-1JK43 Iron Horse DC motor Iron Horse MTPM-P10-1JK43
Official Raspberry Pi Foundation 7" Touchscreen LCD Display Raspberry Pi B0153R2A9I (ASIN)
PicoBorg Reverse - Advanced motor control for Raspberry Pi PiBorg BURN-0011
Pololu Carrier with Sharp GP2Y0D810Z0F Digital Distance Sensor 10cm Pololu 1134
Ruland PSR16-5-4-A Set Screw Beam Coupling, Polished Aluminum, Inch, 5/16" Bore A Diameter, 1/4" Bore B Diameter, 1" OD, 1-1/4" Length, 44 lb-in Nominal Torque Ruland PSR16-5-4-A
Polyethylene glycol monomethyl ether Sigma Aldrich 202495
Methanesulfonyl chloride Sigma Aldrich 471259
Toluene Sigma Aldrich 179418
Toluene, Anhydrous Sigma Aldrich 244511
Triethylamine Sigma Aldrich T0886
Celite 545 (Diatomaceous Earth) Sigma Aldrich 419931
Dichloromethane Sigma Aldrich 320269
Diethyl ether Sigma Aldrich 296082
N,N-Dimethylformamide, anhydrous Sigma Aldrich 227056
Potassium carbonate Sigma Aldrich 791776
Thioacetic acid Sigma Aldrich T30805
Tetrahydrofuran Sigma Aldrich 360589
Aluminum oxide, neutral, activated, Brockmann I Sigma Aldrich 199974
Sodium methoxide solution, 0.5 M in methanol Sigma Aldrich 403067
Propylene sulfide Sigma Aldrich P53209
Acetic acid Sigma Aldrich A6283
Methanol Sigma Aldrich 320390
Sodium hydroxide solution 1.0 N Sigma Aldrich S2770
Endotoxin-free water GE Healthcare Life Sciences SH30529.01
Paper pH strips Fisher Scientific 13-640-508
Endotoxin-free Dulbecco's PBS Sigma Aldrich TMS-012
Borosilicate glass scintillation vials Fisher Scientific 03-337-4
1 mL all-plastic syringe Thermo Scientific S75101
Sepharose CL-6B Sigma Aldrich CL6B200
Liquid chromatography column Sigma Aldrich C4169
CIJ mixer, HDPE Custom
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
Hydrogen peroxide solution Sigma Aldrich 216763
HEK-Blue hTLR4 InvivoGen hkb-htlr4
RAW-Blue Cells InvivoGen raw-sp
QUANTI-Blue InvivoGen rep-qb1
PYROGENT Gel Clot LAL Assays Lonza N183-125

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stano, A., Scott, E. A., Dane, K. Y., Swartz, M. A., Hubbell, J. A. Tunable T cell immunity towards a protein antigen using polymersomes vs. solid-core nanoparticles. Biomaterials. 34 (17), 4339-4346 (2013).
  2. Discher, B. M., et al. Polymersomes: tough vesicles made from diblock copolymers. Science. 284 (5417), 1143-1146 (1999).
  3. Vasdekis, A. E., Scott, E. A., O'Neil, C. P., Psaltis, D., Hubbell, J. A. Precision intracellular delivery based on optofluidic polymersome rupture. ACS Nano. 6 (9), 7850-7857 (2012).
  4. Yi, S., et al. Tailoring Nanostructure Morphology for Enhanced Targeting of Dendritic Cells in Atherosclerosis. ACS Nano. 10 (12), 11290-11303 (2016).
  5. Shum, H. C., Kim, J. W., Weitz, D. A. Microfluidic fabrication of monodisperse biocompatible and biodegradable polymersomes with controlled permeability. Journal of the American Chemical Society. 130 (29), 9543-9549 (2008).
  6. Pessi, J., et al. Microfluidics-assisted engineering of polymeric microcapsules with high encapsulation efficiency for protein drug delivery. International Journal of Pharmaceutics. 472 (1-2), 82-87 (2014).
  7. O'Neil, C. P., Suzuki, T., Demurtas, D., Finka, A., Hubbell, J. A. A novel method for the encapsulation of biomolecules into polymersomes via direct hydration. Langmuir. 25 (16), 9025-9029 (2009).
  8. Saad, W. S., Prud'homme, R. K. Principles of nanoparticle formation by flash nanoprecipitation. Nano Today. 11 (2), 212-227 (2016).
  9. Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Mechanism for rapid self-assembly of block copolymer nanoparticles. Physical Review Letters. 91 (11), 118302 (2003).
  10. Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).
  11. Allen, S., Osorio, O., Liu, Y. G., Scott, E. Facile assembly and loading of theranostic polymersomes via multi-impingement flash nanoprecipitation. Journal of Controlled Release. 262, 91-103 (2017).
  12. Bobbala, S., Allen, S. D., Scott, E. A. Flash nanoprecipitation permits versatile assembly and loading of polymeric bicontinuous cubic nanospheres. Nanoscale. 10 (11), 5078-5088 (2018).
  13. Allen, S. D., et al. Polymersomes scalably fabricated via flash nanoprecipitation are non-toxic in non-human primates and associate with leukocytes in the spleen and kidney following intravenous administration. Nano Research. , (2018).
  14. Karabin, N. B., et al. Sustained micellar delivery via inducible transitions in nanostructure morphology. Nature Communications. 9 (1), 624 (2018).
  15. Mascoli, C. C., Weary, M. E. Limulus amebocyte lysate (LAL) test for detecting pyrogens in parenteral injectable products and medical devices: advantages to manufacturers and regulatory officials. Journal of the Parenteral Drug Association. 33 (2), 81-95 (1979).
  16. Pustulka, K. M., et al. Flash nanoprecipitation: particle structure and stability. Molecular Pharmaceutics. 10 (11), 4367-4377 (2013).
  17. Tang, C., Amin, D., Messersmith, P. B., Anthony, J. E., Prud'homme, R. K. Polymer directed self-assembly of pH-responsive antioxidant nanoparticles. Langmuir. 31 (12), 3612-3620 (2015).
  18. Gindy, M. E., Panagiotopoulos, A. Z., Prud'homme, R. K. Composite block copolymer stabilized nanoparticles: simultaneous encapsulation of organic actives and inorganic nanostructures. Langmuir. 24 (1), 83-90 (2008).

Tags

Bioteknologi spørgsmålet 138 nanomateriale nanocarrier biomateriale kontrolleret levering samlesæt flash nanoprecipitation fabrikation polymer blokere copolymer
Hurtig og skalerbar forsamling og læsning af bioaktive proteiner og immunostimulanter i forskellige syntetiske Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Allen, S., Vincent, M., Scott, E.… More

Allen, S., Vincent, M., Scott, E. Rapid, Scalable Assembly and Loading of Bioactive Proteins and Immunostimulants into Diverse Synthetic Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation. J. Vis. Exp. (138), e57793, doi:10.3791/57793 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter