Summary
Nanomaterialen bieden veelzijdige mechanismen van gecontroleerde therapeutische aflevering voor zowel basiswetenschap en translationeel toepassingen, maar hun fabricage vaak vereist expertise die niet beschikbaar is in de meest biomedische laboratoria. Hier presenteren we protocollen voor het schaalbare fabricage en therapeutische laden van uiteenlopende zelf gemonteerd nanocarriers met behulp van flash nanoprecipitation.
Abstract
Nanomaterialen presenteren een breed scala van opties voor het aanpassen van de gecontroleerde aflevering van enkelvoudige en gecombineerde moleculaire payloads voor therapeutische en imaging-toepassingen. Deze verhoogde specificiteit kan belangrijke klinische gevolgen, met inbegrip van verminderde bijwerkingen en lagere doseringen met hogere potentie hebben. Bovendien, de in situ richten en gecontroleerde modulatie van specifieke cel deelverzamelingen kunnen verbeteren in vitro en in vivo onderzoeken van elementaire biologische fenomenen en sonde functie cel. Helaas, de daarvoor vereiste deskundigheid in nanoschaal wetenschap, scheikunde en techniek vaak verbieden laboratoria zonder ervaring op deze terreinen fabriceren en aanpassen van nanomaterialen als hulpmiddelen voor hun onderzoek of voertuigen voor hun therapeutische strategieën. Wij bieden hier protocollen voor de synthese en schaalbare vergadering van een veelzijdige niet-toxisch copolymeer bloksysteem vatbaar voor de facile vorming en laden van nanoschaal voertuigen voor biomedische toepassingen. Flash nanoprecipitation wordt gepresenteerd als een methode voor het snelle fabricage van diverse nanocarriers van poly(ethylene glycol) -bl-poly (propyleen sulfide) copolymeren. Deze protocollen zal toestaan laboratoria met een breed scala van deskundigheid en middelen om gemakkelijk en reproducibly fabriceren geavanceerde nanocarrier levering systemen voor hun toepassingen. Het ontwerp en de bouw van een geautomatiseerd instrument die gebruikmaakt van een high-speed-spuitpomp ter vergemakkelijking van de flash nanoprecipitation verwerken en om verbeterde controle over de homogeniteit, grootte, morfologie en laden van polymersome nanocarriers is beschreven.
Introduction
Nanocarriers toestaan voor de gecontroleerde aflevering van kleine en macromoleculaire lading, waaronder actieve entiteiten dat als niet ingekapseld, zou een zeer afbreekbaar en/of voor toediening in vivote hydrophobic. Van de nanocarrier morphologies regelmatig vervaardigd, bieden polymere blaasjes analoog aan liposomen (ook wel polymersomes genoemd) de mogelijkheid voor het gelijktijdig laden van hydrofiele en hydrofobe lading1,2. Ondanks hun veelbelovende voordelen zijn polymersomes nog steeds zeldzaam in klinische toepassingen, gedeeltelijk vanwege enkele cruciale uitdagingen goed opgepakt in hun productie. Voor klinisch gebruik moeten polymersome formuleringen plaatsvinden in grootschalige, steriel en consistente partijen.
Een aantal technieken kan worden gebruikt om de vorm polymersomes van een copolymeer van diblock, zoals poly(ethylene glycol) -blok-poly (propyleen sulfide) (PEG -bl- PPS), die bevatten oplosmiddelen dispersie3, dunne film rehydratie1 , 4, microfluidics 5,6en directe hydratatie7. Oplosmiddel dispersie omvat lange incubatie tijden in de aanwezigheid van organische oplosmiddelen, die kunnen sommige bioactieve payloads, zoals eiwitten denatureren. Dunne film rehydratie biedt geen controle over de polydispersiteit van het gevormde polymersomes, vaak duurder en tijdrovender extrusie technieken om aanvaardbare monodispersity vereist. Bovendien zijn zowel microfluids als directe hydratatie moeilijk te schaal voor grotere productievolumes. Van de verschillende nanocarrier fabricage methoden biedt flash nanoprecipitation (FNP) de mogelijkheid om grootschalige en reproduceerbare formuleringen8,9,10. Terwijl de FNP was eerder gereserveerd voor de formulering van solid-core nanodeeltjes, ons lab heeft onlangs uitgebreid het gebruik van de FNP te nemen van de consistente vorming van uiteenlopende PEG -bl- PPS nanostructuur morphologies11, 12, met inbegrip van polymersomes11 en bicontinuous nanospheres12. We vonden dat FNP kan vormen monodispers formuleringen van polymersomes zonder de noodzaak voor extrusie was, wat resulteert in superieure polydispersiteit indexwaarden in vergelijking met niet-geëxtrudeerde polymersomes gevormd door dunne film rehydratie en oplosmiddel dispersie 11. Bicontinuous nanospheres, met hun grote hydrofobe domeinen, konden niet worden gevormd door dunne film rehydratie, ondanks die onder een aantal oplosmiddel voorwaarden met FNP12.
Hier, wij bieden een gedetailleerde beschrijving voor de synthese van de PEG -bl- PPS diblock copolymeren gebruikt bij de vorming van de polymersome, de beperkte impingement jets (CIJ) mixer gebruikt voor FNP, de FNP protocol zelf, en de implementatie van een geautomatiseerd systeem te reduceren van variabiliteit van de gebruiker. Informatie over het steriliseren van het systeem om voldoende te produceren endotoxine-vrije formuleringen voor gebruik in vivoen representatieve gegevens over de karakterisering van polymersomes gevormd door de FNP is inbegrepen. Met deze informatie, zal lezers met belangstelling voor gebruik te maken van de polymersomes in vitro en in vivo arbeidsongeschiktheid zitten kundig voor fabriceren hun eigen steriele, monodispers-formuleringen. Lezers met ervaring in de formuleringen van de nanocarrier en met polymeer synthese expertise zal zitten kundig voor hun eigen polymeersystemen FNP gebruiken als een potentiële alternatief voor hun huidige formulering technieken snel te testen. Bovendien kunnen de hierin beschreven protocollen worden gebruikt als leermiddelen voor de formulering van de nanocarriers in nanotechnologie laboratorium cursussen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. synthese van Poly(ethylene glycol) -blok-poly (propyleen sulfide)-Thiol
- Synthetiseren methoxy-poly(ethylene glycol) mesylaat (Mn: 750) (MeO-PEG17-Ms, ik).
- Los 10 g MeO-PEG17-OH in 200 mL 100% tolueen binnen een 3-hals ronde onderkant kolf (RBF) onder magnetische roeren bij 600 omwentelingen per minuut.
- De 3-hals RBF verbinden met een Dean-Stark apparaat, zelf verbonden met een koeler, houd het hele systeem onder inert gas, stikstof of argon.
- Plaats de 3-hals RBF in een oliebad, warmte tot 165 ° C al roerend bij 600 omwentelingen per minuut.
- Verwijder sporen water en 100 mL tolueen met behulp van Azeotropisch distillatie.
- De 3-hals RBF uit olie verwijderen, loskoppelen van het apparaat Dean-Stark met behoud van inert gas voorwaarden en laat afkoelen tot kamertemperatuur.
- Voeg 5,6 mL 100% triethylamine (3 molaire eq.) en 300 mL watervrij 100% tolueen MeO-PEG17-OH oplossing al roerend bij 600 omwentelingen per minuut.
- De 3-hals RBF verplaatsen naar een ijsbad, roeren op 600 rpm en inert gas voorwaarden te handhaven.
- Verdun 3.1 mL voor 100% methanesulfonyl chloride (3 molaire eq.) in 30 mL 100% tolueen, langzaam toevoegen aan de 3-hals RBF via een trechter toevoeging al roerend bij 600 omwentelingen per minuut.
- Roer 's nachts bij 600 omwentelingen per minuut bij kamertemperatuur onder inert voorwaarden.
- Filter oplossing via een Buchner trechter vol met diatomeeënaarde (Zie Tabel van materialen) te verwijderen van zouten.
- Verwijder tolueen via een rotatieverdamper met het waterbad ingesteld op 40 ° C, rotatie bij 120 omw / m, en druk tussen 50-100 mbar instelt.
- Opnieuw los product in 200 mL 100% dichloormethaan (DCM), en filtreer door een Buchner trechter vol met diatomeeënaarde (Zie Tabel van materialen).
- Verwijder DCM via een rotatieverdamper met het waterbad ingesteld op 40 ° C, rotatie bij 120 omw / m, en druk ingesteld op tussen de 450-600 mbar.
- Spaarzaam opnieuw los product in 100% DCM en langzaam precipiteren product door het ontkleuring (via Pipet van Pasteur) toe te voegen aan 500 mL ijskoud 100% diethylether. Blijven roeren bij 300 omwentelingen per minuut.
- Decanteren of gecombineerd Schakel diethylether van geprecipiteerde product, MeO-PEG17- mesylaat, en winkel overnachting in vacuüm exsiccator volledig drogen.
- Gebruik product onmiddellijk, of opslag onder inert gas bij-20 ° C voor enkele maanden.
- Synthetiseren methoxy-poly(ethylene glycol) thioacetate (MeO-PEG17-TA, II).
- Los 5 g MeO-PEG17-Ms (I) in 200 mL 100% watervrij dimethylformamide (DMF) in een 3-hals RBF, roer bij 600 omwentelingen per minuut bij kamertemperatuur onder inert gas.
- 2.5 g 100%-kaliumcarbonaatoplossing (3 molaire eq.) aan het roeren oplossing toevoegen.
Opmerking: kaliumcarbonaat zal niet volledig oplossen in oplossing. - Verdun 1.3 mL voor 100% thioacetic zuur (3 molaire eq.) in 100 mL voor 100% watervrij DMF, en ontkleuring toevoegen aan oplossing via een trechter toevoeging.
Opmerking: Thioacetic zuur heeft een geur sterk, onaangenaam. Wees voorzichtig om te houden van alle bevuilde objecten binnen de chemische zuurkast 's nachts voorafgaand aan verwijdering of reiniging. - Roer krachtig (rpm 600 of hoger) 's nachts bij kamertemperatuur.
Opmerking: Zout vorming kan gemakkelijk verstoren de roeren van deze oplossing. Wees voorzichtig om 's nachts te roeren. - Filter oplossing via een Buchner trechter vol met diatomeeënaarde (Zie Tabel van materialen).
- Verwijder DMF via een rotatieverdamper met het waterbad ingesteld op 60 ° C, rotatie bij 120 omw / m, en de druk instellen tussen 5-15 mbar.
- Los product in 100% tetrahydrofuraan (THF) 100 mL en voeg toe aan een kolom vol met neutrale aluminiumoxide rood/oranje gekleurde onzuiverheden te verwijderen.
- Verwijder THF via een rotatieverdamper met het waterbad ingesteld op 40 ° C, rotatie bij 120 omw / m, en druk ingesteld op tussen 200-300 mBar.
- Spaarzaam opnieuw los product in 100% DCM. Als een zout neerslag vormt, filter oplossing via 6 μm porie filter papierformaat met een Buchner trechter.
- Langzaam precipiteren product door toevoeging van ontkleuring via Pipet van Pasteur aan 500 mL ijskoud 100% diethylether, roeren bij 300 omwentelingen per minuut. Diethylether wellicht verder worden gekoeld tot-20 ° C in een explosieveilige vriezer urenlang als neerslag niet crasht uit oplossing bij 4 ° C.
- Decanteren of gecombineerd Schakel diethylether van geprecipiteerde product, MeO-PEG17-Thioacetate. 'S nachts produkt opslaat in een vacuüm exsiccator, en vervolgens onder inert gas bij-20 ° C.
- Synthetiseren diblock copolymeren poly(ethylene glycol) -blok -poly(propylene sulfide)-thiol (PEG17-bl- PPS35-SH, III).
- MeO-PEG17-TA (II) oplossen in 10 mL voor 100% watervrij DMF binnen een kolf Schlenk onder argon, al roerend bij 400 t/min in een waterbad kamertemperatuur.
- Voeg 1.1 molaire eq van natrium methoxide (0,5 M-oplossing in methanol), toestaan aan het roer bij 400 t/min gedurende 5 minuten.
- 35 molaire eq van 100% propyleen sulfide, snel, aan de oplossing toevoegen. Laat het roer bij 400 omwentelingen per minuut gedurende 10 minuten.
- Toevoegen van 10 molaire eq 100% ijsazijn, toe aan het roer bij 400 t/min gedurende 5 minuten.
- Verwijder DMF via een rotatieverdamper met het waterbad ingesteld op 60 ° C, rotatie bij 120 omw / m, en de druk instellen tussen 5-15 mbar.
- Opnieuw los product spaarzaam in 100% DCM, neerslag in 80 mL 100% methanol, verdeeld over twee 50 mL conische centrifuge buizen.
- De conische buisjes centrifuge bij 7500 x g gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Gecombineerd weg supernatant.
- Winkel product, PEG17-bl- PPS35-SH, overnachting in een vacuüm exsiccator, en vervolgens onder inert gas bij-20 ° C.
2. Monteer PEG -bl -PPS Nanocarriers via Hand-Powered Flash Nanoprecipitation
- (Optioneel) Het steriliseren van de beperkte impingement jets (CIJ) mixer.
- Binnen een biologische veiligheidskast (BSC), onderdompelen mixer met alle onderdelen gedemonteerd binnen 0,1 M NaOH's nachts.
- Monteer CIJ mixer, en stroom door endotoxine-gratis water met behulp van luer-lock spuiten.
- Controleer de pH van het water, en blijven stromen van water door tot pH registers als neutraal.
- Ontbinden van PEG17-bl- PPS35-SH polymeer en hydrofobe lading in THF (impingement oplossing 1).
- Weeg 20 mg PEG17-bl- PPS35-SH in een 1,5 mL-buis.
- Toevoegen van hydrofobe kleurstoffen (bijvoorbeeldDiI, ICG), drugs (bijvoorbeeldrapamycin), of andere lading.
Opmerking: Cargo mogelijk droog, of in een water-mengbare oplosmiddelen, bij voorkeur THF opgeloste. Als lading onoplosbaar in THF of DMF is, kan een andere water-mengbare oplosmiddelen worden gebruikt, maar spaarzaam, als het polymeer is waarschijnlijk niet oplosbaar. De hoeveelheid lading die kan worden geladen is afhankelijk van de eigenschappen van de lading zelf (bijvoorbeeld het molecuulgewicht, hydrophobicity, sterische overwegingen), en zou moeten worden onderzocht op een case-by-case basis11,12. - Voeg 500 µL van 100% THF aan de polymeer en lading, vortex krachtig te ontbinden.
- Hydrofiele lading in waterige buffer (impingement oplossing 2) los. Los hiervoor hydrofiele lading moet worden geladen in polymeer blaasjes in 500 µL van een waterige buffer (bijvoorbeeld met fosfaat gebufferde zoutoplossing, zuiver water, enz.) zo nodig.
- Buffer aan reservoir toevoegen.
- 2,5 mL van een waterige buffer van keuze (bijvoorbeeld 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing) toevoegen aan een voldoende grote reservoir (bijvoorbeeld een flesje van 20 mL glas Scintillatie). Plaats reservoir onder CIJ mixer zodanig dat de uitstroom uit de mixer direct het reservoir komt.
- Impingement oplossingen in aparte 1 mL plastic disposable spuiten laden.
- Aantasten oplossingen tegen elkaar om tegelijkertijd vormen van nanostructuren en ze laden met de lading.
- Spuiten in Luer-lock adapters aan de bovenkant van de mixer CIJ invoegen.
- Drukken in een enkele, vloeiende en snelle beweging, beide spuiten gelijktijdig en met gelijke kracht.
Opmerking: Als u meerdere opeenvolgende problemen uitvoert, eerst verzamelen uitstroom in een lege reservoir. - (Optioneel) Het uitvoeren van meerdere problemen. Split ontluikende nanostructuur oplossing tussen twee spuiten, en herhaal stap 2.6.1-2.6.2 tot 4 keer.
- Verzamelen van uitstroom in het waterige buffer gevuld reservoir bereid in 2.4.1 en zachtjes roeren zodat mengen.
- Gelost lading en/of organische oplosmiddelen verwijderen.
- (Optie 1) Dialyze nanocarrier formulering in de dezelfde waterige buffer die wordt gebruikt voor impingement en in het reservoir, met behulp van de buis van een passende MW cutoff gedurende ten minste 24 uur met ten minste 2 wijzigingen van de buffer. Dit kan worden uitgevoerd bij kamertemperatuur.
Opmerking: Nanocarriers zal worden bewaard door buizen met een MW cutoff < 100.000 kDa en potentieel kan worden gehandhaafd door hogere cutoffs ook. Deze optie houdt steriliteit wanneer uitgevoerd in een BSC met behulp van steriele buffer. - (Optie 2) Filteren formulering via een grootte uitsluiting of ontzouten/buffer wisselingskolom (bijvoorbeeld Sepharose 6B kolom) 1 x PBS als de waterige buffer gebruiken.
Opmerking: Deze optie handhaaft steriliteit wanneer uitgevoerd in een BSC met een kolom die grondig is gesteriliseerd. - (Optie 3) Verwijder de vluchtige organische oplosmiddelen, met behulp van vacuüm uitdroging 's nachts.
- (Optie 4) Filteren van formulering met behulp van een tangentiële filtratie-stroomsysteem met behulp van een 50-100 kDa filter op een debiet van 20-60 mL/min gedurende 15 minuten tot 1 uur, afhankelijk van het molecuulgewicht van de unencapsulated lading weg wordt gezuiverd (grotere lading zal langer duren).
- (Optie 1) Dialyze nanocarrier formulering in de dezelfde waterige buffer die wordt gebruikt voor impingement en in het reservoir, met behulp van de buis van een passende MW cutoff gedurende ten minste 24 uur met ten minste 2 wijzigingen van de buffer. Dit kan worden uitgevoerd bij kamertemperatuur.
- (Optioneel) De formulering van de nanocarrier te concentreren.
- (Optie 1) Concentreren met behulp van een spin concentrator systeem (bijvoorbeeld spin kolom met MW cutoff > 100.000), gebruikt zoals beschreven door de fabrikant.
Opmerking: Nanocarriers wellicht geresuspendeerde worden tussen de draaiingen en vereisen een aantal draaiingen te concentreren tot gewenste volume. Spin concentratie kan verminderen steriliteit van nanocarrier formuleringen. - (Optie 2) Volume met behulp van vacuüm uitdroging te verlagen.
Opmerking: Volumeverandering is moeilijk te controleren in deze omstandigheden, en moet worden gezorgd om osmolariteit vóór en na de concentratie.
- (Optie 1) Concentreren met behulp van een spin concentrator systeem (bijvoorbeeld spin kolom met MW cutoff > 100.000), gebruikt zoals beschreven door de fabrikant.
- Opslaan nanocarriers bij 4 ° C voor weken tot maanden. Vóór gebruik na opslag, kort vortex nanocarrier formuleringen.
3. het karakteriseren van Nanocarrier formuleringen
-
Maatregel laden van efficiëntie
- Als vracht tl is of sterk bij een bepaalde golflengte buiten 260-450 nm absorbeert, meet fluorescentie/extinctie met behulp van een fluorimeter/spectrofotometer.
Opmerking: PEG -bl- PPS absorbeert sterk van 260-310 nm en polymersome formuleringen absorberen van 310-450 nm, waarin kwantificering van lading die op een soortgelijk golflengte absorbeert kan bemoeilijken. - Als lading binnen het bereik van 260-450 nm absorbeert en hydrofiele, PEG -bl- PPS nanostructuren verstoren door het toevoegen van 25 μL van de formulering op een gelijk volume van 1% H2O2 of 1% Triton X-100 en vervolgens scheiden en onderscheiden lading van polymeer absorptie via krachtige vloeibare chromatografie (HPLC) met behulp van een grootte uitsluiting kolom compatibel met waterige buffers (bijvoorbeeld een kolom Sepharose 6B) 11.
- Als lading binnen het bereik van 260-450 nm absorbeert en oplosbaar in THF of DMF is, lyophilize de formulering door bevriezing 100 μl in een plastic buis van 1,5 mL bij-80 ° C's nachts. Plaats vervolgens de buis in een vacuum glas-container en plaats op een lyophilizer. Kan 24 uur duren voordat lyofilisatie te laten plaatsvinden en vervolgens opnieuw los in 50 μl van DMF of THF vóór scheiding en opsporing via HPLC.
- Als vracht tl is of sterk bij een bepaalde golflengte buiten 260-450 nm absorbeert, meet fluorescentie/extinctie met behulp van een fluorimeter/spectrofotometer.
-
Maatregel nanocarrier grootte en morfologie
- Gebruik dynamische lichtverstrooiing (DLS)11 of nanoparticle bijhouden analyse13 om nanocarrier grootte te meten.
Opmerking: Nanocarriers gevormd van PEG17-bl- PPS35-SH naar verwachting hebben een gemiddelde diameter van tussen de 100-200 nm, met een polydispersiteit index < 0.3. - Nanocarrier morfologie met behulp van cryogene Transmissie Electronenmicroscopie (cryoTEM)14bepalen.
Opmerking: Nanocarriers gevormd van PEG17-bl- PPS35-SH naar verwachting polymeer blaasjes (polymersomes) met een duidelijk waarneembare polymere membraan en grotendeels bolvorm.
- Gebruik dynamische lichtverstrooiing (DLS)11 of nanoparticle bijhouden analyse13 om nanocarrier grootte te meten.
-
(Optioneel) Test formuleringen voor endotoxinen
- (Optie 1) Gebruik van een cel-gebaseerde bepaling voor de aanwezigheid van endotoxinen, bijvoorbeeld RAW blauwe cellen of HEK blauwe TLR4 cellen (Zie Tabel of Materials), zoals beschreven door fabrikant, in beide een kwantitatieve of kwalitatieve assay voor lipopolysacchariden (LPS)13 .
- (Optie 2) Gebruik een Limulus Amebocyte Lysate (LAL)15 assay kit, zoals beschreven door de fabrikant.
4. de fabricage van een high-speed-spuitpomp voor FNP
- Aangepaste instrument onderdelen fabriceren.
Opmerking: 3D-modellen voor het verspanen van alle aangepaste onderdelen vindt u in de aanvullende materialen.- Machine van de multi-gelaagde instrument van ¾" acrylplaten chassis en monteren (Zie Aanvullende bestanden 1-5).
Opmerking: Acryl heeft slechte chemische weerstand. Als het instrument is om met agressieve oplosmiddelen worden gebruikt, de basis van een metal machine geschikt wordt geacht voor de toepassing. - 3D print delen met afgedrukt met polylactide (PLA) plastic.
- De spuit uitzetting (SE) 2-delige apparaat afdrukken: SE deel 1 - achterzijde FNP blok houden vervoer (figuur 5F, grijze deel; Aanvullende bestand 6) en SE deel 2 - Front uitzetting guide (figuur 5F, zwarte deel; Aanvullende bestand 7). Zie aanvullende bestand 2 voor schema's.
- Afdrukken van de infrarode sensor accolades (figuur 5I, zwarte dozen; Aanvullende bestanden 8 en 9).
- (Optioneel) De dubbele spuit plunjer brace afdrukken.
- Machine van de multi-gelaagde instrument van ¾" acrylplaten chassis en monteren (Zie Aanvullende bestanden 1-5).
- Instrument chassis lagen samen met M5 hex bouten vast en rubberen voetjes aan de base toevoegen.
- Een single-board-computer met het besturingssysteem van Raspbian GNU/Linux 8.0 (Jessie) (gebaseerd op Linux Debian) configureren.
Opmerking: Software voor het bedienen van het Instrument is beschikbaar op aanvraag. Instrument software broncode beschikbaar op aanvraag. Na ontvangst van zip-bestand, downloaden alle afhankelijkheden die zijn opgegeven in het README-bestand. Deze software omvat een eenvoudige grafische gebruikersinterface waarmee controle over instrument werking, met inbegrip van run basisparameters (motor snelheid, richting, enz.). Gebruikers worden aangemoedigd om uit te breiden op de bestaande broncode en aangepaste programmamodules op maat gemaakt voor gebruik in hun eigen experimenten. Alle software is geschreven met Python 2.7.12 en is niet momenteel compatibel met Python 3. RPi, PicoBorgRev, kivy en multiprocessing modules worden gebruikt. Het Leesmij-bestand bevat gedetailleerde informatie met betrekking tot de software distributielicentie. - Installeer een 24 V DC motor (figuur 5A) en precisie dia (4,5"(114,3 mm) beroerte; 1,27 mm schroef leiden) geborsteld (figuur 5C).
Opmerking: De 24 V DC motor gebruikt hier heeft een RPMmax, ikmaxen full-load koppel van 4,252 RPM, 4,83 A, en ~0.2 N * m, respectievelijk.- (Optioneel) Schakel opvulling onder de motor te dempen van trillingen tijdens operatie.
Opmerking: Het wordt aanbevolen dat een 2-3 mm dik rubber pad aan de motor vervoer afmetingen van de instrument-base wordt gesneden. - Monteer de precisie dia aan de basis van het instrument.
- Verwijder de ankerstang tijdelijk.
- Mount-dia met behulp van twee #8-32 platte machine schroeven.
- Mount gelijkstroommotor om precisie-dia met behulp van de schroef lichtbundel koppeling (1-1/4" lengte) met 6/16" en 1/4" diameter verveelt.
Opmerking: Afhankelijk van de dikte van acryl gebruikt aan de basis lagen van instrument machine, shims kunnen nodig zijn om het niveau van de motor en precisie dia schachten.
- (Optioneel) Schakel opvulling onder de motor te dempen van trillingen tijdens operatie.
- Uitzetting platform monteren van metalen platen en L-vormige hoek bretels (figuur 5D). Onedel metaal platform om glijdende platform (verbonden aan ankerstang) monteren met behulp van #6-32 schroeven. Zie precisie dia schema geboden door de fabrikant voor meer informatie over de beperkingen van de montage.
- Assembleren spuit uitzetting systeeminstellingen.
- Bevestig de lineaire beweging kussen blokken (montage platformen + lineaire beweging lager) op M8 verchroomd roestvrij stalen rails (de parallelle stalen rails kunnen worden gemakkelijk waargenomen in Figuur 5).
- Draad rails via lineaire schacht gids/ondersteuning en vergrendelen van de rails. Gebruik drie gidsen per spoor. Mount SE delen 1 en 2 op kussen blokken met behulp van de M4 machine schroeven.
- Losjes toetreden SE delen 1 en 2 met hex bouten M8. De ruimte tussen SE deel 1 en 2 met spiraalvormige drukveren die betrekking hebben op elke bout die zijn beveiligd tussen twee naar binnen gerichte nylon bussen (Zie figuur 5F) configureren. Monteer deze bussen op de buitenkant van de SE deel 1 en SE deel 2.
- Draad circuit (Zie Figuur 6 voor het bedradingsschema core)
- De motorcontroller verbinden met de I2C/SDA, 3.3 V en GND pinnen op de enige raadscomputer.
- DC motor terminals verbinden met de M en M + blokken van het motor controller boord. De 24 V, 2,5 A voeding (figuur 5B) verbinden met de V + en GND blokken van de motorcontroller (de controller is ingekapseld in een eenvoudig elektronica doos in het definitieve ontwerp, Zie Figuur 5 H).
- Sluit de 3V3 en 5V pinnen van de motor control board aan de respectieve pinnen op de enige raadscomputer. Verbinden met SDA en SCL pinnen van de motorcontroller pin 3 en 5 van de enige raadscomputer, respectievelijk.
Opmerking: Commando's worden uitgegeven aan de DC-motor uit de enige raadscomputer via een motor controller. Motor snelheid wordt gecontroleerd door het reguleren van de spanning over de motor terminals via puls breedte modulatie. Bij deze instelling het maximale huidige loopt door de 24 V DC-motor (full-load stroomsterkte: 4,83 A) wordt beperkt tot 2,5 A door de 24 V-voeding. Het is aanbevolen dat het motorcircuit is bedraad via een verbreekcontact, normaal gesloten (NC) noodstop (figuur 5J). Doen biedt een manier om te verstoren het motorcircuit zodat een fundamentele nood afsluitbewerking. - Voorste en achterste infrarood naderingssensoren (digitale afstand sensoren, figuur 5I) verbinding te maken met RPi GPIO pinnen 24 en 23, respectievelijk.
- Route sensor bedrading door leidingen in de base instrument.
Opmerking: De IR-sensoren zijn contactloze pauze-beam bewegingssensoren met een registratiebereik van 2-10 cm. - 4.7.4.2 snap de bedrade IR sensoren in 3D-gedrukte infraroodsensor accolades (figuur 5I, zwarte dozen) en mount op de instrument-base. Wanneer correct ingesteld in de brace, moet de sensor gezicht uitsteken naar buiten uit de 14 mm x 7 mm rechthoekige opening van de brace.
Opmerking: deze sensor bretels kunnen tijdelijk gemonteerd worden met behulp van Velcro of een lijm (tijdelijke montage is nuttig om op de juiste manier aanpassen en optimaliseren van de IR sensor plaatsing). U kunt ook permanent mount door het boren van kleine gids gaten in het instrument base en het veiligstellen van de bretels met M2 schroeven.
- Route sensor bedrading door leidingen in de base instrument.
- Een 7" touchscreen LCD display sluit aan op de 5V, GND, en seriële interface (DSI) pinnen van de enige raadscomputer weer te geven. De 7" RPi en LCD display van de vergadering is afgebeeld in Figuur 5 g.
5. het fabriceren van Polymersomes via FNP met behulp van de op maat gemaakte High-Speed-spuitpomp
- (Optie 1) Auto-run modus gebruiken.
- Selecteer Auto uitvoeren vanuit het hoofdmenu. Het systeem zal gebruikers vragen om het toestaan van de motor om automatisch te plaatsen de spuit uitzetting platform naar het begin van de dia precisie. Zorg ervoor dat het pad in voor en achter het metalen plaatje duidelijk is voordat u verdergaat.
- Laden 1 mL kunststof spuiten zoals beschreven in punt 2.5 en mount spuiten op de vrouwelijke Luer-aansluitingen van de CIJ-mixer. Laden van CIJ mixer (met spuiten verbonden) in het rechthoekige openen van de achterste uitzetting vervoer (Zie figuur 5E).
- Instellen van de gewenste snelheid van de motor (eenheden: rpm) met behulp van de schuifknop in de GUI (Zie de opmerking hieronder voor belangrijke overwegingen). De optimale motorsnelheid zal afhangen van de specifieke pomp en de installatie maar moet een debiet van ten minste 1 mL/s voor de CIJ mixer kanaal afmetingen hier geboden.
Opmerking: Houd de volgende richtlijnen tijdens het debiet van de instelling. In de verticale handbediende FNP configuratie, reactanten worden uitgezet aan het spuiten met een snelheid van ~ 1 mL/s, maar kan zeer variabel wanneer hand aangedreven. Dit is gewoon het debiet via de injectieampul, die wordt beheerd door het tarief waartegen de gebruiker de plunjer van de injectiespuit voorschotten. Merk op dat het tarief van 1 mL/s niet te verwijzen naar het debiet van de afrit van de kleinere diameter mondstuk. Op de hierboven opgegeven kanaal afmetingen, ~ 1 mL/s moet worden gehandhaafd om ervoor te zorgen een passende Reynold nummer voor turbulente mengen10. Verschillende debiet kunnen worden gebruikt zolang de kanaal diameter te handhaven van een Reynold getal dat turbulente omstandigheden ondersteunt is aangepast. De spuit plunjers zijn gevorderd door een loodrechte metalen plaat, die beweegt langs een hoge precisie aluminium dia gekoppeld aan de 24 V DC borstelmotor. In deze configuratie, het maximale vat debiet wordt beïnvloed door een aantal factoren, met inbegrip van (1) de motor maximumsnelheid (4,252 rpm) en de leiding van de schroef van de precisie dia (1,27 mm) die is gekoppeld aan de motor shaft (2) het koppel van de motor (~0.2 N * m voor full-l OAD torque), die is nodig om te overwinnen van de weerstand tegen stromen (3) tegendruk bijdragen van vloeibare indienststelling en de uitgang van de CIJ-mixer, en (4) de kracht van de injectienaalden die gebruikt (gebruikers moeten rekening te houden met de krachten die op het spuiten en spuiten van gebruiken passende sterkte). Met betrekking tot punt (2), wanneer stroom te verhogen is snelheid voldoende koppel vereist om te voorkomen dat de motor stalling met behoud van gestage uitzetting onder toenemende tegendruk. – Ter illustratie van de stroom van het vat, vat debiet stem dat het bovengenoemde systeem kunt bereiken, kunt u overwegen het geval waar de FNP wordt uitgevoerd met behulp van de reactanten in twee één-milliliter spuiten geladen. Om een 1 mL/s stroom moet door het vat, de motor vooraf de metalen plaat de afstand bepaald door de lengte van de zuiger (~ 68 mm voor een typisch één mL spuit) in één seconde. Mits de 1,27 mm schroef lood van de precisie dia, hieruit volgt dat een DC-motor die op 4,252 rpm staat tot bevordering van het platform is ~ 90 mm/s (71 rev/s * 1,27 mm/Rev.). Dit komt overeen met een vat debiet van ~1.3 mL/s, die groter is dan de 1 mL/s target rate. - Controleer voordat u het instrument, het systeem om ervoor te zorgen dat het pad van het platform is vrij van obstakels, en dat de voor- en achterzijde IR nabijheid detectoren zijn duidelijk van obstakels (de IR sensoren zijn de kleine zwarte dozen in de buurt van de precisie dia terminals; Zie figuur 5I). Ook voor zorgen dat de uitlaat van de capillaire buis van de CIJ-mixer is gerouteerd in een passende collectie container (ex: glazen bekerglas, enz.).
- Om te verdrijven reactanten uit de spuiten en in de CIJ-mixer, drukt u op de knop uitvoeren in de software-interface.
- (Optie 2) Gebruik handmatige run modus. Verwijzen naar de Auto Run modus aanwijzingen hierboven en noteer de volgende wijziging om 5.1.5: druk op de knop voortdurend via de voltooiing van de run (dat wil zeggen gedrukt, het platform in reactie op een gebeurtenis op-pers, en de motor voorschotten stopt in reactie op een gebeurtenis op-release).
- (Optie 3) Gebruik handmatige platform positionering modus; deze modus kan gebruikers positie van het platform door het uitvoeren van de motor bij lage snelheid (20% vermogen) in reactie op de forward en reverse knoppen op de software-interface.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier hebben we een eenvoudig protocol voor de formulering van nanocarriers kan laden van hydrofiele en hydrofobe lading die veilig voor in vivo muis en11,13van de administratie van de niet-menselijke primaten zijn gepresenteerd. We hebben ook een gedetailleerd protocol voor de synthese van het polymeer gebruikt in onze representatieve resultaten, samen met een beschrijving voor de fabricage van een aangepaste instrument voor het mechanisch gestuurde impingement van oplossingen in de mixer CIJ opgenomen. Figuur 1 geeft een overzicht van de synthese stappen uitgevoerd om te produceren van PEG17-bl- PPS35-SH, de diblock-copolymeer gewend zelf monteren polymersome nanocarriers. Een overzicht van de FNP-protocol voor het samenstellen van PEG-bl-PPS polymersomes geladen met therapeutics en/of imaging agenten is diagramed in Figuur 2. Het polymeer werd Gemeenschapsverdrag in een CIJ-mixer (schematisch weergegeven in Figuur 3a, oorspronkelijk beschreven in 10) om te vormen van de monodispers polymersomes als de totale morfologie, die worden kan gevalideerd door dynamische licht verstrooiing (DLS) en cryogene transmissie-elektronenmicroscopie (cryoTEM) (Figuur 3b-3 c). Polymersomes gevormd door de FNP worden kleinere (figuur 3d) en meer monodispers (figuur 3e) met latere problemen, en kunnen worden geladen met hydrofiele en hydrofobe lading (bijvoorbeeld deed lipofiele kleurstof, klein molecuul Therapeutiek, eiwit enz.; Figuur 4a). Nanocarriers gevormd onder de steriele omstandigheden die hierboven beschreven zijn endotoxine gratis door zowel RAW Blue en LAL endotoxine testen en dus geschikt voor een breed scala van in vitro en in vivo toepassingen (figuur 4b, gegevens niet worden weergegeven).
Tot slot hebben wij ontworpen en gebouwd van een instrument voor mechanisch-control het debiet en de resulterende impingement van oplossingen in de CIJ-mixer (Figuur 5). De oprichting van dit instrument is essentieel, aangezien verkrijgbare injectiespuit pompen niet de stroomsnelheid die nodig zijn voor de FNP bereiken. Met uitzondering van aangepaste wijzigingen zijn verkrijgbare injectiespuit pompen snelheidsbeperkingen opgelegd door hun gebruik van lage snelheid stappenmotoren, die zijn ontworpen om betrouwbaar afzien vloeistof in een langzame en gestage mode. In ons instrument, wordt reactieve uitzetting gecontroleerd door een precisie Schuif onder de controle van een 24 V DC borstelmotor, die kan veel grotere snelheden (4,252 rpm) bereiken dan de langzame stappenmotoren gevonden in commerciële injectiespuit pompen. Aangepaste software draait op een enige raadscomputer wordt gebruikt voor het bedienen van het instrument (Figuur 6). 2D-tekeningen voorzien naast 3D-modellen van de onderdelen. Alle tekeningen en modellen ontstonden in FreeCAD (open-source parametrische 3D CAD modelleren software) om ervoor te zorgen dat ze zeer toegankelijk is voor de onderzoeksgemeenschap. De software voor het bedienen van het instrument werd geschreven in Python 2.7.12, waardoor de snelle ontwikkeling van aangepaste FNP procedures om ervoor te zorgen de harmonieus productie van nanocarriers (grootte, morfologie, enz.). Software voor het bedienen van het instrument zal gebeuren op aanvraag beschikbaar. Gebruikers moeten er rekening mee dat de software niet compatibel met Python 3 is; echter, dit kan veranderen in de toekomst updates. Door het beheersen van reactieve uitzetting tarief, elimineert dit instrument de variabele van menselijke fout van de hand-operatie.
Figuur 1. Synthese schema voor de synthese van PEG17- bl-PPS36-SH. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Productie van polymersomes via FNP in een hand-gedreven CIJ mixer. Diagram van de vorming van polymersomes met behulp van de FNP. De PEG-bl-PPS polymeer wordt opgelost in een organisch oplosmiddel samen met hydrofobe lading, en is rechtstreekse tegen waterige oplosmiddelen met opgeloste hydrofiele lading. Snelle mengen gebeurt binnen het CIJ-mixer, en efflux kan herhaaldelijk Gemeenschapsverdrag of toegestaan om het proces van de vorming door verdunning in een reservoir van waterige oplosmiddelen te voltooien. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Karakterisatie van polymersomes gevormd door de FNP. (a) ontwerpen van schematische voorstelling van de CIJ mixer gebruikt in deze studie. Alle maten zijn in millimeters. (b) de verdeling van de grootte van polymersomes gevormd door FNP na 1 en 5 problemen, zoals gemeten door DLS. n = 6 formuleringen, gemiddelde van monsters zijn opgenomen in een grafiek. (c) voorbeeld cryoTEM beelden van polymersomes gevormd nadat 1 en 5 problemen via de CIJ-mixer, schaal bar = 100 nm. Doorsnede (d) en polydispersiteit index (e) van polymersomes gevormd door de FNP, gemeten door DLS. Ter vergelijking: polymersomes gevormd door dunne film rehydratie, met (TF-E) of zonder (TF-NE) latere extrusie, en gevormd door oplosmiddelen dispersie (SD) waren ook gemeten, n = 3, foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie. Subfigures (c)-(e) genomen met de toestemming van Allen et al. 11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Het laden van efficiëntie en endotoxine karakterisering. (a) laden efficiëntie van kleine en macromoleculen binnen polymersomes, n = 3, foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie. (b) RAW Blue LPS kwantitatieve analyse van de polymersomes gevormd door steriele FNP, n = 6, foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5. Instrument voor de mechanische bestrijding van impingement van de oplossing in de mixer CIJ. (a) 24 V borstelmotor DC. (b) voeding (24V, 2,5 A). (c) 4.5" beroerte precisie dia met 1,27 mm schroef lood (aangesloten op de motoras trekken door een koppeling van de lichtbundel schroef). (d) uitzetting platform gebouwd van rechthoekig metalen platen en L-vormige hoek bretels. (e) CIJ mixer. (f) uitzetting vervoer. (g) één board computer en 7" touchscreen. (h) mMotor control board ingekapseld in omhulling van kunststof (83 x 53 x 35 mm). (i) IR-sensoren (contactloze pauze-beam bewegingssensoren). (j) Emergency stopknop (NC). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6. Kern bedradingsschema. De primaire verbindingen tussen de enige raadscomputer, motorcontroller en IR-sensoren worden weergegeven. De LCD touchscreen verbindingen worden hier niet weergegeven, aangezien dit onderdeel niet-essentiële is (voor het gebruik van een standaard computermonitor en muis in plaats daarvan kunnen gebruikers kiezen). Merk op dat in de weergegeven configuratie, de 24 V motor voeding en single board computer voeding gescheiden zijn. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wij hebben verstrekt gedetailleerde instructies voor het snelle fabricage van polymersomes met behulp van PEG17-bl- PPS35-SH als de diblock-copolymeer. Vesiculaire polymersomes zijn de primaire statistische morfologie geassembleerd op deze verhouding van PEG hydrofiele en hydrofobe PPS blok molecuulgewicht. Wanneer meerdere keren Gemeenschapsverdrag, ze hebben een diameter en polydispersiteit die overeenkomt met polymersomes nadat hij door een 200 nm membraan geëxtrudeerd gevormd via dunne film hydratatie. Dit protocol dus elimineert de noodzaak voor extra extrusie stappen tijdens de fabricage van monodispers polymersome nanocarriers. Polymersomes gevormd via FNP zowel hydrofiele en hydrofobe lading laden en onderhouden van de topicale van deze moleculen t/m de formulering proces11. Aanvullende protocollen worden beschreven om de steriliteit wanneer dat nodig is, waardoor de vorming van polymersome-formuleringen die endotoxine-vrij en daarom geschikt voor biochemische en immunologische testen evenals veilig voor beheerdoeleinden in vivo . De handbediende CIJ mixer is eenvoudig op te zetten en gemak-of-gebruik biedt aan de gebruiker, maar introduceert potentiële kwaliteitscontrole problemen als gevolg van de variabiliteit van de gebruiker. Stroom overeenstemming zou houden, wilden wij maken een instrument kunnen bereiken en handhaven van reproducibly een vergelijkbare debiet. Nog belangrijker is, op het hierboven opgegeven kanaal afmetingen, commerciële injectiespuit pompen niet verwezenlijken voldoende hoog debiet (~ 1 mL/s) als gevolg van lage snelheid stappenmotoren wordt voorzien. Ter bestrijding van dit probleem, en om meer controle over het debiet veroorloven, werd de fabricage van een high-speed-spuitpomp voor FNP beschreven. Zorg werd genomen om het gebruik van open source en eenvoudig aanpasbare software voor het systeem OS en code.
Controle over alternatieve debiet biedt de mogelijkheid om te verfijnen van de formulering van de nanocarrier en biedt mogelijkheden om verder te onderzoeken met de montage van diverse nanocarrier morphologies. Het getal van Reynolds en overeenkomt met het mengen van tijd bleek eerder om de impact van de grootte van solid-core nanocarriers gevormd via FNP9, maar het is niet duidelijk welke gevolgen het op de vorming van polymersomes hebben zou. Dit is een onderwerp van lopend onderzoek, met de huidige aanbevolen dosis wordt 0,5 tot 2 mL/s, met de representatieve resultaten uitgevoerd bij ongeveer 1 mL/s. Om meer controle over de stroomsnelheid nog, kan het nodig zijn ter vervanging van de Linux gebaseerde OS met real-time controle over de motor van de pomp spuit.
Naast het aanpassen van de stroomsnelheid, zijn er een aantal manieren die dit FNP-protocol kan worden aangepast aan de specifieke behoeften van de suite of toepassingen. Kleinere of grotere hoeveelheden polymeer mag worden gebruikt. Concentraties zo laag als 1 mg/mL en maar liefst 100 mg/mL zijn gebruikt om stabiele nanocarriers te vormen. Grotere volumes kunnen worden gebruikt voor impingement, hoewel de consistente toepassing van druk tijdens hand-gedreven FNP is moeilijker op volumes groter dan 1 mL per spuit. Het volume van het reservoir kan ook worden gewijzigd. Finale organische: waterige oplosmiddelen ratio's van meer dan 1:3 leiden de onvolledige vorming van nanocarriers tot kan, en als zodanig moet worden gewaakt tot geen afname van het volume van het reservoir zonder bevestiging van de vorming van nanocarriers. Aggregatie kan optreden wanneer u probeert te laden van hoge concentraties van hydrofobe lading, die over het algemeen kan worden verlicht door het verhogen van de molaire verhouding van polymeer: lading.
Een extra onderwerp open voor verkenning is de verdere uitbreiding van de formatie van de polymersome van de FNP te nemen andere polymeersystemen buiten PEG -bl-PPS. Inderdaad, hebben andere systemen eerder is gebruikt bij de vorming van micellen en solid-core drug nanocarriers16,17. Het is echter niet duidelijk of er is een verzameling parameters die kunnen leiden tot de vorming van polymersomes via FNP met behulp van die andere polymeersystemen. Gezien het aantal potentiële variabelen om te verkennen, het is heel goed mogelijk dat andere polymeren, polymersomes of andere zachte nanoarchitectures via FNP met aangepaste experimentele parameters, zoals debiet, temperatuur, oplosmiddel selectie vormen kunnen en polymeer concentratie.
Zoals bij alle technieken van de formulering zijn er beperkingen met betrekking tot de FNP en beperkingen waardoor bepaalde toepassingen onhoudbaar. De snelle mengen proces vereist dat de organische en waterige oplosmiddelen mengbaar, die zich verzet tegen het gebruik van sommige gemeenschappelijke oplosmiddelen voor de ontbinding van de vele diblock copolymeren, bijvoorbeeld dichloormethaan en chloroform. Sommige polymeren kunnen daarom worden gerenderd onverenigbaar is met de FNP als ze niet kunnen worden opgelost in een water-mengbaar organisch oplosmiddel. Het protocol van de FNP hier beschreven maakt gebruik van een 1:1 verhouding van organische te waterig oplosmiddel, dat de activiteit van nettoladingen gevoelig voor hoge concentraties van organisch oplosmiddel, zoals sommige bioactieve eiwitten kan afnemen. Opgemerkt moet worden dat invloeden op topicale van het eiwit afhangen zal, zoals we eerder hebben gevonden minimale effecten op de enzymatische activiteit van alkalische fosfatase laden binnen polymersomes na door FNP11. Multi inlaat vortex mixers18 zijn een duurder maar beter aanpasbaar FNP platform dat biedt extra controle over de verhouding van organische aan waterige oplosmiddelen, biedt een veelzijdig alternatief voor CIJ mixers voor deze contexten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Wij erkennen dat personeel en instrumentatie ondersteuning van de structurele biologie faciliteit aan de Northwestern University. De steun van de R.H. Lurie uitgebreide kanker centrum van Northwestern University en de Noordwestelijke Universiteit structurele biologie faciliteiten wordt erkend. De detector van de directe elektron Gatan K2 werd gekocht met middelen die door de Chicago biomedische Consortium met steun uit de fondsen Searle op The Chicago Gemeenschap Trust. Wij danken ook de volgende faciliteiten aan de Northwestern University: de Keck interdisciplinaire oppervlak wetenschap faciliteit, de structurele biologie-faciliteit, de biologische Imaging faciliteit, het Center for Advanced Molecular Imaging en de analytische Bionanotechnologie apparatuur Core. Dit onderzoek werd gesteund door de subsidie van de National Science Foundation 1453576, de nationale instituten van gezondheid directeur van nieuwe Innovator Award 1DP2HL132390-01, het centrum voor regeneratieve nanogeneeskunde katalysator Award en de 2014 McCormick katalysator Award. SDA werd gedeeltelijk ondersteund door de NIH predoctoraal biotechnologie opleiding Grant T32GM008449.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate Starter Kit - 32 GB Edition | CanaKit | UPC 682710991511 | |
| Linear Bearing Platform (Small) - 8mm Diameter | Adafruit | 1179 | |
| Linear Motion 8 mm Shaft, 330 mm Length, Chrome Plated, Case Hardened, Metric | VXB | kit11868 | |
| Linear Rail Shaft Guide/Support - 8 mm Diameter | Adafruit | 1182 | |
| Manual-Position Precision Slide 4.5" Stroke, 15 lb load capacity | McMaster-Carr | 5236A16 | |
| MTPM-P10-1JK43 Iron Horse DC motor | Iron Horse | MTPM-P10-1JK43 | |
| Official Raspberry Pi Foundation 7" Touchscreen LCD Display | Raspberry Pi | B0153R2A9I (ASIN) | |
| PicoBorg Reverse - Advanced motor control for Raspberry Pi | PiBorg | BURN-0011 | |
| Pololu Carrier with Sharp GP2Y0D810Z0F Digital Distance Sensor 10cm | Pololu | 1134 | |
| Ruland PSR16-5-4-A Set Screw Beam Coupling, Polished Aluminum, Inch, 5/16" Bore A Diameter, 1/4" Bore B Diameter, 1" OD, 1-1/4" Length, 44 lb-in Nominal Torque | Ruland | PSR16-5-4-A | |
| Polyethylene glycol monomethyl ether | Sigma Aldrich | 202495 | |
| Methanesulfonyl chloride | Sigma Aldrich | 471259 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 179418 | |
| Toluene, Anhydrous | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | |
| Celite 545 (Diatomaceous Earth) | Sigma Aldrich | 419931 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 320269 | |
| Diethyl ether | Sigma Aldrich | 296082 | |
| N,N-Dimethylformamide, anhydrous | Sigma Aldrich | 227056 | |
| Potassium carbonate | Sigma Aldrich | 791776 | |
| Thioacetic acid | Sigma Aldrich | T30805 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma Aldrich | 360589 | |
| Aluminum oxide, neutral, activated, Brockmann I | Sigma Aldrich | 199974 | |
| Sodium methoxide solution, 0.5 M in methanol | Sigma Aldrich | 403067 | |
| Propylene sulfide | Sigma Aldrich | P53209 | |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 320390 | |
| Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma Aldrich | S2770 | |
| Endotoxin-free water | GE Healthcare Life Sciences | SH30529.01 | |
| Paper pH strips | Fisher Scientific | 13-640-508 | |
| Endotoxin-free Dulbecco's PBS | Sigma Aldrich | TMS-012 | |
| Borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| 1 mL all-plastic syringe | Thermo Scientific | S75101 | |
| Sepharose CL-6B | Sigma Aldrich | CL6B200 | |
| Liquid chromatography column | Sigma Aldrich | C4169 | |
| CIJ mixer, HDPE | Custom | ||
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma Aldrich | 216763 | |
| HEK-Blue hTLR4 | InvivoGen | hkb-htlr4 | |
| RAW-Blue Cells | InvivoGen | raw-sp | |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | |
| PYROGENT Gel Clot LAL Assays | Lonza | N183-125 |
References
- Stano, A., Scott, E. A., Dane, K. Y., Swartz, M. A., Hubbell, J. A. Tunable T cell immunity towards a protein antigen using polymersomes vs. solid-core nanoparticles. Biomaterials. 34 (17), 4339-4346 (2013).
- Discher, B. M., et al. Polymersomes: tough vesicles made from diblock copolymers. Science. 284 (5417), 1143-1146 (1999).
- Vasdekis, A. E., Scott, E. A., O'Neil, C. P., Psaltis, D., Hubbell, J. A. Precision intracellular delivery based on optofluidic polymersome rupture. ACS Nano. 6 (9), 7850-7857 (2012).
- Yi, S., et al. Tailoring Nanostructure Morphology for Enhanced Targeting of Dendritic Cells in Atherosclerosis. ACS Nano. 10 (12), 11290-11303 (2016).
- Shum, H. C., Kim, J. W., Weitz, D. A. Microfluidic fabrication of monodisperse biocompatible and biodegradable polymersomes with controlled permeability. Journal of the American Chemical Society. 130 (29), 9543-9549 (2008).
- Pessi, J., et al. Microfluidics-assisted engineering of polymeric microcapsules with high encapsulation efficiency for protein drug delivery. International Journal of Pharmaceutics. 472 (1-2), 82-87 (2014).
- O'Neil, C. P., Suzuki, T., Demurtas, D., Finka, A., Hubbell, J. A. A novel method for the encapsulation of biomolecules into polymersomes via direct hydration. Langmuir. 25 (16), 9025-9029 (2009).
- Saad, W. S., Prud'homme, R. K. Principles of nanoparticle formation by flash nanoprecipitation. Nano Today. 11 (2), 212-227 (2016).
- Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Mechanism for rapid self-assembly of block copolymer nanoparticles. Physical Review Letters. 91 (11), 118302 (2003).
- Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).
- Allen, S., Osorio, O., Liu, Y. G., Scott, E. Facile assembly and loading of theranostic polymersomes via multi-impingement flash nanoprecipitation. Journal of Controlled Release. 262, 91-103 (2017).
- Bobbala, S., Allen, S. D., Scott, E. A. Flash nanoprecipitation permits versatile assembly and loading of polymeric bicontinuous cubic nanospheres. Nanoscale. 10 (11), 5078-5088 (2018).
- Allen, S. D., et al. Polymersomes scalably fabricated via flash nanoprecipitation are non-toxic in non-human primates and associate with leukocytes in the spleen and kidney following intravenous administration. Nano Research. , (2018).
- Karabin, N. B., et al. Sustained micellar delivery via inducible transitions in nanostructure morphology. Nature Communications. 9 (1), 624 (2018).
- Mascoli, C. C., Weary, M. E. Limulus amebocyte lysate (LAL) test for detecting pyrogens in parenteral injectable products and medical devices: advantages to manufacturers and regulatory officials. Journal of the Parenteral Drug Association. 33 (2), 81-95 (1979).
- Pustulka, K. M., et al. Flash nanoprecipitation: particle structure and stability. Molecular Pharmaceutics. 10 (11), 4367-4377 (2013).
- Tang, C., Amin, D., Messersmith, P. B., Anthony, J. E., Prud'homme, R. K. Polymer directed self-assembly of pH-responsive antioxidant nanoparticles. Langmuir. 31 (12), 3612-3620 (2015).
- Gindy, M. E., Panagiotopoulos, A. Z., Prud'homme, R. K. Composite block copolymer stabilized nanoparticles: simultaneous encapsulation of organic actives and inorganic nanostructures. Langmuir. 24 (1), 83-90 (2008).
