Summary
Vi præsenterer her, en protokol til hurtig virus nukleinsyre udvinding fra fuldblod virus-inaktiveret. Ekstraktionen udføres direkte i blodet indsamling rør og kræver ingen udstyr eller elektricitet. Metoden er ikke afhængige af laboratoriefaciliteter og kan anvendes overalt (f.eks.i felthospitaler).
Abstract
Hurtig diagnosticering af en infektion er afgørende for udbruddet forvaltning, risiko indeslutning og patientpleje. Vi har tidligere vist en metode til hurtig sengelamper inaktivering af Ebola virus under udtagning af blodprøve for sikker nukleinsyre (NA) test ved at tilføje en kommerciel lysis/binding buffer direkte i vakuum blod indsamling rør. Brug denne sengelamper inaktivering fremgangsmåde, har vi udviklet en sikker, hurtig og forenklet sengelamper NA ekstraktion metode til efterfølgende påvisning af virus i lysis/binding buffer-inaktiverede fuldblod. NA udvinding udføres direkte i blodet indsamling rør og kræver ingen udstyr eller elektricitet.
Når blodet er indsamlet i lysis/binding buffer, indholdet blandes ved at vende røret ved håndkraft, og blandingen er udruget i 20 min. ved stuetemperatur. Magnetisk glas partikler (FUP) er føjet til røret, og indholdet blandes ved at vende samling røret ved håndkraft. De flerårige udviklingsprogrammer er derefter indsamles på siden af blod samling røret ved hjælp af en magnetisk indehaveren eller en magnet og en elastik. De flerårige udviklingsprogrammer er vasket tre gange, og efter tilsætning af eluering buffer direkte i collection tube, NAs er klar til NA tests, såsom qPCR eller isotermisk loop forstærkning (lampe), uden fjernelse af FUP fra reaktionen. NA ekstraktion metode er ikke afhængig af nogen laboratoriefaciliteter og nemt kan anvendes overalt (f.eks.i felthospitaler og hospitalsafdelinger isolation). Når denne NA ekstraktion metode kombineres med lampe og en transportabel instrument, får en diagnose indenfor 40 min i samlingen blod.
Introduction
I virus udbrud situationer, når patienter er begrænset til isolation hospitalsafdelinger eller hvor der er behov for en hurtig diagnose, er en sikker, enkel og præcis punkt af pleje molekylære diagnose afgørende for den patient pleje og risiko indeslutning. De to seneste viral udbrud af Ebola virus (EBOV) i Vestafrika (2013) og Zika virus i Sydamerika (2015), har øget interessen for forbedret punkt af pleje Molekylær diagnostisk test, såsom reverse transkription loop-medieret isotermiske forstærkning (RT-lampe)1,2 og recombinase-polymerase forstærkning (RPA)3,4. Både RT-lampe og RPA er hurtige, følsomme og specifikke molekylære test, der kan udføres på forenklet prøve præparater. Zika virus, er RT-lampe blevet kombineret med en lateral flow analyse (LFA), der kan spore Zika virus i ikke renset hele blodprøver inden for 30 min1; men for EBOV, der er klassificeret som en risiko gruppe 4 patogen og er meget smitsom, prøverne skal håndteres under biosikkerhed niveau 4 (BSL-4) betingelser og inaktiveret før nogen sikker diagnostiske procedurer kan udføres.
Forenklet inaktivering metoder til EBOV, såsom tilføjelsen af lysis buffere til prøve2,3,4,5, blev brugt under udbrud. disse metoder kræver dog håndtering på BSL-4 betingelser med laboratorieudstyr, som BSL-3 biosikkerhed kabinetter, centrifuger, varme blokke og pipetter, på et minimum. Dette udstyr er normalt ikke til stede i isolation afdelinger eller i felthospitaler. For at overvinde denne udfordring, man har forsøgt at udføre diagnosticeringen i kufferter3og flere bærbare enheder og maskiner har været udviklet [f.eks.en bærbar enhed for nukleinsyre (NA) udvinding]6. Men EBOV-positive prøver stadig skal deaktiveres, før disse enheder kan bruges.
Vi har tidligere rapporteret en hurtig sengelamper virus inaktivering metode til EBOV7, Vaccinia virus og Cowpox virus8 ved tilsætning af en kommerciel lysis/binding buffer til almindelige vakuum blod indsamling rør, giver mulighed for direkte overførsel af blod fra patienten til inaktivering buffer7. Denne direkte og umiddelbar inaktivering i et lukket system eliminerer behovet for håndtering af prøver ved hjælp af en fuldkommen indeslutning, som BSL-4 betingelser7, og prøverne kan håndteres under normale BSL-2. Denne inaktivering metode er kompatibel med flere NA udvinding systemer, som robotter og hånd rensning kits7; disse metoder kræver dog laboratorieudstyr, som robotter, centrifuger og elektricitet, der ikke er altid til stede i Feltindstillinger eller inde i isolation hospitalsafdelinger.
I denne rapport beskriver vi en sikker, hurtig og forenklet manuel NA ekstraktion metode til efterfølgende molekylære påvisning af virus i lysis/binding buffer-inaktiverede fuldblod. NA ekstraktion metode kræver ikke noget udstyr end en magnet/magnetiske indehaveren. Ingen centrifuger, varme blokke eller elektricitet er nødvendig for NA udvinding. Derfor, denne metode er ikke afhængige af laboratoriefaciliteter og nemt kan anvendes overalt (f.eks.i felthospitaler, i isolation hospitalsafdelinger eller med lav-ressource-indstillinger). NA ekstraktion metode er hurtig og enkel og kan anvendes direkte i enhver downstream NA test, såsom qPCR, RT-qPCR, lampe eller RT-lampe. Når denne NA ekstraktion metode kombineres med lampe og en bærbar batteri-drevet isotermisk instrument, kan en bedside diagnose opnås indenfor 40 min i samlingen blod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Udvalget om biomedicinsk forskning etik og region hovedstaden har givet informeret samtykke, og alle metoder beskrevet her er fritaget fra en anmeldelse af etiske komité-systemet i overensstemmelse med den danske lov om assay udviklingsprojekter.
1. forberedelse af blod samling vakuumrør for Virus inaktivering og hurtige NA udvinding
Advarsel: Den buffer, der bruges til denne protokol indeholder guanidinium kaliumthiocyanat (GITC) og en nonionisk overfladeaktivt stof, der er lokalirriterende. Træffe passende laboratorium sikkerhedsforanstaltninger, bruge en flow hætte og handsker når du håndterer det. Undgå enhver hud- og øjenkontakt. Hvis bufferen er spildt, desinficeres forurenet overflade må aldrig direkte med Kloramin eller natriumhypochlorit (de aktive ingredienser i "blegemiddel"), fordi denne blanding kan føre til dannelse af giftige cyanid. Først, tørre op spildte bufferen med den absorberende serviet. Næste, Rengør overfladen med 70% ethanol og derefter med vand, og endelig bruge Kloramin eller natriumhypochlorit.
- For at forberede blod samling vakuumrør, injicere 1,6 mL af den specifikke kommercielle lysisbuffer i en 4 mL EDTA vakuum rør ved punktering låget af røret ved hjælp af en 25 G x 1 nål og en 3 mL sprøjten.
Bemærk: Fjern ikke låget af vakuum rør. Vakuum skal opretholdes. - Gemme vakuum rør indeholdende buffer ved stuetemperatur indtil brug.
Bemærk: Rør er stabil i mindst 1 år efter deres udarbejdelse.
2. fremstilling af buffere for NA udvinding
- For at forberede en NA udvinding buffere, placere to 1,8 mL, to 4.5 mL og en 3,6 mL rør i en rack.
- Tilføje, når der afpipetteres, 960 µL af magnetisk glas partikler (FUP) til en ren 1,8 mL rør og mærke det med FUP. Resuspend FUP suspension helt før pipettering det.
Bemærk: De flerårige udviklingsprogrammer har tendens til at hurtigt indsamle i bunden af røret. - Tilføje, når der afpipetteres, 4 mL af vaskebuffer jeg til en ren 4,5 mL tube og mærke det som WB-1.
Forsigtig: Vaskebuffer I indeholder guanidinium chlorid, hvilket er irriterende. Træffe passende laboratorium sikkerhedsforanstaltninger, bruge en flow hætte og handsker når du håndterer det. Undgå enhver hud- og øjenkontakt. - Af pipettering, tilsættes 1,5 mL wash buffer II til en ren 3,6 mL tube og mærke det som WB-2.
- Af pipettering, tilsættes 3 mL vaskebuffer III til en ren 4,5 mL tube og mærke det som WB-3.
- Tilføje, når der afpipetteres, 100 µL af eluering buffer til en ren 1,8 mL tube og mærke det som EB.
- Gemme de aliquoted buffere ved stuetemperatur indtil brug.
Bemærk: Rør er stabil i mindst 1 måned efter deres forberedelse.
3. blodet samling fra patienter med tegn og symptomer på en virusinfektion
Forsigtig: Træffe passende laboratorium sikkerhedsforanstaltninger når at indsamle fuldblod fra patienten. Bære handsker og briller. Hvis patienten er i isolation, Følg biosikkerhed niveau 4 procedurer.
- For at indsamle intravenøs fuldblod fra patienten, bruge en sommerfugl nål med mennesker udvidelse slange og en blod samling vakuumrør indeholdende et lysis/binding buffer. Hvile patientens arm i en nedadgående holdning og holdning collection tube lavere end sommerfugl nålen. Indsæt sommerfugl nålen ind i venen af patienten og tillægger filtypenavnet mennesker blod samling vakuumrør.
Bemærk: Dette vil forhindre back-flow. - Bland indholdet af røret efter samlingen blod ved at vende røret 5 - 10 gange.
Bemærk: På grund af de resterende vakuum i blod collection tube indeholder 1,6 mL af lysis/binding buffer, volumen af prøven indsamles vil automatisk være 1,6 mL. - Desinficeres på ydersiden af røret med 70% ethanol.
- Inkuber rør i 20 min. ved stuetemperatur.
Bemærk: Protokollen kan stå i pause her og fuld blod indsamling rør kan opbevares ved-20 ° C, 5 ° C, 25 ° C og 37 ° C i mindst 1 måned7. - Fortsætte direkte til den forenklede NA ekstraktion metode.
4. forenklet NA udvinding af fuldblod
- For at rense NA fra lysis/binding buffer-inaktiverede indsamlede blod, mix rør indholdet af rør ved at vende vakuum i hånden 5-10 x.
- Fjerne låget af glasset omhyggeligt og decharge låget.
- Hæld den forberedte alikvot af FUP (1 mL) direkte i blodet collection tube.
- Placere en ny låget fra en ubrugt blod collection tube på røret der indeholder prøven.
- Placer en finger på låget til sikre, at røret er tæt tillukket og blande indholdet af røret af flipping blod samling røret ved håndkraft 5 - 10 gange.
- Glasset anbringes i den magnetiske indehaveren og holde en finger på låget til sikre røret lukkes tæt.
- Flip magnetiske indehaveren med rør et par gange i hånden for at sikre, at de flerårige udviklingsprogrammer er indsamlet på siden af røret med magnet.
Bemærk: Magnetiske indehaveren kan erstattes med en langstrakt magnet og en elastik. - Fjern låget af glasset og kassér indholdet af røret ved hjælp af en engangs pipette eller blot ved at hælde indholdet i en 50 mL collection tube.
Bemærk: Undgå aerosoler fra 50 mL collection tube ved at lukke røret med et låg. - Hæld den forberedte alikvot af WB-1 (4 mL) direkte ind i blodet collection tube.
- Låget lægges på røret og placere en finger på låget til sikre røret lukkes tæt.
- Fjerne røret fra magnetiske indehaveren, at holde låget sikkert strammes med en finger.
Bemærk: Hvis du bruger en magnet og en elastik, skal du blot fjerne elastik og magnet fra røret. - Resuspend de flerårige udviklingsprogrammer af flipping blod samling røret ved håndkraft 5 - 10 gange.
- Gentag trin 4.6-4.8.
- Hæld den forberedte alikvot af WB-2 (1,5 mL) direkte ind i blodet collection tube.
- Låget lægges på røret og fjerne røret fra magnetiske indehaveren.
Bemærk: Hvis du bruger en magnet og en elastik, skal du blot fjerne elastik og magnet fra røret. - Placer en finger på låget til sikre røret lukkes tæt.
- Resuspend de flerårige udviklingsprogrammer af flipping blod indsamling rør i et par sekunder i hånden.
- Gentag trin 4.6-4.8.
- Hæld den forberedte alikvot af WB-3 (3 mL) direkte ind i blodet collection tube.
- Låget lægges på røret og fjerne røret fra magnetiske indehaveren.
Bemærk: Hvis du bruger en magnet og en elastik, skal du blot fjerne elastik og magnet fra røret. - Placer en finger på låget til sikre røret lukkes tæt.
- Resuspend de flerårige udviklingsprogrammer af flipping blod samling røret ved håndkraft 5 - 10 gange.
- Gentag trin 4.6-4.8.
- Hæld den forberedte alikvot af EB (100 µL) direkte ind i blodet collection tube.
- Låget lægges på røret og fjerne røret fra magnetiske indehaveren.
Bemærk: Hvis du bruger en magnet og en elastik, skal du blot fjerne elastik og magnet fra røret. - Resuspend de flerårige udviklingsprogrammer i EB ved at tappe blod collection tube 5 - 10 gange med en finger.
Bemærk: Protokollen kan blive standset her, og rørene kan opbevares ved-20 ° C. - Overføre et slipværktøj (5-8 µL) af de resuspenderede FUP til den downstream NA forstærkning mastermix ved hjælp af en 1,5 mL engangs pipette (Enhver downstream diagnostiske NA forstærkning assay som lampe/RT-lampe eller qPCR/RT-qPCR assays kan bruges).
Bemærk: NAs vil holde sig til de flerårige udviklingsprogrammer, så sørg for at bruge de flerårige udviklingsprogrammer i downstream NA forstærkning reaktion. Bland FUP suspension før brug. Efter blanding indsamler de flerårige udviklingsprogrammer i bunden af røret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen præsenteres her er enkle og effektive og kan anvendes bredt på enhver Molekylær analyse skal gennemføres på infektiøs hele blodprøver inaktiveres med lysis/binding buffer. Arbejdsgangen for blod inaktivering og NA udvinding er vist i figur 1, herunder udarbejdelse af blod samling vakuumrør7 (figur 1A), blod samling7 (figur 1B), NA udvinding ( Tal 1 c - 1 H), og downstream NA analyse (figur 1I).
På grund af den forenklede NA udvinding protokol, de flerårige udviklingsprogrammer er ikke fjernet fra eluering skridt og derfor NAs har tendens til at holde sig til de flerårige udviklingsprogrammer. Enhver downstream Molekylær analyse, såsom qPCR eller lampe analyse, skal udføres direkte på FUP (figur 1I og figur 2) for at sikre et positivt resultat.
NA ekstraktion metode er effektiv, og RNA eller DNA-virus-positive fuldblods prøver med viral belastninger så lavt som 130-3.000 eksemplarer/mL kan udvindes og analyseret ved hjælp af enten qPCR eller RT-qPCR (figur 3).
Ved hjælp af metoden NA udvinding, lampe eller RT-lampe og en bærbar batteri-drevet isotermisk enhed for virus-positive hele blodprøver, fås en diagnose indenfor 40 min fra samlingen blod (figur 4).
Figur 1 : Arbejdsgang for forenklet NA udvinding af hele blodprøver. (A) Forbered lysis/binding buffer vakuum blod indsamling rør ved hjælp af en nål og en sprøjte. (B) indsamle blod ved hjælp af en sommerfugl nål. (C) sted blod collection tube i en holder, Fjern låget, og hæld FUP i røret. (D) Luk røret med en ny låg og bland indholdet ved at vende røret ved håndkraft. (E) indsamle FUP på siden af blod collection tube ved at vende røret i magnetiske indehaveren. (F) Fjern supernatanten ved hjælp af en engangs pipette. (G) hæld vask eller eluering buffere direkte ind i blodet indsamling rør og gentage handlinger vist i paneler D - F. (H) dette panel viser FUP klar til direkte brug i en qPCR, RT-qPCR, lampe eller RT-lampe reaktion. (jeg) overførsel én dråbe (5-8 µL) af FUP til en PCR eller lampe reaktionen røret ved hjælp af en engangs pipette 1,5 mL. Panel A og B: denne figur er blevet ændret fra Rosenstierne et al. 7. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : NA påvisning af 28 virus-positive fuldblods prøver udvundet ved hjælp af metoden forenklet NA udvinding. Hele blodprøver (1,6 mL) testet negative for en virus blev tilsat enten en DNA-virus [Epstein - Barr virus (EBV) (2.0 x 104 - 1,0 x 103 kopier/mL)] eller et RNA-virus [Hepatitis C virus (HCV) (6,0 x 105 - 3.0 x 103 kopier/mL)] eller en Dengue virus (DENV) (1,7 x 108 - 1,7 x 106 eksemplarer/mL). NAs blev udvundet ved hjælp af den ovenfor beskrevne metode, og de udpakkede NAs blev analyseret i to eksemplarer af specifikke in-house qPCR, RT-PCR, lampe eller RT-lampe, med eller uden FUP. X-aksen = NA påvisningsmetode, y-aksen = procentdelen af prøverne positive i qPCR/lampe. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Følsomheden af den forenklede NA ekstraktion metode. For en proof of concept af metoden, virus negative fuldblod var tilsat forskellige RNA eller DNA virus præparater indeholdende en defineret viral belastning, og NAs blev udvundet ved hjælp af den forenklede NA ekstraktion metode. (A) Negative fuldblod (1,4 mL) blev tilsat 200 µL af 10-fold fortyndinger af EBOV standard forberedt til diagnostiske formål (ENIVD), som var beredt fra det seneste udbrud i Guéckédou/Guinea (2.0 x 106 eksemplarer/mL). De udpakkede NAs blev analyseret i to eksemplarer af en in-house EBOV-specifikke RT-qPCR7 ved hjælp af en MX3005P termiske cycler. (B) fuldblod (1,2 mL) blev tilsat 400 µL af 10-fold fortyndinger af en HCV der standardiserede serum prøve (1,2 x 106 IU/mL). De udpakkede NAs blev analyseret i to eksemplarer af en in-house HCV-specifik RT-qPCR ved hjælp af en MX3005P termiske cycler. (C) fuldblod (1,2 mL) var spidse med 400 µL af forskellige koncentrationer af EBV (2.0 x 104 kopier/mL, 8,0 x 103 kopier/mL, 2,7 x 103 kopier/mL og 9,3 x 102 kopier/mL). De udpakkede NAs blev analyseret i to eksemplarer af en in-house EBV-specifik qPCR. (D) fuldblod (1,2 mL) var spidse med 400 µL af 10-fold fortyndinger af BK virus (1,3 x 104 kopier/mL). De udpakkede NAs blev analyseret i to eksemplarer af en in-house BK-specifikke qPCR. X-aksen = den endelige koncentration af en virus i eksemplet spidse fuldblod (kopier/mL eller IE/mL), y-aksen = Ct-værdi (gennemsnit ± SD). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Forenklet NA udvinding og RT-lampe eller lampe ved hjælp af en bærbar isotermisk enhed. (A) på grund af manglende EBOV-positive fuldblods prøver på afdeling af Virus & mikrobiologiske særlig diagnostik, Statens Serum Institut, Danmark, 1,4 mL negative fuldblod var tilsat 200 µL af forskellige fortyndinger af EBOV standard forberedt til diagnostiske formål (ENIVD). De spidse prøver undergik en NA udvinding ved hjælp af metoden forenklet NA udvinding og blev analyseret af en EBOV-specifikke RT-lampe reaktion. Som en negativ kontrol blev en negativ fuldblod prøve inkluderet. X-aksen = den endelige koncentrationen af EBOV i den spidse fuldblod prøve (kopier/mL), y-aksen = min til positive. (B) For en proof of concept, fuldblod (1,6 mL) delprøver fra 7 patienter, diagnosticeret positive for EBV (13.000-500 eksemplarer/mL) på Institut for Virus & mikrobiologiske særlig diagnostik, Statens Serum Institut, Danmark, undergik en NA udvinding ved hjælp af metoden forenklet NA udvinding og blev analyseret af en EBV-specifik lampe reaktion ved hjælp af bærbar batteri-drevet Genie II isotermisk enhed. Som en negativ kontrol blev en Parvo B19-positive prøve inkluderet. X-aksen = virusmængde af EBV i en patient prøve (kopier/mL), y-aksen = min til positive. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne rapport beskriver vi en sikker, hurtig og enkel manuel sengelamper NA ekstraktion metode til downstream molekylære påvisning af virus i lysis/binding buffer-inaktiverede fuldblod. Metoden beskrevet NA udvinding blev udviklet udføres direkte på hele blodprøver indsamlet i vakuum blod indsamling rør indeholdende lysis/binding buffer (Table of Materials)7. Denne specifikke buffer inaktiverer EBOV7 og det kritiske element i metoden. Efter samlingen blod anbefaler vi inkubere tube til mindst 20 min.7 for at sikre en fuldstændig inaktivering af prøven. Bedside EBOV inaktivering eliminerer behovet for håndtering af EBOV-positive prøver under strenge indeslutningsbetingelser, såsom BSL-4 betingelser, og giver mulighed for prøver skal håndteres under normale BSL-2. Det er sandsynligt, at andre risiko gruppe fire patogener, såsom Lassa-virus, Marburg virus og Krim-Congo hæmoragisk feber virus er også inaktiveret ved denne buffer, men dette er fortsat at være vist.
Metoden beskrevet NA udvinding blev udviklet til at være udført ved siden af en patient i en hospitalsafdeling isolation eller i et felthospital og derfor kræver ingen laboratorieudstyr, såsom centrifuger, varme blokke eller elektricitet. Alt det kræver NA ekstraktion metode er rør indeholdende et fast volumen af FUP eller vask buffere, magnetiske indehaveren og engangs pipetter. Pre-tilberedning af de rør, der indeholder buffere forenkler protokollen, fordi det fjerner behovet for pipetter, og i stedet, de aliquoted buffere er hældes direkte i prøveglassene. Den magnetiske indehaveren fangster FUP indeholder NA og formidler en nem håndtering af wash skridt. Den magnetiske indehaveren kan erstattes med en almindelig magnet og en elastik, i tilfælde af en magnetisk indehaveren ikke er tilgængelig; Men, magnetiske indehaveren reducerer hands-on risikoen for faldende røret og spilde indholdet ved anvendelsen af magnet og elastik. På grund af viskositet i eksemplet lysis/binding buffer-inaktiverede fuldblod bruges engangs pipetter til at fjerne supernatanten/væske/vask buffere fra røret. De disponible pipetter kan erstattes af en direkte hælde indholdet fra røret i en affaldsindsamling tube, men vær opmærksom på ikke at skabe nogen dråber uden for røret. Hvis dråberne er oprettet, desinficeres forurenet overflade skal aldrig direkte med Kloramin eller natriumhypochlorit (de aktive ingredienser i "blegemiddel"), fordi denne blanding kan føre til dannelse af giftige cyanid. Derfor, hvis spildt først, tørre op spild med en absorberende serviet. Næste, Rengør overfladen med 70% ethanol og derefter med rigeligt vand, og endelig bruge Kloramin eller natriumhypochlorit. Dette omfatter alt affald, der har været i kontakt med lysis/binding buffer (herunder affaldsindsamling røret og det disponible pipetter). I stedet, indsamle alt affald i en separat spildbakken og kun desinficeres på ydersiden af beholderen med 70% ethanol.
NAs er normalt elueres fra FUP under en varme trin, men denne varme trin er blevet fjernet i den forenklede NA udvinding protokol til at eliminere brugen af elektricitet og udstyr. Derfor, NAs har tendens til at holde sig til FUP, som derfor skal føjes til downstream NA påvisning analysen for en positiv NA detektion. De flerårige udviklingsprogrammer er overført til downstream-mastermix, ved hjælp af et slipværktøj fra 1,5 mL engangs pipette. Denne tilføjelse er ikke så præcis som normal tilsætning ved hjælp af en fin spids pipette; dog upræcis tilsætning af NA/FUP til LAMPEN, RT-lampe, qPCR eller RT-qPCR mastermix ikke hæmme reaktionen eller påvirke fluorescens signal i vores in-house diagnostiske assay. Dog dette kan variere fra assay til analyse, og vi anbefaler at hver downstream NA testen er valideret, og at følsomheden af analysen er testet ved hjælp af metoden forenklet NA udvinding. NA ekstraktion metode er relativt følsomme, og hele blodprøver indeholdende en DNA eller RNA-virus, så lavt som 3.000 eksemplarer/mL kan nemt udvindes og registreret i de downstream molekylære test, såsom qPCR. Virusmængde i kliniske prøver er normalt meget højt i den akutte fase af en infektion, og hæmoragisk feber virus, såsom EBOV, Lassa virus og Krim-Congo hæmoragisk feber virus, indeholder normalt mere end 105 kopier/mL9 ,10,11. Derfor kan virus i disse prøver nemt blive opdaget ved hjælp af denne NA ekstraktion metode. Dog MPLB inaktivering af vira end EBOV-7, Vaccinia og Cowpox virus8 er stadig at blive vist.
Den forenklede NA ekstraktion metode kan udføres i isolation hospitalsafdelinger eller i Feltindstillinger og er ideel til punkt af pleje Molekylær diagnostik. Metoden er imidlertid ikke relevant for høj overførselshastighed NA ekstraktioner på grund af den praktiske håndtering af et åbent rør. Hvis høj overførselshastighed NA ekstraktioner er nødvendige, kan inaktiverede fuldblod prøver nemt renses ved hjælp af NA udvinding robotter7. En anden ulempe er håndteringen af skadelige reagenser som lysis/binding buffer [20-30% polyethylen glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether og 30-50% guanidinium kaliumthiocyanat (GITC)]17 og wash buffer jeg (30-50% guanidinium chlorid)17 i et åbent rør uden for en flow hætte. Lysis/binding buffer i koncentreret form er indeholdt i vakuum rør og med samling af blod 1:1 (v/v), koncentrationen er reduceret før røret er åbnet. Åbningen af vakuum rør og tilføjelse/fjernelse af FUP eller vaskebuffer jeg udføres inden for et par sekunder, og dermed risikoen for indånding af aerosoler er minimal. Efter fjernelse af wash buffer-jeg, fra røret, ingen andre skadelige reagenser der bruges i protokollen.
Mange hurtige punkt af pleje molekylære test og enheder er blevet udviklet siden udbruddet af EBOV i 20133,6,12,13,14,15,16 . Mange af disse tests kræver dog stadig en up-stream håndtering af infektiøs materiale, BSL-3 biosikkerhed kabinetter, og på et minimum, laboratorieudstyr såsom pipetter, centrifuger, og varme blokke eller elektricitet. Brugen af biosikkerhed kabinetter komplicerer og forlænger en hurtig diagnose. Beskrevet sengelamper virus inaktivering med direkte indsamling af blod i de virus inaktivering rør kombineret med den forenklede NA ekstraktion metode eliminerer behovet for Biosikkerhed frysere, el og laboratoriefaciliteter. Derudover fordi metoden forenklet NA udvinding kan udføres ved siden af patienten og kombineret med en lampe reaktion i en bærbar batteri-drevet isotermisk enhed, kan en sikker sengelamper molekylære diagnose opnås indenfor 40 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takke Susanne Lopes Rasmussen og Solvej Kolbjørn Jensen for deres tekniske bistand og for håndtering af kliniske prøver. Dette projekt er en del af EbolaMoDRAD-konsortiet, der har modtaget støtte fra det nyskabende medicin initiativ 2 fælles tilsagn under grant aftale N ° 115843. Dette fællesforetagende modtager støtte fra EUs Horisont 2020 forskning og innovation program og EFPIA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL) | Becton Dickinson | 368861 | |
| Plus Blood Collection | Becton Dickinson | 362725 | |
| 23G x 1 needle | Becton Dickinson | 300800 | |
| LUER LOK syringe (3 mL) | Becton Dickinson | 309658 | |
| Butterfly needle with small-bore extension tubing | Jørgen Kruuse A/S | 121714 | |
| 1% Virkon | Nomeco A/S | 849265 | |
| MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lysis/Binding Buffer - Refill | Roche Diagnostics A/S | 03246752001 | |
| MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit | Roche Diagnostics A/S | 3038505001 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL) | Thermo Fisher Scientific | 375418 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379189 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379146 | |
| DynaMag™-5 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Thermo Scientific™ Samco™ Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 231 | |
| Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 |
References
- Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).
- Benzine, J. W., Brown, K. M., et al. Molecular Diagnostic Field Test for Point-of-Care Detection of Ebola Virus Directly from Blood. Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 3), S234-S242 (2016).
- Faye, O., Faye, O., et al. Development and deployment of a rapid recombinase polymerase amplification Ebola virus detection assay in Guinea in 2015. Euro Surveillance. 20 (44), 10-18 (2015).
- Yang, M., Ke, Y., et al. Development and Evaluation of a Rapid and Sensitive EBOV-RPA Test for Rapid Diagnosis of Ebola Virus Disease. Scientific Reports. 6, (2016).
- Smither, S. J., Weller, S. A., et al. Buffer AVL alone does not inactivate Ebola virus in a representative clinical sample type. Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3148-3154 (2015).
- Byrnes, S., Fan, A., et al. A Portable, Pressure Driven, Room Temperature Nucleic Acid Extraction and Storage System for Point of Care Molecular Diagnostics. Analytical Methods. 5 (13), 3177-3184 (2013).
- Rosenstierne, M. W., Karlberg, H., et al. Rapid bedside inactivation of Ebola virus for safe nucleic acid tests. Journal of Clinical Microbiology. 54 (10), 2521-2529 (2016).
- Vinner, L., Fomsgaard, A. Inactivation of orthopoxvirus for diagnostic PCR analysis. Journal of Virological Methods. 146, 401-404 (2007).
- Schmitz, H., Köhler, B., et al. Monitoring of clinical and laboratory data in two cases of imported Lassa fever. Microbes and Infection. 4 (1), 43-50 (2002).
- De La Vega, M. A., Caleo, G., et al. Ebola viral load at diagnosis associates with patient outcome and outbreak evolution. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4421-4428 (2015).
- Hasanoglu, I., Guner, R., et al. Dynamics of viral load in Crimean Congo hemorrhagic fever. Journal of Medical Virology. 90 (4), 639-643 (2017).
- Biava, M., Colavita, F., et al. Evaluation of a rapid and sensitive RT-qPCR assay for the detection of Ebola Virus. Journal of Virological Methods. 252, 70-74 (2018).
- Fernández-Carballo, B. L., McBeth, C., et al. Continuous-flow, microfluidic, qRT-PCR system for RNA virus detection. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (1), 33-43 (2017).
- Weller, S. A., Bailey, D., et al. Evaluation of the Biofire FilmArray Biothreat E-test (v2.5) for rapid identification of Ebola virus disease in heat-treated blood samples obtained in Sierra Leone and United Kingdom. Journal of Clinical Microbiology. 54 (1), 114-119 (2015).
- Semper, A. E., Broadhurst, M. J., et al. Performance of the GeneXpert Ebola Assay for Diagnosis of Ebola Virus Disease in Sierra Leone: A Field Evaluation Study. PLoS Medicine. 13 (3), e1001980 (2016).
- Biocartis. Instructions for Use: Idylla TM Ebola Virus Triage Test. , https://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/Safety/EmergencySituations/UCM503944.pdf (2016).
- MPLC. Total Nucleic Acid Isolation Kit. Safety data sheet version 1.7. , https://pim-eservices.roche.com/DownloadDocument/SDS/DE/en/03038505001 (2015).
