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Bioengineering

रैपिड, स्केलेबल विधानसभा और सक्रिय प्रोटीन की लोडिंग और विविध सिंथेटिक Nanocarriers में फ्लैश Nanoprecipitation के माध्यम से Immunostimulants

Published: August 11, 2018 doi: 10.3791/57793
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Interdisciplinary Biological Sciences, Northwestern University, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University

Summary

मैटीरियल्स दोनों बुनियादी विज्ञान और शोधों अनुप्रयोगों के लिए नियंत्रित चिकित्सकीय वितरण के बहुमुखी तंत्र प्रदान करते हैं, लेकिन उनके निर्माण अक्सर विशेषज्ञता है कि सबसे अधिक जैव चिकित्सा प्रयोगशालाओं में उपलब्ध नहीं है की आवश्यकता है । यहां, हम स्केलेबल निर्माण और विविध स्व-इकट्ठे nanocarriers फ्लैश nanoprecipitation का उपयोग कर के उपचारात्मक लोडिंग के लिए प्रोटोकॉल मौजूद ।

Abstract

मैटीरियल्स चिकित्सकीय और इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए एकल और संयुक्त आणविक पेलोड के नियंत्रित वितरण को अनुकूलित करने के लिए विकल्पों की एक विस्तृत श्रृंखला पेश करते हैं । इस वृद्धि की विशिष्टता कम साइड इफेक्ट और उच्च शक्ति के साथ कम खुराकों सहित महत्वपूर्ण नैदानिक निहितार्थ, हो सकता है । इसके अलावा, में सीटू लक्ष्यीकरण और विशिष्ट सेल सबसेट के नियंत्रित मॉडुलन इन विट्रो में और बुनियादी जैविक घटना और जांच सेल समारोह की vivo जांच में वृद्धि कर सकते हैं । दुर्भाग्य से, नेनो विज्ञान, रसायन शास्त्र और इंजीनियरिंग में आवश्यक विशेषज्ञता अक्सर इन क्षेत्रों में अनुभव के बिना निर्माण और उनकी जांच या उनके लिए वाहनों के लिए उपकरणों के रूप में मैटीरियल्स अनुरूपण से प्रयोगशालाओं को प्रतिबंधित चिकित्सीय रणनीतियों । यहाँ, हम सतही गठन और जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए नेनो वाहनों की लोडिंग के लिए उत्तरदायी एक बहुमुखी गैर विषैले ब्लॉक copolymer प्रणाली के संश्लेषण और स्केलेबल विधानसभा के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । Flash nanoprecipitation को पाली (ईथीलीन ग्लाइकोल) से विविध nanocarriers के द्रुत निर्माण के लिए एक पद्धति के रूप में प्रस्तुत किया गया है-बीएल-पाली (propylene सल्फाइड) copolymers. इन प्रोटोकॉल प्रयोगशालाओं विशेषज्ञता और संसाधनों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ आसानी से और reproducibly अपने अनुप्रयोगों के लिए उंनत nanocarrier वितरण प्रणाली बनाना की अनुमति देगा । डिजाइन और एक स्वचालित उपकरण है कि एक उच्च गति सिरिंज पंप को रोजगार के लिए फ्लैश nanoprecipitation प्रक्रिया की सुविधा के निर्माण और सजातीयता, आकार, आकृति विज्ञान और polymersome nanocarriers की लोडिंग पर बढ़ाया नियंत्रण की अनुमति है वर्णित.

Introduction

Nanocarriers छोटे और macromolecular माल के नियंत्रित वितरण के लिए अनुमति देते हैं, सक्रिय संस्थाओं सहित, कि अगर encapsulated नहीं, या तो अत्यधिक सड़ जाएगा और/या भी vivo मेंप्रशासन के लिए hydrophobic । nanocarrier morphologies नियमित रूप से गढ़े, बहुलक बुलबुले liposomes के अनुरूप (polymersomes भी कहा जाता है) के लिए एक साथ हाइड्रोफिलिक और hydrophobic कार्गो1,2लोड करने की क्षमता प्रदान करते हैं । उनके होनहार लाभ के बावजूद, polymersomes अभी भी नैदानिक अनुप्रयोगों के कारण में दुर्लभ हैं, भाग में, उनके निर्माण में कई महत्वपूर्ण चुनौतियों के लिए । नैदानिक उपयोग के लिए, polymersome योगों बड़े पैमाने पर, बाँझ, और लगातार बैचों में किए जाने की जरूरत है.

कई तकनीकों का उपयोग किसी diblock copolymer से polymersomes बनाने के लिए किया जा सकता है, जैसे पाली (ईथीलीन ग्लाइकोल)-ब्लॉक-पाली (propylene सल्फाइड) (खूंटी-बीएल-पीपीएस), जिसमें विलायक फैलाव3, तनु फिल्म निर्जलीकरण1 शामिल है , 4, microfluidics 5,6, और प्रत्यक्ष जलयोजन7। विलायक फैलाव कार्बनिक सॉल्वैंट्स, जो प्रोटीन की तरह कुछ जैव सक्रिय पेलोड स्वभाव हो सकता है की उपस्थिति में लंबे समय मशीन समय शामिल है । तनु फिल्म निर्जलीकरण का गठन polymersomes के polydispersity पर नियंत्रण की पेशकश नहीं करता है, अक्सर महंगी और समय लेने वाली बाहर निकालना तकनीकों स्वीकार्य monodispersity प्राप्त करने की आवश्यकता है । इसके अलावा, दोनों microfluids और प्रत्यक्ष जलयोजन बड़ा उत्पादन संस्करणों के लिए पैमाने पर मुश्किल हैं । विभिंन nanocarrier निर्माण विधियों में से, flash nanoprecipitation (FNP) बड़े पैमाने पर और reproducible योगों8,9,10बनाने की क्षमता प्रदान करता है । जबकि FNP पहले ठोस-कोर नैनोकणों के निर्माण के लिए आरक्षित किया गया था, हमारी प्रयोगशाला ने हाल ही में FNP के उपयोग के लिए विविध खूंटी-बीएल-पीपीएस nanostructure morphologies11के अनुरूप गठन शामिल है, १२, सहित polymersomes११ र bicontinuous nanospheres१२। हमने पाया कि FNP बाहर निकालना के लिए की आवश्यकता के बिना polymersomes के monodisperse योगों बनाने में सक्षम था, पतली फिल्म निर्जलीकरण और विलायक फैलाव द्वारा गठित गैर-बाहर polymersomes की तुलना में बेहतर polydispersity सूचकांक मूल्यों में जिसके परिणामस्वरूप 11. Bicontinuous nanospheres, उनके बड़े hydrophobic डोमेन के साथ, के लिए पतली फिल्म निर्जलीकरण द्वारा गठित नहीं कर रहे थे,12FNP के साथ विलायक शर्तों के एक नंबर के तहत बनाने के बावजूद ।

यहाँ, हम खूंटी-बीएल-पीपीएस diblock copolymer के संश्लेषण के लिए एक विस्तृत विवरण प्रदान polymersome गठन में इस्तेमाल किया, सिमटा भिडंत जेट (CIJ) मिक्सर FNP के लिए इस्तेमाल किया, FNP प्रोटोकॉल ही, और एक स्वचालित प्रणाली के कार्यांवयन के लिए उपयोगकर्ता परिवर्तनशीलता कम करें । शामिल करने के लिए कैसे पर्याप्त प्रणाली endotoxin- vivo मेंउपयोग के लिए मुक्त योगों का उत्पादन करने के लिए बंध्याकरण के बारे में जानकारी है, और प्रतिनिधि डेटा FNP द्वारा गठित polymersomes के लक्षण वर्णन के विषय में । इस जानकारी के साथ, इन विट्रो में और vivo काम में के लिए polymersomes के उपयोग में रुचि के साथ पाठकों को अपने बाँझ, monodisperse योगों बनाना करने में सक्षम हो जाएगा । nanocarrier योगों में अनुभव और बहुलक संश्लेषण विशेषज्ञता के साथ पाठकों को तेजी से अपने स्वयं के बहुलक अपने वर्तमान निर्माण तकनीकों के लिए एक संभावित विकल्प के रूप में FNP का उपयोग कर प्रणाली का परीक्षण करने में सक्षम हो जाएगा । इसके अतिरिक्त, यहां वर्णित प्रोटोकॉल नैनो प्रयोगशाला पाठ्यक्रमों में nanocarriers के निर्माण के लिए शैक्षिक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Protocol

1. पाली का संश्लेषण (ईथीलीन ग्लाइकोल)-block-पाली (propylene सल्फाइड)-Thiol

  1. संश्लेषित methoxy-पाली (ईथीलीन ग्लाइकोल) mesylate (Mn: ७५०) (मेव-खूंटी17-एमएस, मैं) ।
    1. मेव के 10 जी भंग-खूंटी17-ओह में १००% टोल्यूनि के २०० मिलीलीटर में एक 3-गर्दन दौर नीचे कुप्पी (RBF) के तहत ६०० rpm पर चुंबकीय सरगर्मी के तहत ।
    2. 3-गर्दन RBF एक डीन-स्टार्क तंत्र से कनेक्ट, खुद को एक संघनित्र से जुड़ा हुआ, निष्क्रिय गैस के तहत पूरी प्रणाली रखने के लिए, या तो नाइट्रोजन या आर्गन ।
    3. एक तेल स्नान में 3 गर्दन RBF प्लेस, १६५ डिग्री सेल्सियस के लिए गर्मी जबकि ६०० rpm पर सरगर्मी ।
    4. ट्रेस पानी निकालें और azeotropic आसवन का उपयोग कर टोल्यूनि के १०० मिलीलीटर ।
    5. 3-गर्दन RBF को तेल से निकालें, निष्क्रिय गैस की स्थिति को बनाए रखते हुए डीन-स्टार्क तंत्र को अलग करें, और कमरे के तापमान को ठंडा करने की अनुमति दें ।
    6. १००% triethylamine की ५.६ मिलीलीटर जोड़ें (3 दाढ़ eq.) और ३०० एमएल के निर्जल १००% टोल्यूनि मेव-खूंटी17-ओह समाधान जबकि सरगर्मी ६०० rpm पर ।
    7. एक बर्फ स्नान करने के लिए 3 गर्दन RBF हटो, ६०० rpm और निष्क्रिय गैस की स्थिति पर सरगर्मी बनाए रखने के ।
    8. १००% टोल्यूनि के 30 मिलीलीटर में १००% methanesulfonyl क्लोराइड (3 दाढ़ eq.) के ३.१ मिलीलीटर पतला, धीरे-2 एक अतिरिक्त कीप के माध्यम से गर्दन RBF को जोड़ने जबकि ६०० rpm पर सरगर्मी ।
    9. निष्क्रिय परिस्थितियों में कमरे के तापमान पर ६०० rpm पर रात भर हलचल ।
    10. diatomaceous पृथ्वी के साथ पैक एक Buchner कीप के माध्यम से समाधान फ़िल्टर ( सामग्री की तालिकादेखें) लवण को दूर करने के लिए ।
    11. जल स्नान के लिए सेट के साथ एक रोटरी वाष्पन के माध्यम से टोल्यूनि निकालें ४० ° c, १२० rpm पर रोटेशन, और दबाव 50-100 millibar के बीच के लिए सेट ।
    12. १००% dichloromethane (डीसीएम) के २०० मिलीलीटर में पुनः उत्पाद भंग, और एक Buchner diatomaceous पृथ्वी के साथ पैक कीप के माध्यम से फिल्टर ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    13. ४० डिग्री सेल्सियस, १२० rpm पर रोटेशन के लिए सेट पानी स्नान के साथ एक रोटरी वाष्पक के माध्यम से डीसीएम निकालें, और 450-600 millibar के बीच करने के लिए सेट दबाव ।
    14. संयम से फिर से १००% डीसीएम में उत्पाद भंग और धीरे से यह dropwise (via पाश्चर पिपेट) को जोड़ने के द्वारा उत्पाद हाला के ५०० मिलीलीटर बर्फ ठंडा १००% diethyl ईथर । ३०० rpm पर सरगर्मी बनाए रखें ।
    15. महाप्राण या शुष्क उत्पाद, मेव-खूंटी17-Mesylate से diethyl ईथर को हटाने के लिए, और पूरी तरह से सूखी करने के लिए निर्वात desiccator में रात भर की दुकान ।
    16. उत्पाद का तुरंत उपयोग करें, या कई महीनों के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर निष्क्रिय गैस के तहत दुकान ।
  2. संश्लेषित methoxy-पाली (ईथीलीन ग्लाइकोल) thioacetate (मेव-खूंटी17-टीए, द्वितीय) ।
    1. मेव के 5 जी भंग-खूंटी17-एमएस (मैं) में १००% निर्जल dimethylformamide (DMF) के २०० मिलीलीटर में एक 3 गर्दन RBF, निष्क्रिय गैस के तहत कमरे के तापमान पर ६०० rpm पर हलचल ।
    2. समाधान उभारने के लिए १००% पोटेशियम कार्बोनेट (3 दाढ़ eq.) का २.५ ग्राम जोड़ें ।
      नोट: पोटेशियम कार्बोनेट समाधान में पूरी तरह भंग नहीं होगा ।
    3. १००% निर्जल DMF के १०० मिलीलीटर में १००% thioacetic एसिड (3 दाढ़ eq.) के १.३ मिलीलीटर पतला, और एक अतिरिक्त कीप के माध्यम से समाधान करने के लिए dropwise जोड़ें ।
      नोट: Thioacetic एसिड एक मजबूत, अप्रिय गंध है । देखभाल के लिए रासायनिक धुएं हूड के भीतर सभी नेपकिन वस्तुओं रखने के लिए पहले निपटान या सफाई के लिए लिया जाना चाहिए ।
    4. जोरदार हलचल (rpm ६०० या अधिक) कमरे के तापमान पर रातोंरात ।
      नोट: नमक गठन आसानी से इस समाधान की सरगर्मी को बाधित कर सकते हैं । रात भर सरगर्मी बनाए रखने के लिए देखभाल करनी होगी ।
    5. diatomaceous पृथ्वी ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ पैक एक Buchner कीप के माध्यम से समाधान फ़िल्टर.
    6. जल स्नान के लिए सेट के साथ एक रोटरी वाष्पन के माध्यम से DMF निकालें ६० ° c, १२० rpm पर रोटेशन, और दबाव 5-15 millibar के बीच के लिए सेट ।
    7. १००% tetrahydrofuran (THF) के १०० मिलीलीटर में उत्पाद भंग और लाल/नारंगी रंग अशुद्धियों को दूर करने के लिए तटस्थ एल्यूमिना के साथ पैक एक स्तंभ में जोड़ें ।
    8. जल स्नान के लिए सेट के साथ एक रोटरी वाष्पन के माध्यम से THF निकालें ४० ° c, १२० rpm पर रोटेशन, और दबाव 200-300 millibar के बीच के लिए सेट ।
    9. संयम से फिर से १००% डीसीएम में उत्पाद भंग । यदि एक नमक रूपों, एक Buchner कीप का उपयोग कर 6 माइक्रोन ताकना आकार फिल्टर कागज के माध्यम से फिल्टर समाधान हाला ।
    10. धीरे पाश्चर पिपेट के माध्यम से dropwise जोड़कर उत्पाद हाला-शीत १००% diethyl ईथर के ५०० मिलीलीटर, ३०० rpm पर क्रियाशीलता । Diethyl ईथर को और अधिक ठंडा करने के लिए की आवश्यकता हो सकती है-20 ° c कई घंटे के लिए एक धमाका प्रूफ फ्रीजर में अगर हाला समाधान से बाहर 4 डिग्री सेल्सियस पर दुर्घटना नहीं करता है ।
    11. महाप्राण या हाला उत्पाद, मेव-PEG17-Thioacetate से diethyl ईथर को दूर करने के लिए खिचड़ी भाषा या । स्टोर उत्पाद एक निर्वात desiccator में रातोंरात, और बाद में-20 डिग्री सेल्सियस पर निष्क्रिय गैस के तहत ।
  3. संश्लेषित diblock copolymer पाली (ईथीलीन ग्लाइकोल)-ब्लॉक-पाली (propylene सल्फाइड)-thiol (खूंटी17-बीएल-पीपीएस३५-एसएच, तृतीय).
    1. विसर्जित मेव-खूंटी17-टीए (द्वितीय) १००% निर्जल DMF के 10 मिलीलीटर में आर्गन के तहत एक Schlenk कुप्पी के भीतर, जबकि एक कमरे के तापमान पानी स्नान में ४०० rpm पर सरगर्मी ।
    2. सोडियम methoxide के १.१ दाढ़ eq जोड़ें (०.५ एम मेथनॉल में समाधान), 5 मिनट के लिए ४०० rpm पर हलचल करने की अनुमति ।
    3. समाधान के लिए तेजी से, १००% propylene सल्फाइड के ३५ दाढ़ eq जोड़ें । 10 मिनट के लिए ४०० rpm पर हलचल करने की अनुमति दें ।
    4. १००% हिमनदों एसिटिक एसिड की 10 दाढ़ eq जोड़ें, 5 मिनट के लिए ४०० rpm पर हलचल करने की अनुमति ।
    5. जल स्नान के लिए सेट के साथ एक रोटरी वाष्पन के माध्यम से DMF निकालें ६० ° c, १२० rpm पर रोटेशन, और दबाव 5-15 millibar के बीच के लिए सेट ।
    6. पुनः भंग उत्पाद १००% डीसीएम में संयम से, १००% मेथनॉल के ८० मिलीलीटर में हाला, २ ५० मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूबों के बीच विभाजित ।
    7. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ७५०० x g पर शंकु ट्यूबों के केंद्रापसारक । महाप्राण दूर supernatant.
    8. स्टोर उत्पाद, खूंटी17-बीएल-पीपीएस३५-एसएच, एक निर्वात desiccator में रातोंरात, और बाद में-20 डिग्री सेल्सियस पर निष्क्रिय गैस के तहत.

2. हाथ से संचालित फ़्लैश Nanoprecipitation के माध्यम से खूंटी-बीएल-पीपीएस Nanocarriers इकट्ठा

  1. वैकल्पिक सिमटा भिडंत जेट (CIJ) मिक्सर निष्फल ।
    1. एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) के भीतर, सभी ०.१ मीटर NaOH रातोंरात भीतर जुदा भागों के साथ मिक्सर जलमग्न ।
    2. CIJ मिक्सर फिर से इकट्ठा, और luer-लॉक सीरिंज का उपयोग कर endotoxin मुक्त पानी के माध्यम से प्रवाह ।
    3. पानी का पीएच परीक्षण, और के माध्यम से पानी प्रवाह जारी जब तक पीएच तटस्थ के रूप में रजिस्टर ।
  2. THF (भिडंत समाधान 1) में खूंटी17-बीएल-पीपीएस३५-एसएच बहुलक और hydrophobic कार्गो भंग ।
    1. वजन 20 खूंटी17के मिलीग्राम-बीएल-पीपीएस३५-एसएच में एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब ।
    2. hydrophobic रंजक (जैसे, दिी, ICG), ड्रग्स (जैसे,rapamycin), या अंय कार्गो जोड़ें ।
      नोट: कार्गो शुष्क, या एक पानी मिश्रणीय विलायक, अधिमानतः THF में भंग हो सकता है । यदि माल THF या DMF में अघुलनशील है, एक और पानी मिश्रणीय विलायक इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन संयम से, बहुलक के रूप में घुलनशील होने की संभावना नहीं है । कार्गो की राशि है कि लोड किया जा सकता है खुद को कार्गो संपत्तियों (जैसे, आणविक भार, hydrophobicity, steric विचार) पर निर्भर है, और एक मामले पर पता लगाया जाना चाहिए द्वारा मामले के आधार11,12।
    3. जोड़ें १००% THF के बहुलक और कार्गो, भंवर को सख्ती से भंग करने के लिए ५०० µ एल ।
  3. जलीय बफर में हाइड्रोफिलिक कार्गो भंग (समाधान 2 भिडंत) । इस के लिए, हाइड्रोफिलिक कार्गो को भंग करने के लिए एक जलीय बफर के ५०० µ एल में बहुलक बुलबुले के भीतर लोड किया जा करने के लिए (उदाहरण के लिए, फास्फेट बफर खारा, शुद्ध पानी, आदि) के रूप में की जरूरत है ।
  4. जलाशय में बफर जोड़ें ।
    1. पसंद की एक जलीय बफर के २.५ मिलीलीटर (जैसे, 1x फास्फेट बफर खारा) एक उपयुक्त आकार जलाशय के लिए (जैसे, एक 20 मिलीलीटर ग्लास जुटाना शीशी) जोड़ें । CIJ मिक्सर के नीचे प्लेस जलाशय ऐसे कि मिक्सर से बहिर्वाह सीधे जलाशय में प्रवेश करता है.
  5. अलग 1 मिलीलीटर प्लास्टिक डिस्पोजेबल सिरिंजों में लोड भिडंत समाधान ।
  6. एक दूसरे के खिलाफ समाधान के लिए एक साथ nanostructures फार्म और उंहें पेलोड के साथ लोड को पिंग ।
    1. CIJ मिक्सर के शीर्ष पर Luer-लॉक एडेप्टर में सीरिंज डालें.
    2. एक एकल, चिकनी, और तेजी से गति में, दोनों सीरिंज एक साथ और बराबर बल के साथ दबाना ।
      नोट: यदि एकाधिक अनुक्रमिक impingements प्रदर्शन, पहले एक खाली जलाशय में बहिर्वाह इकट्ठा ।
    3. वैकल्पिक एकाधिक impingements निष्पादित करें । दो सीरिंज के बीच विभाजित नवजात nanostructure समाधान, और 4 अधिक बार करने के लिए कदम 2.6.1-2.6.2 दोहराएँ.
    4. 2.4.1 में तैयार जलीय बफर भरा जलाशय में बहिर्वाह इकट्ठा और धीरे मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए हलचल ।
  7. अनलोड कार्गो और कार्बनिक विलायक निकालें ।
    1. (विकल्प 1) Dialyze एक ही जलीय बफर में भिडंत के लिए इस्तेमाल किया और जलाशय में nanocarrier सूत्रीकरण, कम से कम 2 बफर परिवर्तन के साथ एक उचित मेगावाट कटऑफ की ट्यूबिंग का उपयोग करते हुए ंयूनतम 24 घंटे के लिए । यह कमरे के तापमान पर किया जा सकता है ।
      नोट: Nanocarriers एक मेगावाट कटऑफ < 100, 000 केडीए के साथ ट्यूबिंग द्वारा बरकरार रखा जाएगा और संभावित रूप में अच्छी तरह से उच्च कटऑफ द्वारा बनाए रखा जा सकता है. इस विकल्प बाँझ जब एक बीएससी बाँझ बफर का उपयोग में प्रदर्शन का कहना है.
    2. (विकल्प 2) एक आकार अपवर्जन या लवण/बफर एक्सचेंज कॉलम (उदाहरण के लिए, Sepharose घमण्ड कॉलम) जलीय बफर के रूप में 1x पंजाबियों का उपयोग करके फ़िल्टर निर्माण ।
      नोट: यह विकल्प पूरी तरह से निष्फल किया गया है कि एक कॉलम के साथ एक बीएससी में प्रदर्शन किया जब बाँझ का कहना है.
    3. (विकल्प 3) अस्थिर कार्बनिक विलायक वैक्यूम सुखाना रातोंरात का उपयोग कर निकालें ।
    4. (विकल्प 4) एक 50-100 केडीए फ़िल्टर का उपयोग कर एक स्पर्श प्रवाह छानने का यंत्र प्रणाली का उपयोग कर फ़िल्टर निर्माण 15 मिनट 1 घंटे के लिए एक 20-60 मिलीलीटर की दर से, दूर शुद्ध किया जा रहा है की आणविक वजन पर निर्भर करता है (बड़ा कार्गो अब ले जाएगा) ।
  8. वैकल्पिक nanocarrier तैयार करना ध्यान लगाओ ।
    1. (विकल्प 1) एक स्पिन ध्यानी प्रणाली का उपयोग ध्यान केंद्रित (उदाहरण के लिए, मेगावाट कटऑफ > १००,००० के साथ स्पिन कॉलम), निर्माता द्वारा वर्णित के रूप में इस्तेमाल किया ।
      नोट: Nanocarriers spins के बीच resuspend करने की आवश्यकता हो सकती है और करने के लिए वांछित मात्रा नीचे ध्यान केंद्रित करने के लिए spins के एक नंबर की आवश्यकता हो सकती है । स्पिन एकाग्रता nanocarrier योगों की बांझपन को कम कर सकते हैं ।
    2. (विकल्प 2) वैक्यूम सुखाना का उपयोग कर मात्रा कम करें ।
      नोट: मात्रा परिवर्तन इन शर्तों के तहत नियंत्रण मुश्किल है, और ध्यान से पहले और एकाग्रता के बाद osmolarity बनाए रखने के लिए लिया जाना चाहिए ।
  9. महीने के लिए सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर nanocarriers स्टोर । भंडारण के बाद उपयोग करने से पहले, संक्षेप भंवर nanocarrier योगों ।

3. Nanocarrier योगों की विशेषताएं

  1. माप लोड क्षमता
    1. यदि कार्गो फ्लोरोसेंट है या 260-450 एनएम के बाहर एक दिया तरंग दैर्ध्य में दृढ़ता से अवशोषित, मापने प्रतिदीप्ति/fluorimeter/spectrophotometer का उपयोग कर ।
      नोट: खूंटी-बीएल-पीपीएस से दृढ़ता से अवशोषित 260-310 एनएम और polymersome योगों 310-450 एनएम से अवशोषित, जो कार्गो के ठहराव जटिल हो सकता है कि एक समान तरंग दैर्ध्य पर अवशोषित ।
    2. यदि कार्गो 260-450 एनएम रेंज के भीतर अवशोषित और हाइड्रोफिलिक है, या तो 1% एच2ओ2 या 1% ट्राइटन एक्स-१०० की एक बराबर मात्रा में निर्माण के 25 μL जोड़कर खूंटी-बीएल-पीपीएस nanostructures बाधित और बाद में अलग और भेद उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) के माध्यम से बहुलक अवशोषक से कार्गो जलीय बफ़र्स के साथ संगत एक आकार अपवर्जन स्तंभ का उपयोग करना (उदा., एक Sepharose घमण्ड कॉलम) 11.
    3. अगर कार्गो 260-450 एनएम रेंज के भीतर अवशोषित और THF या DMF में घुलनशील है, lyophilize १०० μL में एक १.५ मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब में ठंड से निर्माण रातोंरात-८० डिग्री सेल्सियस । फिर एक lyophilizer पर एक गिलास निर्वात कंटेनर और जगह में ट्यूब जगह है । lyophilization के लिए 24 घंटे की अनुमति दें और बाद में पुन: भंग DMF या THF के ५० μL में जुदाई और HPLC के माध्यम से पता लगाने से पहले ।
  2. माप nanocarrier आकार और आकृति विज्ञान
    1. nanocarrier आकार मापने के लिए डायनेमिक लाइट कैटरिंग (DLS)11 या nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण13 का उपयोग करें ।
      नोट: खूंटी से गठित Nanocarriers17-बीएल-पीपीएस३५-एसएच 100-200 एनएम के बीच एक औसत व्यास, एक polydispersity सूचकांक < ०.३ के साथ होने की संभावना है ।
    2. क्रायोजेनिक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (cryoTEM) का उपयोग कर nanocarrier आकृति विज्ञान का निर्धारण14.
      नोट:17खूंटी से गठित Nanocarriers-बीएल-पीपीएस३५-एसएच एक स्पष्ट रूप से समझदार बहुलक झिल्ली और काफी हद तक गोलाकार आकार के साथ बहुलक बुलबुले (polymersomes) होने की उम्मीद कर रहे हैं ।
  3. वैकल्पिक endotoxin के लिए परीक्षण योगों
    1. (विकल्प 1) endotoxin, जैसे, कच्चे नीले कोशिकाओं या HEK नीले TLR4 कोशिकाओं की उपस्थिति के लिए एक सेल आधारित परख का प्रयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें), निर्माता द्वारा वर्णित के रूप में, या तो lipopolysaccharides (एलपीएस) 13 के लिए एक मात्रात्मक या गुणात्मक परख में .
    2. (विकल्प 2) एक Limulus Amebocyte Lysate (लाल)15 परख किट, के रूप में निर्माता द्वारा वर्णित का उपयोग करें ।

4. FNP के लिए एक उच्च गति सिरिंज पंप का निर्माण

  1. कस्टम साधन घटक बनाना ।
    नोट: सभी कस्टम भागों मशीनिंग के लिए 3 डी मॉडल अनुपूरक सामग्री में प्रदान की जाती हैं ।
    1. ¾ से मशीन बहु स्तरित साधन चेसिस "एक्रिलिक शीट्स और इकट्ठा ( अनुपूरक फ़ाइलें 1-5) देखें ।
      नोट: एक्रिलिक गरीब रासायनिक प्रतिरोध है । यदि साधन कठोर सॉल्वैंट्स के साथ इस्तेमाल किया जा रहा है, मशीन एक धातु से आधार आवेदन के लिए उपयुक्त समझा ।
    2. 3 डी प्रिंट भागों के साथ polylactide (पीएलए) प्लास्टिक के साथ मुद्रित ।
      1. सिरिंज निष्कासन (se) 2-भाग उपकरण मुद्रित करें: SE part 1-रियर FNP ब्लॉक होल्डिंग कैरिज (चित्रा 5F, ग्रे भाग; अनुपूरक फाइल 6) और एसई भाग 2-सामने निष्कासन गाइड (चित्रा 5F, काला भाग; अनुपूरक फाइल 7) । योजनाबद्ध के लिए अनुपूरक फ़ाइल 2 देखें.
      2. इंफ्रारेड सेंसर धनुकोष्ठक (चित्रा 5I, काले बक्से प्रिंट; अनुपूरक 8 फ़ाइलें और 9) ।
      3. वैकल्पिक डुअल सिरिंज गोताख़ोर ब्रेसेस प्रिंट करें ।
  2. साधन चेसिस परतों M5 हेक्स बोल्ट के साथ एक साथ जकड़ना और आधार करने के लिए रबर पैर जोड़ें ।
  3. configure एक एकल बोर्ड Raspbian ग्नू के साथ कंप्यूटर/लिनक्स ८.० (जेसी) ऑपरेटिंग सिस्टम (लिनक्स डेबियन के आधार पर) ।
    नोट: साधन के संचालन के लिए सॉफ्टवेयर अनुरोध पर उपलब्ध है । साधन सॉफ्टवेयर स्रोत कोड अनुरोध पर उपलब्ध है । ज़िपित फ़ाइल प्राप्त करने पर, रीडमी फ़ाइल में निर्दिष्ट सभी निर्भरताएं डाउनलोड करें । इस सॉफ्टवेयर बुनियादी भागो मापदंडों (मोटर गति, दिशा, आदि) सहित साधन आपरेशन पर नियंत्रण, सक्षम बनाता है कि एक सरल ग्राफिक यूजर इंटरफेस भी शामिल है. उपयोगकर्ताओं को अपने स्वयं के प्रयोगों में उपयोग के लिए सिलवाया मौजूदा स्रोत कोड और कार्यक्रम कस्टम मॉड्यूल पर विस्तार करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है. सभी सॉफ्टवेयर पायथन 2.7.12 का उपयोग कर लिखा गया था और अजगर 3 के साथ वर्तमान में संगत नहीं है । आरपीआई, PicoBorgRev, kivy, और बहु प्रक्रमण मॉड्यूल का उपयोग किया जाता है । रीडमी फ़ाइल में सॉफ़्टवेयर वितरण लायसेंस के बारे में विस्तृत जानकारी है ।
  4. एक 24 V ब्रश डीसी मोटर (चित्रा 5) और परिशुद्धता स्लाइड (४.५ "(११४.३ mm) स्ट्रोक; १.२७ mm पेंच लीड) (चित्रा 5C) स्थापित करें ।
    नोट: 24 वी डीसी मोटर यहां इस्तेमाल एक rpmअधिकतम, मैंअधिकतमहै, और पूर्ण ४,२५२ rpm, ४.८३ a, और ~ ०.२ N * एम, क्रमशः के टोक़ लोड ।
    1. वैकल्पिक आपरेशन के दौरान कंपन गीला करने के लिए मोटर के नीचे गद्दे प्लेस ।
      नोट: यह सिफारिश की है कि एक 2-3 mm मोटी रबर पैड के लिए साधन आधार के मोटर कैरिज आयामों फिट काट रहा है ।
    2. परिशुद्धता स्लाइड को इंस्ट्रूमेंट बेस पर माउंट करें ।
      1. थ्रेडेड रॉड को अस्थाई रूप से निकालें ।
      2. माउंट दो #8-३२ फ्लैट मशीन शिकंजा का उपयोग कर स्लाइड ।
    3. माउंट डीसी मोटर परिशुद्धता स्लाइड पेंच बीम युग्मन (1-1/4 "लंबाई) 6/16 युक्त" और 1/4 "व्यास बोर का उपयोग कर ।
      नोट: मशीन के लिए इस्तेमाल एक्रिलिक की मोटाई पर निर्भर करता है साधन आधार परतों, परत मोटर और परिशुद्धता स्लाइड शाफ्ट के स्तर की जरूरत हो सकती है ।
  5. धातु प्लेट और एल के आकार का कोना ब्रेसिज़ (चित्रा 5d) से निष्कासन मंच इकट्ठा । माउंट बेस धातु मंच फिसलने मंच (लड़ी पिरोया रॉड से जुड़ा) #6-३२ शिकंजा का उपयोग कर । बढ़ते बाधाओं के बारे में जानकारी के लिए निर्माता द्वारा प्रदान की परिशुद्धता स्लाइड योजनाबद्ध देखें ।
  6. सिरिंज निष्कासन प्रणाली सेटअप इकट्ठा ।
    1. रैखिक गति तकिया ब्लॉक (बढ़ते प्लेटफार्मों + रैखिक गति असर) M8 क्रोम पर चढ़ाया स्टेनलेस स्टील रेल (समानांतर इस्पात रेल आसानी से 5 चित्रामें देखा जा सकता है) देते हैं ।
    2. रैखिक शाफ्ट गाइड के माध्यम से धागा रेल/ प्रति रेल तीन गाइड का प्रयोग करें । माउंट एसई 1 भागों और 2 पर तकिया M4 मशीन शिकंजा का उपयोग कर ब्लॉकों ।
    3. ढीले एसई भाग 1 और 2 M8 हेक्स बोल्ट के साथ शामिल हो । पेचदार संपीड़न के साथ एसई भाग 1 और 2 के बीच अंतरिक्ष विन्यस्त एक बोल्ट है कि दो आवक नायलॉन झाड़ियों का सामना करना पड़ के बीच सुरक्षित है कवर स्प्रिंग्स ( चित्रा 5Fदेखें) । एसई भाग 1 और एसई भाग 2 के बाहरी पर इन झाड़ियों माउंट ।
  7. वायर सर्किट (कोर तारों आरेख के लिए चित्रा 6 देखें)
    1. I2C के लिए मोटर नियंत्रक कनेक्ट/SDA, ३.३ V, और एक बोर्ड कंप्यूटर पर GND पिंस ।
    2. मोटर नियंत्रक बोर्ड के एम और एम + ब्लॉकों के लिए डीसी मोटर टर्मिनलों से कनेक्ट करें । कनेक्ट 24 v, २.५ एक बिजली की आपूर्ति (चित्रा 5B) v + और मोटर नियंत्रक के GND ब्लॉकों के लिए (नियंत्रक अंतिम डिजाइन में एक सरल इलेक्ट्रॉनिक्स बॉक्स में, चित्र 5Hदेखा जाता है) ।
    3. 3V3 और 5v पिन मोटर नियंत्रण बोर्ड के एकल बोर्ड कंप्यूटर पर संबंधित पिन करने के लिए कनेक्ट करें । मोटर नियंत्रक के SDA और SCL पिन कनेक्ट करने के लिए पिन 3 और 5 एकल बोर्ड कंप्यूटर के, क्रमशः ।
      नोट: आदेश एक मोटर नियंत्रक के माध्यम से एक बोर्ड कंप्यूटर से डीसी मोटर के लिए जारी किए गए हैं । मोटर गति पल्स चौड़ाई मॉडुलन के माध्यम से मोटर टर्मिनलों भर में वोल्टेज को विनियमित द्वारा नियंत्रित किया जाता है. इस सेटअप में, अधिकतम 24 वी डीसी मोटर के माध्यम से चल रहे वर्तमान (पूर्ण लोड amperage: ४.८३ a) 24 वी बिजली की आपूर्ति द्वारा २.५ a तक सीमित है । यह सिफारिश की है कि मोटर सर्किट एक सामांय रूप से बंद (नेकां) आपातकालीन बंद (चित्रा 5J) के माध्यम से वायर्ड है । ऐसा करने के लिए एक बुनियादी आपातकालीन बंद आपरेशन सक्षम करने के लिए मोटर सर्किट को बाधित करने का साधन प्रदान करता है ।
    4. आरपीआई GPIO पिंस के लिए सामने और पीछे अवरक्त निकटता सेंसरों (डिजिटल दूरी सेंसर, चित्रा 5I) से कनेक्ट क्रमशः 24 और 23, ।
      1. मार्ग संवेदक उपकरण आधार में नाली के माध्यम से तारों ।
        नोट: IR सेंसर गैर संपर्क तोड़-बीम गति सेंसरों 2-10 cm का पता लगाने रेंज के साथ कर रहे हैं ।
      2. 4.7.4.2 3d में वायर्ड IR सेंसर स्नैप-मुद्रित अवरक्त संवेदक ब्रेसिज़ (चित्रा 5I, काले बक्से) और साधन आधार पर माउंट । जब सही ढंग से ब्रेस में सेट, सेंसर चेहरे 14 मिमी x 7 मिमी आयताकार खोलने के ब्रेस से बाहर फैलाना चाहिए ।
        नोट: ये सेंसर ब्रेसिज़ अस्थायी रूप से वेल्क्रो या एक चिपकने वाला का उपयोग कर माउंट किया जा सकता है (अस्थायी बढ़ते उचित समायोजित और IR सेंसर प्लेसमेंट का अनुकूलन करने के लिए उपयोगी है) । वैकल्पिक रूप से, स्थायी रूप से साधन आधार में ड्रिलिंग छोटे गाइड छेद से माउंट और M2 शिकंजा के साथ ब्रेसिज़ को सुरक्षित.
    5. एक 7 "touchscreen एलसीडी डिस्प्ले से कनेक्ट 5v, GND, और प्रदर्शन धारावाहिक इंटरफ़ेस (DSI) एक बोर्ड कंप्यूटर के पिन । 7 "आरपीआई और एलसीडी डिस्प्ले असेंबली चित्रा5 में दिखाया गया है ।

5. किर Polymersomes via FNP कस्टम निर्मित उच्च गति सिरिंज पंप का उपयोग

  1. (विकल्प 1) ऑटो भागो मोड का उपयोग करें ।
    1. मुख्य मेनू से ऑटो चलाने का चयन करें । सिस्टम उपयोगकर्ताओं को स्वचालित रूप से परिशुद्धता स्लाइड की शुरुआत करने के लिए सिरिंज निष्कासन प्लेटफ़ॉर्म की स्थिति के लिए अनुमति देने के लिए संकेत देगा । सुनिश्चित करें कि धातु की थाली के सामने और पीछे की राह आगे बढ़ने से पहले स्पष्ट हो ।
    2. धारा २.५ और CIJ मिक्सर के महिला Luer connectors पर माउंट सीरिंज में वर्णित के रूप में 1 मिलीलीटर प्लास्टिक सीरिंज लोड करें । रियर निष्कासन कैरिज के आयताकार खोलने ( चित्र 5Eदेखें) में (संलग्न सीरिंज के साथ) CIJ मिक्सर लोड करें ।
    3. जीयूआई में स्लाइडर का उपयोग करके वांछित मोटर गति (इकाइयों: rpm) सेट (महत्वपूर्ण बातों के लिए नीचे नोट देखें) । इष्टतम मोटर गति विशिष्ट पंप और सेटअप पर निर्भर करेगा, लेकिन यहां प्रदान की CIJ मिक्सर चैनल आयामों के लिए कम से कम 1 मिलीलीटर/एस की एक प्रवाह दर सुनिश्चित करना चाहिए ।
      नोट: प्रवाह दर सेट करते समय निम्न पर विचार करें. ऊर्ध्वाधर हाथ संचालित FNP विंयास में, reactants की दर से सिरिंजों से निष्कासित कर रहे है ~ 1 मिलीलीटर/, लेकिन अत्यधिक चर सकता है जब हाथ चालित । यह बस सिरिंज प्रति बैरल है, जो दर जिस पर उपयोगकर्ता सिरिंज गोताख़ोर अग्रिम द्वारा नियंत्रित किया जाता है के माध्यम से प्रवाह की दर है । ध्यान दें कि 1 एमएल/दर छोटे व्यास नोक से निकास प्रवाह दर का जिक्र नहीं है । ऊपर निर्दिष्ट चैनल आयाम पर, ~ 1 मिलीलीटर/अशांत मिश्रण10के लिए एक उपयुक्त Reynold की संख्या सुनिश्चित करने के लिए बनाए रखा जाना चाहिए । विभिंन प्रवाह दरों के रूप में चैनल व्यास तदनुसार समायोजित करने के लिए एक Reynold की संख्या है कि अशांत परिस्थितियों का समर्थन करता है बनाए रखने के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । सिरिंज plungers एक सीधा धातु प्लेट, जो एक उच्च परिशुद्धता एल्यूमीनियम 24 वी ब्रश डीसी मोटर के लिए युग्मित साथ चलता है द्वारा उंनत कर रहे हैं । इस विंयास में, अधिकतम बैरल प्रवाह दर कारकों की एक संख्या से प्रभावित है, सहित (1) अधिकतम मोटर गति (४,२५२ rpm) और परिशुद्धता स्लाइड (१.२७ mm) के पेंच का नेतृत्व है कि मोटर शाफ्ट के लिए युग्मित है (2) मोटर का टोक़ (~ ०.२ N * पूर्ण के एम-एल oad टोक़), जो प्रवाह के लिए प्रतिरोध को दूर करने की जरूरत है (3) द्रव प्रवेश से वापस दबाव योगदान में और CIJ मिक्सर से बाहर निकलें, और (4) इस्तेमाल किया सीरिंज की ताकत (उपयोगकर्ताओं को सिरिंजों पर अभिनय बलों के प्रति जागरूक किया जाना चाहिए, और के सिरिंज का उपयोग उपयुक्त शक्ति) । के बारे में बिंदु (2), जब प्रवाह की दर में वृद्धि पर्याप्त टोक़ के लिए मोटर ठप करने से बचने जबकि वापस दबाव बढ़ाने के तहत स्थिर निष्कासन को बनाए रखने की आवश्यकता है । बैरल प्रवाह दर-के लिए प्रति बैरल प्रवाह है कि प्रणाली को प्राप्त कर सकते हैं, मामले पर विचार जहां FNP २ १-milliliter सीरिंज में लोड reactants का उपयोग किया जाता है उदाहरण देकर स्पष्ट करना । एक 1 मिलीलीटर प्राप्त करने के लिए/बैरल के माध्यम से प्रवाह दर, मोटर धातु की थाली दूरी गोताख़ोर लंबाई द्वारा परिभाषित अग्रिम चाहिए (~ ६८ mm एक ठेठ एक मिलीलीटर सिरिंज के लिए) एक सेकंड में । परिशुद्धता स्लाइड के १.२७ mm पेंच लीड प्रदान की, यह इस प्रकार है कि ४,२५२ rpm पर एक डीसी मोटर ऑपरेटिंग ~ ९० mm/s (७१ rev/s * 1.27 mm/एस करने के लिए मंच को आगे बढ़ाने में सक्षम है/ यह ~ १.३ एमएल/एस, जो 1 मिलीलीटर/एस लक्ष्य दर से अधिक की एक प्रति बैरल प्रवाह दर से मेल खाती है ।
    4. उपकरण चलाने से पहले, यह सुनिश्चित करने के लिए सिस्टम जांचें कि प्लेटफ़ॉर्म का पथ अवरोधों से स्पष्ट है, और यह कि आगे और पीछे IR निकटता डिटेक्टरों अवरोधों के स्पष्ट है (IR सेंसर सटीक स्लाइड के पास छोटे काले बक्से है टर्मिनलों चित्र 5Iदेखें) । यह भी सुनिश्चित करें कि CIJ मिक्सर से केशिका टयूबिंग आउटलेट एक उपयुक्त संग्रह कंटेनर में कराई है (उदा: ग्लास चोंच, आदि) ।
    5. सीरिंज से reactants निष्कासित करने के लिए और CIJ मिक्सर में, सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस में भागो बटन दबाएँ.
  2. (विकल्प 2) मैंयुअल रन मोड का उपयोग करें । ऊपर ऑटो चलाने मोड दिशाओं को देखें और कदम 5.1.5 करने के लिए निंन परिवर्तन नोट: प्रेस फॉरवर्ड बटन रन के पूरा होने के माध्यम से लगातार दबाया (यानी, एक पर प्रेस घटना के जवाब में मंच अग्रिम, और मोटर एक पर जारी घटना के जवाब में बंद हो जाएगा) ।
  3. (विकल्प 3) मैनुअल प्लेटफ़ॉर्म पोजिशनिंग मोड का उपयोग करें; यह मोड उपयोगकर्ताओं को सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस पर आगे और रिवर्स बटन के जवाब में कम गति (20% बिजली) पर मोटर चलाकर मंच की स्थिति के लिए अनुमति देता है ।

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Representative Results

यहां, हम हाइड्रोफिलिक और hydrophobic माल है कि vivo माउस और गैर मानव रहनुमा प्रशासन11,13में के लिए सुरक्षित है लदान में सक्षम nanocarriers के निर्माण के लिए एक सरल प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है । हम भी CIJ मिक्सर में समाधान के यांत्रिक रूप से नियंत्रित भिडंत के लिए एक कस्टम साधन के निर्माण के लिए एक विवरण के साथ, हमारे प्रतिनिधि परिणामों में इस्तेमाल किया बहुलक के संश्लेषण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल शामिल है. चित्रा 1 के संश्लेषण कदम के एक सिंहावलोकन प्रदान करता है खूंटी17-बीएल-पीपीएस३५-एसएच, diblock copolymer polymersome nanocarriers इकट्ठा स्व के लिए इस्तेमाल किया । खूंटी-बीएल-पीपीएस polymersomes चिकित्सीय और/या इमेजिंग एजेंटों के साथ लोड कोडांतरण के लिए FNP प्रोटोकॉल का एक सिंहावलोकन चित्रा 2में आरेखित है । बहुलक एक CIJ मिक्सर में दब गया था (योजनाबद्ध चित्रा 3ए में दिखाया, मूल रूप से 10में वर्णित) को एकीकृत आकृति विज्ञान के रूप में monodisperse polymersomes फार्म, जो गतिशील प्रकाश कैटरिंग (DLS) और क्रायोजेनिक द्वारा मान्य किया जा सकता संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (cryoTEM) (चित्रा बी3 सी)। FNP द्वारा गठित Polymersomes छोटे (चित्रा 3 डी) और अधिक monodisperse बाद impingements के साथ (चित्रा 3e) बन जाते हैं, और हाइड्रोफिलिक और hydrophobic कार्गो के साथ लोड किया जा सकता है (जैसे, lipophilic डाई, छोटे अणु किया चिकित्सकीय, प्रोटीन आदि; चित्र 4a) । ऊपर वर्णित बाँझ शर्तों के तहत गठित Nanocarriers endotoxin दोनों कच्चे नीले और लाल endotoxin परख द्वारा मुक्त कर रहे हैं और इस तरह की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्त इन विट्रो में और vivo अनुप्रयोगों में (चित्रा 4b, डेटा नहीं दिखाया गया है).

अंत में, हम डिजाइन और एक उपकरण का निर्माण किया है यांत्रिक रूप से नियंत्रण प्रवाह की दर और जिसके परिणामस्वरूप CIJ मिक्सर में समाधान की भिडंत (चित्रा 5) । इस उपकरण का निर्माण आवश्यक है, के रूप में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सिरिंज पंपों FNP के लिए आवश्यक प्रवाह दरों को प्राप्त नहीं कर सकते । कस्टम संशोधनों के अपवाद के साथ, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सिरिंज पंपों की गति सीमाओं को कम गति वाले स्टेपर मोटर्स के उनके उपयोग द्वारा लगाया गया है, जो मज़बूती से एक धीमी और स्थिर फैशन में द्रव को तिरस्कृत करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं. हमारे साधन में, प्रतिक्रिया निष्कासन 24 वी ब्रश डीसी मोटर के नियंत्रण के तहत एक सटीक स्लाइड द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जो धीमी गति से stepper के वाणिज्यिक सिरिंज पंपों में पाया मोटर्स की तुलना में अधिक से अधिक गति (४,२५२ rpm) को प्राप्त कर सकते हैं. कस्टम सॉफ्टवेयर एक बोर्ड कंप्यूटर पर चल रहे साधन (चित्रा 6) संचालित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । 2 डी चित्र भागों के 3d मॉडल के अलावा प्रदान किया गया है । सभी चित्र और मॉडल FreeCAD में बनाए गए थे (मुक्त स्रोत पैरामीट्रिक 3 डी सीएडी मॉडलिंग सॉफ्टवेयर) सुनिश्चित करें कि वे अत्यधिक अनुसंधान समुदाय के लिए सुलभ हैं । उपकरण के संचालन के लिए सॉफ्टवेयर पायथन 2.7.12 में लिखा गया था, कस्टम FNP प्रक्रियाओं के तेजी से विकास के लिए अनुमति देने के लिए nanocarriers के congruous उत्पादन सुनिश्चित (आकार, आकृति विज्ञान, आदि) । साधन के संचालन के लिए सॉफ्टवेयर अनुरोध पर उपलब्ध कराया जाएगा । उपयोगकर्ताओं को इस सॉफ्टवेयर अजगर 3 के साथ वर्तमान में संगत नहीं है कि ध्यान देना चाहिए; हालांकि, यह भविष्य के अद्यतन में बदल सकते हैं । प्रतिक्रियात्मक निष्कासन दर को नियंत्रित करके, इस यंत्र से मानवीय त्रुटि के चर को हाथ-ऑपरेशन से समाप्त करता है.

Figure 1
चित्र 1. खूंटी17के संश्लेषण के लिए संश्लेषण स्कीमा-बीएल-पीपीएस३६-एसएच. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. एक हाथ से संचालित CIJ मिक्सर में FNP के माध्यम से polymersomes का उत्पादन । FNP का उपयोग कर polymersomes के गठन के आरेख । खूंटी-बीएल-पीपीएस बहुलक hydrophobic कार्गो के साथ कार्बनिक विलायक में भंग कर दिया है, और भंग हाइड्रोफिलिक कार्गो के साथ जलीय विलायक के खिलाफ है । तेजी से मिश्रण CIJ मिक्सर के भीतर होता है, और समाप्ति बार या पिंगा जलीय विलायक के एक जलाशय में कमजोर पड़ने के माध्यम से गठन की प्रक्रिया को पूरा करने की अनुमति दी जा सकती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. FNP द्वारा गठित polymersomes का लक्षण वर्णन. (क) इस अध्ययन में प्रयुक्त CIJ मिक्सर की डिजाइन योजनाबद्ध । सभी माप मिलीमीटर में कर रहे हैं । (ख) 1 और 5 impingements के बाद FNP द्वारा गठित polymersomes का आकार वितरण, जैसा कि DLS द्वारा मापा जाता है । n = 6 योगों, नमूनों का मतलब ग्राफी कर रहे हैं । (ग) CIJ मिक्सर, स्केल बार = १०० एनएम के माध्यम से 1 और 5 impingements के बाद गठित polymersomes के उदाहरण cryoTEM छवियां । व्यास (डी) और FNP द्वारा गठित polymersomes के polydispersity सूचकांक (ई) , DLS द्वारा मापा । तुलना के लिए, पतली फिल्म निर्जलीकरण द्वारा गठित polymersomes, के साथ (tf-E) या बिना (tf-NE) बाद में बाहर निकालना, और विलायक फैलाव (एसडी) द्वारा गठित भी मापा गया, n = 3, त्रुटि सलाखों मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं । (ग)-(ङ) एलन एट अल से अनुमति के साथ लिया गया है । 11. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4. लोड हो रहा है दक्षता और endotoxin लक्षण वर्णन । (a) polymersomes के भीतर छोटे और अणुओं की लोडिंग क्षमता, n = 3, त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । (ख) बाँझ FNP द्वारा गठित polymersomes की कच्ची नीली एलपीएस परख, n = 6, त्रुटि पट्टियों मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5. CIJ मिक्सर में समाधान भिडंत के यांत्रिक नियंत्रण के लिए साधन । (क) 24 वी ब्रश डीसी मोटर । (ख) विद्युत आपूर्ति (२४ वी, २.५ ए). (ग) ४.५ "१.२७ mm पेंच नेतृत्व के साथ स्ट्रोक परिशुद्धता स्लाइड (एक पेंच बीम युग्मन द्वारा मोटर शाफ्ट से जुड़ा) । (घ) निष्कासन प्लेटफार्म आयताकार धातु प्लेटों और एल आकार के कोने ब्रेसिज़ से निर्माण किया । (ङ) CIJ मिक्सर. (च) निष्कासन कैरिज. (छ) एकल बोर्ड कंप्यूटर और 7 "touchscreen । (ज) mMotor नियंत्रण बोर्ड प्लास्टिक आवास (८३ मिमी x ५३ मिमी x ३५ मिमी) में डिब्बे । (i) IR सेंसर (गैर संपर्क तोड़-बीम गति सेंसरों) । (जंमू) आपातकालीन स्टॉप बटन (नेकां) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6. कोर तारों आरेख । एकल बोर्ड कंप्यूटर, मोटर नियंत्रक, और IR सेंसर के बीच प्राथमिक कनेक्शन प्रदर्शित किए जाते हैं । एलसीडी touchscreen कनेक्शन यहां प्रदर्शित नहीं कर रहे हैं, के रूप में इस घटक गैर आवश्यक है (उपयोगकर्ताओं के लिए एक मानक कंप्यूटर की निगरानी और माउस के बजाय उपयोग विकल्प चुन सकते हैं) । ध्यान दें कि प्रदर्शित विंयास में, 24 वी मोटर बिजली की आपूर्ति और एक बोर्ड कंप्यूटर बिजली की आपूर्ति अलग हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

हम diblock copolymer के रूप में खूंटी17-बीएल-पीपीएस३५-एसएच का उपयोग polymersomes के तेजी से निर्माण के लिए विस्तृत निर्देश प्रदान की है । Vesicular polymersomes प्राथमिक कुल हाइड्रोफिलिक खूंटी और hydrophobic पीपीएस ब्लॉक आणविक भार के इस अनुपात में इकट्ठे आकृति विज्ञान हैं । जब कई बार पिंग, वे एक व्यास और polydispersity कि मैच polymersomes एक २०० एनएम झिल्ली के माध्यम से पतली फिल्म जलयोजन के माध्यम से गठित होने के बाद बाहर निकाला है । इस प्रोटोकॉल इस प्रकार monodisperse polymersome nanocarriers के निर्माण के दौरान अतिरिक्त बाहर निकालना कदम के लिए की आवश्यकता समाप्त । Polymersomes FNP लोड के माध्यम से गठित दोनों हाइड्रोफिलिक और hydrophobic कार्गो, और बनाए रखने की प्रक्रिया11के माध्यम से उन अणुओं की अधिकता का निर्माण । अतिरिक्त प्रोटोकॉल जब आवश्यक बाँझ सुनिश्चित करने के लिए वर्णित हैं, polymersome योगों के गठन की अनुमति है कि endotoxin-मुक्त हैं और इसलिए जैव रासायनिक और प्रतिरक्षा परख के लिए उपयुक्त के रूप में के रूप में अच्छी तरह से vivo में प्रशासन के लिए सुरक्षित . हाथ से संचालित CIJ मिक्सर स्थापित करने के लिए सरल है और उपयोगकर्ता के लिए आसानी से उपयोग प्रदान करता है, लेकिन उपयोगकर्ता परिवर्तनशीलता के कारण संभावित गुणवत्ता नियंत्रण मुद्दों का परिचय. प्रवाह निरंतरता बनाए रखने के लिए, हम एक साधन को प्राप्त करने और एक तुलनीय प्रवाह दर को बनाए रखने में सक्षम reproducibly बनाने की मांग की । महत्वपूर्ण बात, ऊपर निर्दिष्ट चैनल आयामों पर, वाणिज्यिक सिरिंज पंपों पर्याप्त उच्च प्रवाह दरों को प्राप्त नहीं कर सकते (~ 1 एमएल/कम गति stepper मोटर्स के साथ सुसज्जित होने के कारण). इस मुद्दे का मुकाबला करने के लिए, और प्रवाह की दर, FNP के लिए एक उच्च गति सिरिंज पंप के निर्माण पर अधिक से अधिक नियंत्रण बर्दाश्त करने के लिए वर्णित किया गया था । देखभाल प्रणाली ओएस और कोड के लिए खुला स्रोत और आसानी से अनुकूलन सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए लिया गया था ।

वैकल्पिक प्रवाह दरों पर नियंत्रण nanocarrier निर्माण ठीक धुन की क्षमता प्रदान करता है और आगे विविध nanocarrier morphologies के विधानसभा का पता लगाने के लिए अवसर प्रदान करता है । रेनॉल्ड्स नंबर और इसी मिश्रण समय पहले FNP9के माध्यम से गठित ठोस कोर nanocarriers के आकार को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया था, लेकिन यह polymersomes के गठन पर क्या प्रभाव पड़ता है यह स्पष्ट नहीं है. यह वर्तमान जांच का एक विषय है, वर्तमान सिफारिश की दर के साथ ०.५ जा रहा है 2 मिलीलीटर/एस, प्रतिनिधि परिणामों के साथ लगभग 1 मिलीलीटर पर प्रदर्शन किया/ आगे भी प्रवाह की दर पर नियंत्रण बढ़ाने के लिए, यह सिरिंज पंप मोटर पर वास्तविक समय नियंत्रण के साथ लिनक्स आधारित ओएस की जगह के लिए आवश्यक हो सकता है.

प्रवाह की दर को समायोजित करने के अलावा, वहां तरीके इस FNP प्रोटोकॉल suite विशिष्ट जरूरतों या अनुप्रयोगों के लिए संशोधित किया जा सकता है की एक संख्या हैं । छोटी या बड़ी मात्रा में बहुलक का उपयोग किया जा सकता है । सांद्रता के रूप में कम के रूप में 1 मिलीग्राम/एमएल और के रूप में उच्च के रूप में १०० मिलीग्राम/एमएल स्थिर nanocarriers फार्म का इस्तेमाल किया गया है । बड़ी मात्रा में भिडंत के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि हाथ चालित FNP के दौरान दबाव के अनुरूप आवेदन अधिक मुश्किल है खंड पर 1 मिलीलीटर प्रति सिरिंज से अधिक है । जलाशय की मात्रा को भी संशोधित किया जा सकता है । अंतिम कार्बनिक: 1:3 से अधिक के जलीय विलायक अनुपात nanocarriers के अपूर्ण गठन में परिणाम हो सकता है, और इस तरह की देखभाल nanocarriers के गठन की पुष्टि के बिना जलाशय की मात्रा में कमी नहीं करने के लिए लिया जाना चाहिए । एकत्रीकरण हो सकता है जब hydrophobic कार्गो के उच्च सांद्रता लोड करने का प्रयास है, जो आम तौर पर बहुलक के दाढ़ अनुपात में वृद्धि से समाप्त किया जा सकता है: कार्गो ।

एक अतिरिक्त अंवेषण के लिए खुला विषय FNP polymersome गठन के आगे विस्तार के लिए खूंटी से परे अंय बहुलक प्रणालियों-बीएल-पीपीएस शामिल है । वास्तव में, अंय प्रणालियों micelles और ठोस-कोर ड्रग nanocarriers16,17के गठन में पहले से इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है अगर वहां मानकों का एक सेट है कि उन अंय बहुलक प्रणालियों का उपयोग कर FNP के माध्यम polymersomes के गठन के लिए नेतृत्व कर सकते है । संभावित चर की संख्या को देखते हुए पता लगाने के लिए, यह पूरी तरह संभव है कि अंय पॉलिमर समायोजित प्रयोगात्मक मापदंडों के साथ FNP के माध्यम से polymersomes या अंय नरम nanoarchitectures फार्म कर सकते हैं, प्रवाह की दर, तापमान, विलायक चयन और बहुलक एकाग्रता ।

सभी निर्माण तकनीकों के साथ के रूप में, वहां FNP और प्रतिबंध है कि कुछ अनुप्रयोगों अस्थिर कर सकते है सीमाएं हैं । तेजी से मिश्रण प्रक्रिया की आवश्यकता है कि कार्बनिक और जलीय सॉल्वैंट्स मिश्रणीय है, जो कई diblock copolymers के विघटन के लिए इस्तेमाल कुछ आम सॉल्वैंट्स का उपयोग precludes, जैसे, dichloromethane और क्लोरोफॉर्म । कुछ पॉलिमर इसलिए FNP के साथ असंगत प्रदान किया जा सकता है अगर वे सक्षम नहीं है एक पानी में भंग किया जा मिश्रणीय विलायक कार्बनिक । FNP प्रोटोकॉल यहां वर्णित जलीय विलायक, जो इस तरह के कुछ जैव सक्रिय प्रोटीन के रूप में कार्बनिक विलायक के उच्च सांद्रता के प्रति संवेदनशील पेलोड की गतिविधि कम हो सकता है के लिए कार्बनिक के एक 1:1 अनुपात का इस्तेमाल करता है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस पर प्रभाव पड़ता है, प्रोटीन पर निर्भर करता है के रूप में हम पहले से कम प्रभाव पाया है क्षारीय फॉस्फेट के एंजाइमी गतिविधि पर polymersomes भीतर लोड हो रहा है11FNP द्वारा निंनलिखित । बहु प्रवेश भंवर मिक्सर18 एक और अधिक महंगी लेकिन अधिक अनुकूलन FNP मंच है कि जलीय सॉल्वैंट्स के लिए कार्बनिक के अनुपात पर अतिरिक्त नियंत्रण प्रदान करता है, इन संदर्भों के लिए CIJ मिक्सर के लिए एक बहुमुखी विकल्प की पेशकश कर रहे हैं ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम पश्चिमोत्तर विश्वविद्यालय में संरचनात्मक जीवविज्ञान सुविधा से स्टाफ और इंस्ट्रूमेंटेशन समर्थन स्वीकार करते हैं । पश्चिमोत्तर विश्वविद्यालय और पश्चिमोत्तर विश्वविद्यालय संरचनात्मक जीव विज्ञान सुविधाओं के R.H. Lurie व्यापक कैंसर केंद्र से समर्थन स्वीकार किया है । गतान K2 प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर शिकागो समुदाय ट्रस्ट में Searle कोष से समर्थन के साथ शिकागो बायोमेडिकल कंसोर्टियम द्वारा प्रदान की गई धनराशि के साथ खरीदा गया था । हम भी उत्तर पश्चिमी विश्वविद्यालय में निंनलिखित सुविधाएं: उबकना अनुशासनात्मक सतह विज्ञान सुविधा, संरचनात्मक जीवविज्ञान की सुविधा, जैविक इमेजिंग सुविधा, उंनत आणविक इमेजिंग के लिए केंद्र, और विश्लेषणात्मक नैनो उपकरणों के कोर । इस शोध को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान १४५३५७६, स्वास्थ्य निदेशक के नए आविष्कारक पुरस्कार 1DP2HL132390-01 के राष्ट्रीय संस्थानों, पुनर्अपक्षयी Nanomedicine उत्प्रेरक पुरस्कार और २०१४ McCormick उत्प्रेरक पुरस्कार के लिए केंद्र द्वारा समर्थित किया गया । SDA NIH डॉक्टरेट जैव प्रौद्योगिकी प्रशिक्षण अनुदान T32GM008449 द्वारा भाग में समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate Starter Kit - 32 GB Edition CanaKit UPC 682710991511
Linear Bearing Platform (Small) - 8mm Diameter Adafruit 1179
Linear Motion 8 mm Shaft, 330 mm Length, Chrome Plated, Case Hardened, Metric VXB kit11868
Linear Rail Shaft Guide/Support - 8 mm Diameter Adafruit 1182
Manual-Position Precision Slide 4.5" Stroke, 15 lb load capacity McMaster-Carr 5236A16
MTPM-P10-1JK43 Iron Horse DC motor Iron Horse MTPM-P10-1JK43
Official Raspberry Pi Foundation 7" Touchscreen LCD Display Raspberry Pi B0153R2A9I (ASIN)
PicoBorg Reverse - Advanced motor control for Raspberry Pi PiBorg BURN-0011
Pololu Carrier with Sharp GP2Y0D810Z0F Digital Distance Sensor 10cm Pololu 1134
Ruland PSR16-5-4-A Set Screw Beam Coupling, Polished Aluminum, Inch, 5/16" Bore A Diameter, 1/4" Bore B Diameter, 1" OD, 1-1/4" Length, 44 lb-in Nominal Torque Ruland PSR16-5-4-A
Polyethylene glycol monomethyl ether Sigma Aldrich 202495
Methanesulfonyl chloride Sigma Aldrich 471259
Toluene Sigma Aldrich 179418
Toluene, Anhydrous Sigma Aldrich 244511
Triethylamine Sigma Aldrich T0886
Celite 545 (Diatomaceous Earth) Sigma Aldrich 419931
Dichloromethane Sigma Aldrich 320269
Diethyl ether Sigma Aldrich 296082
N,N-Dimethylformamide, anhydrous Sigma Aldrich 227056
Potassium carbonate Sigma Aldrich 791776
Thioacetic acid Sigma Aldrich T30805
Tetrahydrofuran Sigma Aldrich 360589
Aluminum oxide, neutral, activated, Brockmann I Sigma Aldrich 199974
Sodium methoxide solution, 0.5 M in methanol Sigma Aldrich 403067
Propylene sulfide Sigma Aldrich P53209
Acetic acid Sigma Aldrich A6283
Methanol Sigma Aldrich 320390
Sodium hydroxide solution 1.0 N Sigma Aldrich S2770
Endotoxin-free water GE Healthcare Life Sciences SH30529.01
Paper pH strips Fisher Scientific 13-640-508
Endotoxin-free Dulbecco's PBS Sigma Aldrich TMS-012
Borosilicate glass scintillation vials Fisher Scientific 03-337-4
1 mL all-plastic syringe Thermo Scientific S75101
Sepharose CL-6B Sigma Aldrich CL6B200
Liquid chromatography column Sigma Aldrich C4169
CIJ mixer, HDPE Custom
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
Hydrogen peroxide solution Sigma Aldrich 216763
HEK-Blue hTLR4 InvivoGen hkb-htlr4
RAW-Blue Cells InvivoGen raw-sp
QUANTI-Blue InvivoGen rep-qb1
PYROGENT Gel Clot LAL Assays Lonza N183-125

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References

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समस्या १३८ nanomaterial nanocarrier सामग्री नियंत्रित वितरण आत्म विधानसभा फ़्लैश nanoprecipitation निर्माण बहुलक ब्लॉक copolymer
रैपिड, स्केलेबल विधानसभा और सक्रिय प्रोटीन की लोडिंग और विविध सिंथेटिक Nanocarriers में फ्लैश Nanoprecipitation के माध्यम से Immunostimulants
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Allen, S., Vincent, M., Scott, E.… More

Allen, S., Vincent, M., Scott, E. Rapid, Scalable Assembly and Loading of Bioactive Proteins and Immunostimulants into Diverse Synthetic Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation. J. Vis. Exp. (138), e57793, doi:10.3791/57793 (2018).

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