Summary
ナノ材料基礎科学と並進アプリケーション制御治療薬デリバリーの汎用性の高いメカニズムを提供するが、頻繁に彼らの作製最も生物医学研究所で利用されていない専門知識が必要があります。ここでは、スケーラブルな製造およびフラッシュ nanoprecipitation を使用して多様な片岡の治療読み込み用のプロトコルを提案する.
Abstract
ナノ材料は、幅広い治療や画像アプリケーションに単一および結合された分子ペイロードの制御された配信をカスタマイズするためのオプションを提示します。この高められた特定性は、高い効力低下の副作用と低用量を含む、重要な臨床的意義を持つことができます。また、ターゲットにその場で特定の細胞のサブセットの変調、基本的な生命現象のin vitroとin vivoの調査を強化できます、細胞機能をプローブします。ナノスケール科学、化学および多くの場合エンジニア リングに必要な専門知識が製造から彼らの調査のためのツール、またはのための車としてナノ材料をカスタマイズするこれらの分野での経験のない所を禁止する残念なことに、治療戦略。ここでは、合成と安易な形成を受けやすい汎用性の高い非毒性ブロック共重合体システムのスケーラブルなアセンブリおよび医用ナノ車のロード用プロトコルを提供します。フラッシュ nanoprecipitation は poly(ethylene glycol)-blから多様なナノキャリアの迅速な製造のための方法論として提示-ポリ (プロピレング硫化) 共重合体。これらのプロトコルは、幅広い専門知識とリソースを持つ所を簡単にできるように、再現性をもって、アプリケーションの高度なナノキャリア システムを作製します。デザインとフラッシュ nanoprecipitation を容易にする高速シリンジ ポンプを採用している自動機器の建設プロセスし、均一性の制御を強化できるように、サイズ、形態、polymersome ナノキャリアの読み込み、説明します。
Introduction
ナノキャリアは、小さな、高分子化合物の貨物の管理された配信などアクティブなエンティティされていない場合、そのカプセル化、高分解性や生体の管理にも疎水性になります。定期的に作製したナノキャリア形態の高分子ベシクル (polymersomes とも呼ばれます) リポソームに似ていますは親水性と疎水性の貨物1,2を同時にロードする機能を提供します。その有望な利点にもかかわらず polymersomes ではまだ珍しい臨床応用により、一部、製造のいくつかの重要課題に。臨床用 polymersome 製剤、無菌、大規模な一貫したバッチで行われる必要があります。
Poly(ethylene glycol)-ブロックなど、ブロック共重合体からフォーム polymersomes にさまざまな技術を使用ことができます-ポリ (プロピレング硫化) (ペグ-bl- PPS)、溶剤分散3、薄膜水分補給1を含む,4マイクロ5,6、および直接水和法7。溶剤分散には、タンパク質のようないくつかの生理活性のペイロードを変性が有機溶剤存在下で長いインキュベーション時間が含まれます。薄膜水分補給は、しばしば受け入れ状単分散を達成するために高価で時間のかかる押出し技術が必要な形成された polymersomes の分散制御を提供していません。さらに、流体と直接水和法は、大量生産のためにスケールしにくい。異なるナノキャリア作製方法のフラッシュ nanoprecipitation (FNP) は大規模かつ再現性のある製剤8,9,10を作成する機能を提供しています。私たちの研究室は最近に一貫性のある多様なペグ -bl- PPS ナノ構造形態11,形成を含める FNP の使用を拡大して FNP 以前ソリッドコア ナノ粒子の形成のために予約中、12、polymersomes11とキュービック ナノスフェア12を含みます。FNP が薄膜水分補給と溶媒分散によって形成される非押し出し polymersomes に比べて優れた分散インデックス値の結果に押し出しを必要とせず polymersomes の単分散製剤を形成できることがわかった11. キュービック ナノスフェア, 彼らの大きな疎水性領域とは FNP12溶媒条件の番号の下の形成にもかかわらず、薄膜水分補給によって形成されることができませんでした。
ここでは、我々 はbl- PPS ジブロック共重合体 polymersome 形成で使用されるペグの合成のための詳細な説明を提供し、FNP、FNP に使用される限られた衝突噴流 (CIJ) ミキサー プロトコル自体、および自動システムの実装ユーザーの可変性を減らします。滅菌システムを十分にエンドトキシン配合体内の使用、および polymersomes FNP によって形成された特性に関する代表的なデータを生成する方法については、含まれています。この情報は、polymersomesの in vitroとin vivoの仕事のための利用に関心を持つ読者は、独自の滅菌は、単分散製剤を作製することになります。ナノキャリア製剤、高分子合成専門知識経験を持つ読者は FNP を使用して、現在の製剤化技術の潜在的な代替として、独自のポリマー システムを迅速にテストすることができます。さらに、ナノテクノロジー研究所コースにナノキャリアの定式化の教育ツールとして記載プロトコルは使用可能性があります。
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Protocol
1. Poly(ethylene glycol)-ブロックの合成-ポリ (プロピレング硫化)-チオール
- Poly(ethylene glycol) 酸の合成 (Mn: 750) (MeO ペグ17-Ms、私)。
- 600 rpm で磁気攪拌下の MeO ペグ17- オハイオ州 (RBF) 3 首丸底フラスコ内で 100% トルエン 200 mL で 10 g を溶解します。
- 3 首 RBF を自体はコンデンサーに接続されているディーン ・ スターク装置に接続し、不活性ガス下で全体のシステムを保つ窒素またはアルゴン。
- オイルバス、熱を 600 rpm で攪拌しながら 165 ° C で 3 首 RBF を配置します。
- 微量水分と 100 mL のトルエン共沸蒸留を使用して削除します。
- 油から 3 首 RBF を削除、不活性ガス条件を維持しながらディーン ・ スターク装置を外し、部屋の温度に冷却すること。
- 5.6 mL 100% トリエチルアミン (3 臼歯式)、無水 100% トルエン 300 mL を 600 rpm で攪拌しながら MeO ペグ17- オハイオ州ソリューションに追加します。
- 3 首 RBF を氷浴に移動、攪拌で 600 rpm と不活性ガス雰囲気を維持します。
- 100% のトルエンの 30 mL で 100 %methanesulfonyl 塩化 (3 臼歯式) の 3.1 mL を希釈、ゆっくりと 600 rpm で攪拌しながら添加漏斗を介して 3 首 RBF を追加します。
- 不活性の条件の下で室温で 600 rpm で一晩撹拌します。
- 珪藻土満載ブフナーを介してフィルター ソリューション (材料の表を参照) 塩を削除します。
- 40 ° C で 120 rpm で 50-100 ミリバールの間に設定圧力回転に設定水浴をロータリーエバポレーターでトルエンを削除します。
- 200 ml 100% ジクロロ メタン (DCM) の製品を再溶解し、珪藻土満載ブフナーを介してフィルター (材料の表を参照してください)。
- 回転蒸発器を介して 40 ° C、回転で 120 rpm と 450 600 ミリバールの間に設定圧に設定水浴と DCM を削除します。
- 控えめに再 100 %dcm で製品を溶解し、ゆっくりと冷えた 100% ジエチル エーテルの 500 mL を滴下 (パスツール ピペット) を介して追加することによって製品を沈殿させます。300 rpm で攪拌を維持します。
- デカントまたは沈殿製品、MeO ペグ17からジエチル エーテルを削除する吸引 - メシル酸と完全に乾燥する真空デシケータで一晩ストア。
- すぐに製品を使用または-20 ° C で不活性ガス下で数ヶ月間保存します。
- Poly(ethylene glycol) thioacetate (MeO ペグ17-TA、 II) を合成します。
- MeO ペグ17-Ms (I) 3 首 RBF の 100% 無水ジメチルホルムアミド (DMF) の 200 mL に 5 g を分解、不活性ガス下で室温で 600 rpm で攪拌します。
- 100% 炭酸カリウム (3 臼歯式) の 2.5 g を追加すると、ソリューションを攪拌します。
注: 炭酸カリウム、ない完全に溶液中で溶解します。 - 100% の 100 mL で 100% チオ酢酸 (3 臼歯式) の 1.3 mL を希釈無水 DMF、滴下添加漏斗を介してソリューションに追加します。
注: チオ酸は強い、不愉快な臭気を持っています。処分や清掃の前に一晩化学発煙のフード内のすべての汚されたオブジェクトを維持するには、注意が必要です。 - 積極的にかき混ぜる (600 以上の rpm) は室温で一晩します。
注: 塩の形成は、このソリューションの攪拌に簡単に影響を及ぼし。一晩攪拌を維持するために注意する必要があります。 - 珪藻土満載ブフナーを介してフィルター ソリューション (材料の表を参照してください)。
- 風呂の水で 120 rpm と 5-15 ミリバールの間に設定圧力回転 60 ° C に設定回転蒸発器を介して DMF を削除します。
- 100% テトラヒドロ フラン (THF) 100 mL で製品を溶解し、赤/オレンジ色の不純物を除去する中性アルミナを充填したカラムに追加します。
- 40 ° C で 120 rpm で 200-300 ミリバールの間に設定圧力回転に設定水浴を回転蒸発器を介して THF を削除します。
- 控えめに製品 100 %dcm で再溶解します。塩の沈殿物を形成するかどうか、6 μ m 孔サイズろ紙ブフナーを使用してを介してフィルター ソリューション。
- ゆっくりと冷えた 100% ジエチル エーテル、300 rpm で攪拌の 500 mL にパスツール ピペットで滴下を追加して製品を沈殿させます。ジエチル エーテルはさらに底冷えがする-20 ° C 防爆冷凍庫で数時間沈殿物がクラッシュしない場合する必要があります 4 ° C でのソリューションのうち
- デカントまたは沈殿製品、meo 画像-PEG17-Thioacetate からジエチル エーテルを削除するを吸引します。真空デシケータ内とその後-20 ° C で不活性ガス下で一晩保管します。
- ジブロック共重合体 poly(ethylene glycol)-ブロック-poly(propylene sulfide)-チオールを合成 (ペグ17-bl- 安35-SH、 III)。
- 100 %10 mL の MeO ペグ17TA (II)を溶かす常温水お風呂で 400 rpm で攪拌しながら、アルゴン中 Schlenk フラスコ内無水 DMF。
- ナトリウムメトキシド (0.5 M 液をメタノール) の 1.1 モル eq 400 rpm で 5 分間攪拌することができますを追加します。
- 急速に、ソリューションに 100% プロピレン硫化の 35 モル eq を追加します。400 rpm で 10 分間攪拌することができます。
- 100% 氷酢酸 10 モル eq を追加、400 rpm で 5 分間攪拌します。
- 風呂の水で 120 rpm と 5-15 ミリバールの間に設定圧力回転 60 ° C に設定回転蒸発器を介して DMF を削除します。
- 100 %dcm で控えめに製品を再溶解、80 mL 2 つ 50 mL コニカル遠沈管の間で分割 100% メタノールで沈殿します。
- 4 ° C で 5 分間 7500 × g で遠心分離機円錐管離れて上清を吸引します。
- ストア製品、ペグ17-bl- 安35-SH、一晩真空デシケータで、-20 ° C で不活性ガス下でその後
2. 組み立てペグ-bl-PPS ナノキャリア Hand-Powered フラッシュ Nanoprecipitation を介して
- (省略可能)閉じ込められた衝突噴流 (CIJ) ミキサーを滅菌します。
- 生物学的安全キャビネット (BSC)、内一晩 0.1 M 水酸化ナトリウムで分解するすべての部分とミキサーが水没します。
- CIJ ミキサーを組み立て直し、ルアーロック注射器を用いたエンドトキシン フリーの水を流れます。
- 水の pH をテストし、中立として pH レジスタまで水の流れ続けます。
- ペグ17-35bl- PPS を溶解-SH ポリマーと THF (衝突解決策 1) 疎水性貨物。
- ペグ17-bl- 安35の 20 mg の重量を量る-SH 1.5 mL チューブに。
- (例えばDiI、ICG)、疎水性の染料を追加薬 (例えばラパマイシン) または他の貨物。
注: 乾燥した、または水混和性溶剤、できれば THF に溶解後、貨物する場合があります。貨物が THF または DMF で水溶性の場合他の水混和性溶剤がのみ使用するが、ポリマーは溶解する可能性があります。読み込むことができる貨物の量は、貨物特性に依存 (例えば分子量、疎水性、立体の考慮事項)、自体、ケースバイ ケース11,12に検討する必要があります。 - 100% を 500 μ l 添加ポリマーと貨物、積極的に溶解する渦に THF。
- 親水性緩衝水溶液 (衝突解決策 2) 貨物を溶解します。これは、必要に応じて (例えば、リン酸緩衝生理食塩水、純粋な水、等) の緩衝水溶液を 500 μ l 添加の高分子ベシクル内でロードする親水性の貨物を解散します。
- 貯水池にバッファーを追加します。
- (例えば、 20 mL バイアル シンチレーション) 適切に大きさで分類された貯水池への選択 (例えば1 x のリン酸緩衝生理食塩水) の緩衝水溶液 2.5 mL を追加します。ミキサーからの流出に直接入る貯水池など CIJ ミキサー下貯留層を配置します。
- 独立した 1 mL プラスチック製の使い捨て注射器に衝突ソリューションを読み込みます。
- 互いに同時にナノ構造を形成し、ペイロードでそれらをロードするソリューションに影響を与えます。
- CIJ ミキサーの上部にルアーロック アダプターに注射器を挿入します。
- 単一、滑らか、かつ迅速な動きで均等に力と同時に両方の注射器を押します。
注: 複数のシーケンシャル impingements を実行している場合はまず空のリザーバーで流出を収集します。 - (省略可能)複数の impingements を実行します。注射器 2 本と 4 回以上まで手順を繰り返します 2.6.1-2.6.2 分割初期ナノ構造ソリューションです。
- 2.4.1 で準備水性バッファーいっぱい貯留層の流出を収集し、混合できるようにゆっくりかき混ぜます。
- アンロードされた貨物および有機溶媒を削除します。
- (オプション 1)少なくとも 2 つのバッファーの変更と、少なくとも 24 時間適切な MW のカットオフのチューブを使用してナノキャリア定式化衝突に使用される同じ水性バッファーおよび貯蔵所を dialyze します。これは、室温で実行できます。
注: ナノキャリアは MW のカットオフ管によって保持される < 100,000 kDa と高いヒューズも保有可能性があります可能性があります。このオプションは、不妊生殖不能のバッファーを使用して BSC で実行されるときを保持します。 - (オプション 2)サイズ排除、脱塩・ バッファー交換カラム (例えばセファローズ 6 b 列) 緩衝水溶液として 1x PBS を使用して定式化をフィルター処理します。
注: このオプションは徹底的に滅菌されている列と BSC で実行されるときは無菌性を維持します。 - (オプション 3)揮発性の有機溶媒を真空乾燥一晩を使用してを削除します。
- (オプション 4)フィルターまで精製されているカプセル化されていない貨物の分子量に応じて、1 時間に 15 分の 20-60 mL/分の流量で 50-100 kDa フィルターを用いた接線流ろ過システムを用いた定式化 (大きな貨物は多少時間かかります)。
- (オプション 1)少なくとも 2 つのバッファーの変更と、少なくとも 24 時間適切な MW のカットオフのチューブを使用してナノキャリア定式化衝突に使用される同じ水性バッファーおよび貯蔵所を dialyze します。これは、室温で実行できます。
- (省略可能)ナノキャリア定式化を集中します。
- (オプション 1)スピン コンセントレーターのシステムを使用して集中 (MW とスピン列などカットオフ > 100,000)、前述の製造元によって使用されます。
注: ナノキャリア スピン間再停止する必要があります、音量に集中する回転数を必要があります。スピン濃度は、ナノキャリア製剤の無菌性を減らすことができます。 - (オプション 2)真空乾燥を使用してボリュームを減らします。
注: ボリュームの変更はこれらの条件の下でコントロールすることは困難と濃度の前後に浸透圧を維持するために注意する必要があります。
- (オプション 1)スピン コンセントレーターのシステムを使用して集中 (MW とスピン列などカットオフ > 100,000)、前述の製造元によって使用されます。
- ヶ月に週間ナノキャリア 4 ° C で保存します。簡潔に渦ナノキャリア製剤保管後使用する前に。
3. ナノキャリア製剤を特徴します。
-
測定効率を読み込み
- 貨物は蛍光灯や 260 450 nm 以外の特定波長に強く吸収、蛍光/分光光度計を用いた蛍光・吸光度を測定します。
注: ペグ-bl- PPS を 260 310 nm から強く吸収し、似たような波長を吸収する貨物の数量を複雑にするかもしれない 310-450 nm から polymersome 製剤を吸収します。 - 貨物は 260-450 nm の波長範囲内に吸収し、親水性、ペグ -bl- PPS ナノ構造を混乱させる 1% H2O2または 1% の等量を定式化の 25 μ L の追加によってトリトン X-100 とその後分離および区別水溶液と互換性のあるサイズ排除カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー (HPLC) による高分子吸光度から貨物をバッファー (例えばセファローズ 6 b 列) 11。
- 貨物は 260-450 nm の波長範囲内に吸収し、THF または DMF で水溶性、-80 ° C で 1.5 mL プラスチック チューブに 100 μ L を一晩凍結による定式化を凍結乾燥します。次にガラス真空容器と、エアカーテンに所定の位置にチューブを置きます。発生し、その後再分離および高速液体クロマトグラフィーによる検出の前に DMF または THF の 50 μ L に溶解して凍結乾燥 24 時間かかります。
- 貨物は蛍光灯や 260 450 nm 以外の特定波長に強く吸収、蛍光/分光光度計を用いた蛍光・吸光度を測定します。
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メジャー ナノキャリア サイズと形態
- ナノキャリアのサイズを測定するのに動的光散乱法 (DL)11またはナノ粒子解析13を追跡を使用します。
注: ペグ17-bl- 安35から形成されるナノキャリア-SH の 100-200 nm の間の平均直径を持っている、多分散性 0.3 < インデックスを付けると予想されます。 - ナノキャリア形態極低温電子顕微鏡 (cryoTEM)14を使用してを決定します。
注: ペグ17-bl- 安35から形成されるナノキャリア-SH の高分子ベシクル (polymersomes) 明らかに認識できる高分子膜とほぼ球形の形にする予定です。
- ナノキャリアのサイズを測定するのに動的光散乱法 (DL)11またはナノ粒子解析13を追跡を使用します。
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(省略可能)内毒素の製剤をテストします。
- (オプション 1)リポ多糖 (LPS)13 の量的、または質的試験で、メーカーによる記述で、エンドトキシンなど生の青色のセルまたは HEK 青い TLR4 セル (材料の表を参照) の存在を細胞ベースのアッセイを使用します。.
- (オプション 2)製造元による記述では、カブトガニ含まライセート (ラル)15アッセイ キットを使用します。
4. FNP の高速シリンジ ポンプの試作
- カスタム機器部品を製造します。
注: すべてのカスタム パーツを加工用の 3 D モデルは、補足資料で提供されます。- ¾」アクリル シートから多層楽器シャーシを加工し、(補助ファイル 1-5を参照) をアセンブルします。
メモ: アクリル プア耐薬品性があります。楽器を過酷な溶剤を使用する場合は、アプリケーションに適したとみなされる金属からベースをマシンします。 - 3 D プリント パーツは、ポリ乳酸 (PLA) プラスチックをプリントしました。
- 注射器追放 (SE) 2 部装置を印刷: SE パート 1 - キャリッジ (図 5 階、灰色の部分を保持している後部 FNP ブロック補足ファイル 6)SE パート 2 - フロント追放ガイド (図 5 階、黒い部分。7 の補足ファイル)。回路図の補足のファイル 2を参照してください。
- 赤外線センサー中括弧 (図 5I、ブラック ボックスを印刷します。8 と 9 の補助ファイル)。
- (省略可能)デュアル ・ シリンジのプランジャー ブレースを印刷します。
- ¾」アクリル シートから多層楽器シャーシを加工し、(補助ファイル 1-5を参照) をアセンブルします。
- M5 六角ボルトと一緒に楽器シャーシ レイヤーを固定し、ベースにゴム足を追加します。
- (Linux の Debian に基づく) Raspbian GNU/Linux 8.0 (ジェシー) オペレーティング システムのシングル ボード コンピューターを構成します。
注: 測定器を操作するためのソフトウェアはリクエストを承ります。計測器ソフトウェア ソース コード リクエストを承ります。Zip 形式のファイルを受信すると、README ファイルで指定されたすべての依存関係をダウンロードします。このソフトウェアには、基本的な実行パラメーター (モーター速度、方向等)を含め、楽器操作制御を可能にするシンプルなグラフィック ユーザー インターフェイスが含まれています。ユーザーが既存のソース コードに展開することを推奨し、独自の実験で使用するプログラム カスタム モジュールに合わせた。すべてのソフトウェアは、Python 2.7.12 を使用して書き込まれ、現在 Python 3 と互換性がありません。RPi、PicoBorgRev、kivy、マルチプロセッシング モジュールが利用されます。README ファイルには、ソフトウェア配布ライセンスに関する詳細な情報が含まれています。 - 24 V DC モータ (図 5 a) と精密スライド (4.5"(114.3 mm) ストローク; リード 1.27 mm ネジ) を磨いた (図 5) をインストールします。
注: ここで使用される 24 V DC モータは、回転数max、私max、および 4,252 rpm, 4.83 A、全負荷トルクと ~0.2 N * m、それぞれ。- (省略可能)操作時の振動を湿らせるモーターの下にスペースを配置します。
注:、2-3 mm 厚のゴム製のパッドが楽器ベースの車両の寸法に合わせてカットをお勧めします。 - 楽器ベースに高精度スライドをマウントします。
- ねじ切りロッドを一時的に削除します。
- #8-32 フラット ビス 2 本を使用してスライドをマウントします。
- 6/16"、1/4" 径を含むねじビーム結合 (1-1/4"長さ) を用いた高精度スライドをマウント DC モータを飽きさせません。
注: 楽器の基本レイヤーの加工に使用されるアクリルの厚さに応じてシムはモーターと精密スライド シャフトのレベルに必要かもしれない。
- (省略可能)操作時の振動を湿らせるモーターの下にスペースを配置します。
- 金属板と L 字の角かっこ (図 5) から除名プラットフォームを組み立てます。卑金属 (ねじ切りロッドに添付) スライディングのプラットフォームにプラットフォームをマウント #6-32 ネジを使用しています。取付制約に関する詳細については、製造元から提供された精密スライドの模式図を参照してください。
- 注射器追放システム セットアップを組み立てます。
- 直線運動枕ブロック (取り付けプラットフォーム + 直線運動軸受) (並列鋼鉄柵容易に観察できます図5) M8 クローム メッキ ステンレス製レールに接続します。
- リニア シャフトを通じてレールにスレッド ガイド/サポート、レールをロックします。レールごと 3 つのガイドを使用します。マウント SE パーツ 1 および 2 M4 ビスを使用して枕ブロックに。
- 緩く SE パーツ 1 および M8 六角ボルト 2 に参加します。SE パート 1 と圧縮コイルばね各ボルトをカバーで保護された 2 つの内側に直面してナイロン ブッシング (参照してください図 5 階) の間と 2 間のスペースを構成します。SE パート 1 と SE パート 2 の外観上これらのブッシングをマウントします。
- ワイヤリング回路 (コア配線図の図 6を参照)
- I2C/SDA は、3.3 V、モーター コント ローラーに接続し、GND ピン シングル ボード コンピューターです。
- M ・ m ブロック モーター コント ローラー ボードの DC モータの端子に接続します。モーター コント ローラーの V + と GND のブロック 24 V、2.5 A 電源 (図 5 b) に接続 (コント ローラーは単純なエレクトロニクス ボックスの最終的なデザインに収め、図 5 Hを参照)。
- モータ コントロール ボードの 3 対 3 や 5 v ピンをシングル ボード コンピューターのそれぞれのピンに接続します。モーター コント ローラーの SDA と SCL ピンをピン 3 と 5 シングル ボード コンピューターのそれぞれ接続します。
注: コマンドは、モーター コント ローラーを介してシングル ボード コンピューターから DC モータに発行されます。モータの回転速度はパルス幅変調を介してモータの端子間電圧を調節することによって制御されます。24 V DC モータを介して最大現在実行この設定で (全負荷アンペア数: 4.83 A) 電源電圧は 24 V で 2.5 A までです。ノーマルク ローズ (NC) 緊急停止 (図 5 j) を介してモータの回路が配線されてそれをお勧めします。そう基本的な緊急時シャット ダウン操作を有効にするモーターの回路を破壊する手段を提供します。 - フロントとリアの赤外線近接センサー (図 5Iデジタル距離センサー) を RPi の GPIO ピン 24、23 にそれぞれ接続します。
- 楽器ベースの導管を介してルート センサー配線。
注: IR センサーは、2 〜 10 cm の検出範囲を持つ非接触休憩ビーム モーション センサーです。 - 4.7.4.2 赤外線センサーの 3 D プリントされた中かっこ (図 5I、ブラック ボックス) に有線の IR センサーと計測器ベースの上にマウントします。ブレースの中に正しく設定した場合、センサーの顔 14 mm x 7 mm の長方形ブレースの開くから外側突出する必要があります。
注: これらのセンサーのブレース一時的にマウントできます Velcro または接着剤を使用して (一時的なマウントは適切に調整し、IR センサーの配置を最適化すると便利)。また、完全に楽器ベースの小さなガイド穴をあけると M2 のネジと、中かっこを確保してマウントします。
- 楽器ベースの導管を介してルート センサー配線。
- 5 v、GND、7"タッチ スクリーン LCD ディスプレイを接続し、シングル ボード コンピューターのシリアル ・ インタ フェース (DSI) ピンを表示します。7"RPi と液晶ディスプレイ アセンブリ図 5に示します。
5. Polymersomes FNP カスタムメイドの高速シリンジ ポンプを使用してを介しての作製します。
- (オプション 1)自動実行モードを使用します。
- メイン メニューから「自動実行」を選択します。高精度スライドの先頭に注射器追放プラットフォームを自動的に配置するモーターを許可するユーザーが要求されます。前に、金属プレートの後ろのパスが先に進む前にクリアを確認します。
- セクション 2.5 で記述として 1 mL プラスチック注射器と CIJ ミキサーのルアーロック メスコネクタにマウント注射器をロードします。リア追放キャリッジの長方形の開口部に (に付すスポイト) CIJ ミキサーをロード (図 5 eを参照してください)。
- 希望のモーターの速度を設定 (単位: rpm) GUI のスライダーを使用して、(重要な考慮事項の下の注を参照)。最適なモーター速度は特定のポンプとセットアップによって異なりますが、ここで提供される CIJ ミキサー チャンネルの寸法のため、少なくとも 1 mL/秒の流量を確保する必要があります。
注: は、設定流量、次を検討してください。垂直の手回しの FNP 構成で、反応は 〜 1 mL の割合で注射器から排出される/s、することができます非常に可変するが、駆動の手。これは、単にそのユーザーの進歩のシリンジのプランジャーは速度によって制御されるシリンジ バレルを通して流量です。1 mL/秒のレートはない小さい径のノズルから出口流量を参照します。上記指定チャンネルの寸法、〜 1 mL/s を整備して適切なレイノルズ数乱流混合10を確保する必要があります。異なる流量は、限りチャネル直径が乱流の条件をサポートしているレイノルズの番号を維持するために調整に使用できます。シリンジのプランジャーは、24 V DC モータのブラシと結合した高精度アルミ スライドに沿って移動、垂直な金属の板によって進められています。この構成では、最大バレル流量の影響は (1) 最大運動速度 (4,252 rpm) を含む要因の数とモーターに結合されて精密スライド (1.27 mm) ねじのリード シャフト (2) モータのトルク (~0.2 N * フル l m普通に親切だったトルク)、流体参入から (3) の背圧の貢献の流れおよび CIJ ミキサーおよび (4) 使用される注射器の強さを終了への抵抗を克服するために必要なユーザー必要があります、注射器に作用する力の留意・の注射器を使用適切な強度)。点 (2)、フローの増加率に十分なトルクがバック プレッシャの中で着実な追放を維持しながら、モーターを滞らせないために必要です。たる流れを説明するために-バレル流量率は前述のシステムが実現する、場合を考えます FNP は反応注射器 1 ミリリットル 2 本に読み込まれるを使用しています。1 mL/秒の流れを達成するためにモーター バレル率は 1 秒間にプランジャーの長さ (~ 68 mm で典型的な 1 mL 注射器) によって定義された距離の金属の板を進める必要があります。精密スライドの 1.27 mm ねじのリード、それ続く 4,252 rpm で動作 DC モータが進化するプラットフォームまでできること提供 〜 90 mm/s (71 回転/秒 * 1.27 mm/回転)。これは、~1.3 mL/秒、1 mL/秒ターゲットを超えるのバレルの流量に対応します。 - 楽器を実行する前に確認のパス、確実にシステム プラットフォームは、障害物のクリアは、前面と背面の IR 近接検知、障害物 (IR センサー、精密スライドの近くの小さいブラック ボックスのクリア端末;図 5 iを見なさい)。また CIJ ミキサーからキャピラリー チューブ コンセントが適切なコレクションのコンテナーにルーティングされたことを確認 (ex: ガラス ビーカー、等)。
- 注射器から、CIJ ミキサーに反応を追放するには、ソフトウェア インターフェイスの [実行] ボタンを押します。
- (オプション 2)手動実行モードを使用します。上記の自動実行モードの指示を参照し、5.1.5 をステップに次の変更に注意してください: [進む] ボタンが (すなわちプラットフォームの進歩、プレスのイベントとモーターへの応答で実行の完了まで継続的に押されたプレス停止されます上のリリース イベントに応答)。
- (オプション 3)位置決めモード手動プラットフォームを使用します。このモードは、ソフトウェア インターフェイスの前方および逆のボタンに応答で低速 (20% 電源) でモータを実行することによって、プラットフォームを配置するユーザーをできます。
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Representative Results
ここでは、我々 は、ナノキャリア親水性と疎水性の貨物をロードすることができる生体内でマウスとヒト以外の霊長類管理11,13は安全の定式化のための単純なプロトコルを提案しました。CIJ ミキサーでソリューションの機械的に制御衝突カスタム装置の製作の説明と共に、当社の代表的な結果で使用されるポリマーの合成のための詳しいプロトコルも含めました。図 1ペグ17-bl- 安35を生成する実行された合成手順の概要を示します-SH、ジブロック共重合体自己 polymersome ナノキャリアを組み立てるために使用します。ペグ bl PPS polymersomes 治療および/またはイメージング エージェントでロードを組み立てるため FNP プロトコルの概要は、図 2のトラスネジです。ポリマーは CIJ ミキサー (図に示されている図 3 a、最初に記載されている10) 集計の形態として単分散 polymersomes を形成する動的光散乱法 (DL) で検証・低温にすることができますに吹きつけた透過型電子顕微鏡 (cryoTEM) (図 3b-3 c)。Polymersomes FNP によって形成される小さい (図 3 d) より径 (図 3e) その後 impingements となり、親水性と疎水性の貨物と読み込まれます (例えば、した小分子で脂溶性色素治療、タンパク質など。図 4 a)。上記の無菌条件下で形成されたナノキャリアがエンドトキシン生青とラルのエンドトキシン アッセイによって自由性 (図 4 bデータは表示されません)の in vitroとin vivoのアプリケーションの広い範囲。
最後に、設計し、構築された流量を機械的に制御する計測器と CIJ ミキサー (図 5) でのソリューションの結果衝突。この楽器の作成は、市販シリンジ ポンプことはできません FNP に必要な流量を達成するために不可欠です。カスタムの変更を除いて市販シリンジ ポンプ確実にゆっくりと着実な方法で流体を分配するために設計された低速ステッピング モーターの使用によって課された速度制限があります。私たちの楽器で反応追放は商業のシリンジ ポンプは、低速のステッピング モーターより 24 V DC モーターは、はるかに大きい速度 (4,252 rpm) を達成することができますを起毛の制御の下で精密スライドによって制御されます。シングル ボード コンピューターで実行されているカスタム ソフトウェアは、楽器 (図 6) を動作するように使用されます。部品の 3 D モデルだけでなく、2 D 図面を提供されています。すべての図面とモデルは、FreeCAD (オープン ソース パラメトリック 3D CAD モデリング ソフトウェア) 高度研究コミュニティにアクセスできることを確認するために作成されました。計測器を操作するためのソフトウェアは、Python 2.7.12、ナノキャリア (サイズ、形態、等) の不調和の生産を確保できるようにカスタム FNP プロシージャの急速な発展のために書かれました。計測器を操作するためのソフトウェアは、リクエストにより利用になります。ユーザーはソフトウェアが Python 3; 現在互換性がないことに注意する必要があります。しかし、これは更新将来変更可能性があります。反応追放率を制御することによりこの楽器は手操作からヒューマン エラーの変数を排除します。
図 1。ペグ17- bl PPS36の合成のための合成スキーマ-もこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。Polymersomesを介してFNP 手駆動 CIJ ミキサーでの生産。Polymersomes FNP を使用して形成の図。ペグ-bl-PPS ポリマー疎水性貨物とともに有機溶剤に溶解した溶存親水性貨物との混合溶媒に対して衝突.CIJ ミキサー内で発生急速混合し、流出することができます繰り返し衝突または希釈溶媒の貯水池を形成プロセスを完了するを許可します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。Polymersomes FNP によって形成された特性。(a)本研究で使用される CIJ ミキサーの回路図を設計。すべての測定は、ミリメートルにあります。((b))サイズ分布 polymersomes DL によって測定される 1 と 5 impingements 後 FNP によって形成されます。n = 6 製剤のサンプルの平均値をグラフ化します。(c)例 cryoTEM polymersomes 像形成 CIJ ミキサーを介して 1 と 5 impingements 縮尺を変更後バー = 100 nm。直径(d)と多分散性はインデックス(e) polymersomes FNP、DLS により測定によって形成されるのです。(TF e) 薄膜の再水和作用によって形成された polymersomes 比較のため (TF NE) 後続の押出の有無、溶剤分散 (SD) によって形成されるも測定し, n = 3、エラーバーは標準偏差を表します。Subfigures (c)-(e)アレンらの許可を得て撮影11.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。効率およびエンドトキシンの特性を読み込んでいます。(a) polymersomes、n 内の高分子の効率を読み込み = 3、エラーバーは標準偏差を表します。(b)生青 LPS 法 polymersomes 滅菌 FNP によって形成される n = 6、エラーバーは標準偏差を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5。CIJ ミキサーでソリューション衝突の力学的制御器。(a) 24 V ブラシをかけられた DC モーター。(b)電源 (24 V, 2.5 A)。(c) 4.5"ストローク精密スライド 1.27 mm ねじのリード (ねじビーム カップリングによるモーター シャフトに接続)。(d)追放プラットフォーム構築長方形の金属板からと L 字コーナーの中かっこ。(e) CIJ ミキサー。(f)追放キャリッジ。(g)シングル ボード コンピューターと 7"タッチ スクリーン。(h) mMotor コントロール ボード プラスチック製ハウジング (83 mm × 53 × 35 mm) に身を包んだ。(i) IR センサー (非接触休憩ビーム モーション センサー)。(j)緊急停止ボタン (NC)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6。コア配線図。シングル ボード コンピューター、モーター コント ローラーおよび IR センサー間のプライマリ接続が表示されます。このコンポーネントは非本質的な LCD タッチ スクリーン接続はここでは、表示されません (ユーザーが標準的なコンピューター モニターを使用して、マウスの代わりに選ぶことができる)。表示される構成で 24 V モータ側電源端子、シングル ボード コンピューターの電源は別に注意してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
Polymersomes ペグ17-bl- 安35を使用しての迅速な製造のための詳細な手順を提供している-SH ジブロック共重合体。小胞 polymersomes は、ペグの親水性および疎水性 PPS ブロック分子量この比率で組み立てられた主な集計形態です。複数回を吹きつけたとき直径と一致された後 200 nm 膜を通して押し出さ polymersomes 分散形成薄膜水和を介して。このプロトコルはこうして径 polymersome ナノキャリアの作製中に押し出しの追加の手順の必要性を排除します。Polymersomes 形成を介してFNP 親水性と疎水性の両方の貨物をロードし、策定プロセス11を介してこれらの分子の生理活性を維持します。追加のプロトコルは、不妊、エンドトキシンしたがって管理生体の安全と同様、生化学的・免疫学的アッセイに最適 polymersome 製剤の形成を許可する必要がある場合を確保するため説明.CIJ の手回しミキサーを設定する簡単なは、使いやすさをユーザーに提供しています、ユーザー変動による潜在的な品質管理の問題が導入されています。流れの整合性を維持するために我々 は達成し、再現性をもって対等な流量を維持することができる計測器を作成しようと思う。重要なは、上記のチャネル寸法を指定商業シリンジ ポンプが十分に高流量を実現できない (〜 1 mL/s) 低速のステッピング ・ モータを備えているため。この問題に対処し、流量をより細かく制御を与える FNP の高速シリンジ ポンプの試作が記述されていた。オープン ソース os のコードに簡単にカスタマイズ可能なソフトウェアを利用する注意しました。
代替流量制御ナノキャリア定式化を微調整する潜在的な多様なナノキャリア形態のアセンブリを探検する機会を提供しています。レイノルズ数と混合時間を対応する以前 FNP9を介して形成された固体コア ナノキャリアのサイズに影響を与えることが示されたが、polymersomes 化に及ぼすだろう影響は不明。これは現在の調査のトピックは、現在推奨される率約 1 mL/秒で実行代表の結果で 2 mL/秒に 0.5 をされていた。さらに、流量制御を高めるためは、Linux ベースの OS をリアルタイム制御シリンジ ポンプ モーターに置き換える必要場合もあります。
流量を調整する、別のスイートの特定のニーズやアプリケーションにこの FNP プロトコルを変更することができる方法があります。高分子の小さいか、大量を使用可能性があります。低 1 mg/mL と 100 mg/mL の高濃度は、安定したナノキャリアを形成するために使用されています。衝突のための大量が使えるは、FNP の手駆動中に圧力の一貫性のあるアプリケーションが当たりシリンジ 1 mL より大きいボリュームでより困難であります。貯留層のボリュームを変更もできますが。最終的な有機: 水性溶媒比 1:3 ナノキャリアの不完全な形成で起因するかもしれなど注意が必要ない減少する貯水池のボリューム ナノキャリアの形成を確認することがなくより大きい。集計は、高濃度、高分子: 貨物のモル比の増加により軽減できることは一般に疎水性の貨物を読み込もうとしているときに発生します。
探査はペグ-blを超えて他の高分子系を含める FNP polymersome 層のさらなる拡大のため開いて、追加のトピック-安確かに、他のシステムは、ミセルと固体コア薬物ナノキャリア16,17の形成に従来使用されてきた。しかし、それは polymersomesを介してFNP これら他のポリマー システムを使用しての形成につながることができるパラメーターのセットがある場合は不明です。探索する潜在変数の数を考えると、polymersomes または他ソフトの融合によるFNP 流量、温度、溶媒の選択などの調整の実験的パラメーターをその他のポリマーを形作ることができることは可能ですし、ポリマー濃度。
すべての製剤化技術と同様の場合、FNP と支持できない特定のアプリケーションをすることができる制限の制限があります。急速混合過程と水の有機溶剤である混和性、多くのブロック共重合体、例えば、ジクロロ メタンやクロロホルムの分解のために使用されるいくつかの一般的な溶剤の使用を排除することが必要です。いくつかのポリマーがありますしたがってレンダリング FNP と互換性のない彼らは水溶性の有機溶媒に溶解することができない場合。ここで説明した FNP プロトコルは、ペイロードのいくつかの生理活性タンパク質などの有機溶媒を高濃度に敏感の活性を低下させることがあります水性溶剤に有機の 1:1 の比率を利用しています。FNP11polymersomes 内で読み込み、次のアルカリ性ホスファターゼの酵素活性に対する影響を最小を見出した以前として蛋白質の生物活性に及ぼす影響が異なりますが注意するべき。複数入口渦のミキサーの18は、これらのコンテキストの CIJ ミキサーに多彩な選択肢を提供する水の溶媒に有機の比に対する追加の制御を提供するより高価なよりカスタマイズ可能な FNP プラットフォームです。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
我々 は、スタッフとインストルメンテーション ノースウェスタン大学構造生物学研究棟からのサポートを認めます。相対湿度 Lurie 包括的がんセンターの北西大学、ノースウェスタン大学の構造生物学施設からのサポートが認められています。シカゴ ・ コミュニティ ・ トラストでサール資金からサポートとシカゴ医療コンソーシアムによって提供される資金でカダン K2 直接電子検出器を購入しました。我々 はまた、ノースウェスタン大学で次の設備を感謝: 分析、高度な分子イメージング センター生体イメージング施設構造生物学研究棟ケック学際的表面科学施設バイオナノ テクノロジー機器のコア。この研究は国立科学財団のグラント 1453576、国立保健監督機関の新しいイノベーター賞 1DP2HL132390-01、再生ナノメディシン カタリスト賞 2014 マコーミック カタリスト賞センターによって支えられました。SDA は NIH を経てバイオ テクノロジー訓練助成金 T32GM008449 によって部分的に支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate Starter Kit - 32 GB Edition | CanaKit | UPC 682710991511 | |
| Linear Bearing Platform (Small) - 8mm Diameter | Adafruit | 1179 | |
| Linear Motion 8 mm Shaft, 330 mm Length, Chrome Plated, Case Hardened, Metric | VXB | kit11868 | |
| Linear Rail Shaft Guide/Support - 8 mm Diameter | Adafruit | 1182 | |
| Manual-Position Precision Slide 4.5" Stroke, 15 lb load capacity | McMaster-Carr | 5236A16 | |
| MTPM-P10-1JK43 Iron Horse DC motor | Iron Horse | MTPM-P10-1JK43 | |
| Official Raspberry Pi Foundation 7" Touchscreen LCD Display | Raspberry Pi | B0153R2A9I (ASIN) | |
| PicoBorg Reverse - Advanced motor control for Raspberry Pi | PiBorg | BURN-0011 | |
| Pololu Carrier with Sharp GP2Y0D810Z0F Digital Distance Sensor 10cm | Pololu | 1134 | |
| Ruland PSR16-5-4-A Set Screw Beam Coupling, Polished Aluminum, Inch, 5/16" Bore A Diameter, 1/4" Bore B Diameter, 1" OD, 1-1/4" Length, 44 lb-in Nominal Torque | Ruland | PSR16-5-4-A | |
| Polyethylene glycol monomethyl ether | Sigma Aldrich | 202495 | |
| Methanesulfonyl chloride | Sigma Aldrich | 471259 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 179418 | |
| Toluene, Anhydrous | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | |
| Celite 545 (Diatomaceous Earth) | Sigma Aldrich | 419931 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 320269 | |
| Diethyl ether | Sigma Aldrich | 296082 | |
| N,N-Dimethylformamide, anhydrous | Sigma Aldrich | 227056 | |
| Potassium carbonate | Sigma Aldrich | 791776 | |
| Thioacetic acid | Sigma Aldrich | T30805 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma Aldrich | 360589 | |
| Aluminum oxide, neutral, activated, Brockmann I | Sigma Aldrich | 199974 | |
| Sodium methoxide solution, 0.5 M in methanol | Sigma Aldrich | 403067 | |
| Propylene sulfide | Sigma Aldrich | P53209 | |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 320390 | |
| Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma Aldrich | S2770 | |
| Endotoxin-free water | GE Healthcare Life Sciences | SH30529.01 | |
| Paper pH strips | Fisher Scientific | 13-640-508 | |
| Endotoxin-free Dulbecco's PBS | Sigma Aldrich | TMS-012 | |
| Borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| 1 mL all-plastic syringe | Thermo Scientific | S75101 | |
| Sepharose CL-6B | Sigma Aldrich | CL6B200 | |
| Liquid chromatography column | Sigma Aldrich | C4169 | |
| CIJ mixer, HDPE | Custom | ||
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma Aldrich | 216763 | |
| HEK-Blue hTLR4 | InvivoGen | hkb-htlr4 | |
| RAW-Blue Cells | InvivoGen | raw-sp | |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | |
| PYROGENT Gel Clot LAL Assays | Lonza | N183-125 |
References
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