Summary
Her presenterer vi en protokoll for rask virus nukleinsyre utvinning fra virus-inaktivert hele blodet. Utvinning utføres direkte i blod samling rør og krever ingen utstyr eller elektrisitet. Metoden er ikke avhengig av laboratoriet og kan brukes hvor som helst (f.eksi feltet sykehus).
Abstract
Rask diagnose av en infeksjon er viktig for utbruddet ledelse, risiko forvaring og pasient. Vi har tidligere vist en metode for rask sengen inaktivering av Ebolaviruset under blod prøvetaking for sikker nukleinsyre (NA) tester ved å legge til en kommersiell lysis binding buffer direkte inn i vakuum blod samling rørene. Med denne sengen inaktivering tilnærming, har vi utviklet en trygg, rask og forenklet sengen NA utvinning metode for påfølgende påvisning av virus i lyse binding buffer-inaktivert fullblod. NA utvinning utføres direkte i blod samling rør og krever ingen utstyr eller elektrisitet.
Når blodet samles inn i lyse binding buffer, innholdet er mikset av bla røret for hånd og blandingen er ruges i 20 minutter ved romtemperatur. Magnetisk glass partikler (MGPs) legges til røret, og innholdet er mikset av bla samling rør for hånd. MGPs er deretter samlet på siden av blod samling tuben bruke magnetisk innehaver eller en magnet og en gummi band. MGPs er vasket tre ganger, og etter tillegg av elueringsbufferen direkte inn i samling røret, NAs klar for NA tester, som qPCR eller isotermiske loop forsterkning (lampe), uten fjerning av MGPs reaksjonen. NA utvinning metoden er ikke avhengig av noen laboratoriefasiliteter og lett kan brukes hvor som helst (f.eksi feltet sykehus og sykehus isolasjon avdelinger). Denne NA utvinning metoden er kombinert med lampe og en bærbar instrument, kan en diagnose oppnås innen 40 min av blod samling.
Introduction
I virus utbrudd situasjoner når pasienter er begrenset til sykehus isolasjon avdelingene eller når en rask diagnose er nødvendig, er en sikker, enkel og nøyaktig point-of-care molekylær diagnose viktig for pasienten omsorg og risiko kontroll. De to siste virale utbruddene, Ebolaviruset (EBOV) i Vest-Afrika (2013) og Zika viruset i Sør-Amerika (2015), har økt interessen for forbedret point-of-care molekylær diagnostiske tester, som omvendt transkripsjon loop-mediert isotermiske forsterkning (RT-lampe)1,2 og recombinase utvalg forsterkning (RPA)3,4. Både RT-lampe og RPA er rask, følsom og spesifikk molekylær tester som kan utføres på forenklet eksempel forberedelser. Zika viruset, har RT-lampen vært kombinert med en lateral flyt analyse (LFA), som kan oppdage Zika virus i ikke-renset hele blodprøver innen 30 min1; men for EBOV, som er klassifisert som en risiko gruppe 4 patogen og er svært smittsom, prøvene skal håndteres under biosikkerhet nivå 4 (BSL-4) forhold og deaktiveres før alle trygt diagnostiske prosedyrer kan utføres.
Forenklet inaktivering metoder for EBOV, som tillegg av lysis buffere til eksempel2,3,4,5, ble brukt under utbruddet; men krever metodene håndtering under BSL-4 forhold laboratorium utstyr, slik som BSL-3 biosikkerhet skap, sentrifuger, oppvarming blokker og Pipetter, minst. Dette utstyret er normalt ikke finnes i isolasjon avdelinger eller ut i feltsykehus. For å overvinne denne utfordringen, forsøk har blitt gjort å utføre diagnostikk i kofferter3, og flere bærbare enheter og apparater har vært utviklet [f.eksen bærbar enhet for nukleinsyre (NA) utvinning]6. Men må EBOV-positive prøver fortsatt deaktiveres før disse enhetene kan brukes.
Vi har tidligere rapportert en rask sengen virus inaktivering metode for EBOV7, Vaccinia virus og Cowpox virus8 av tillegg av en kommersiell lysis binding buffer til vanlige vakuum blod samling rør, tillater for direkte overføring av blod fra pasienten i inaktivering buffer7. Denne direkte og umiddelbar inaktivering i et lukket system eliminerer behovet for håndtering prøvene med alle strenge inneslutning, som BSL-4 forhold7, og prøvene kan håndteres under normale BSL-2 forhold. Denne inaktivering metoden er kompatibel med flere NA utvinning systemer, for eksempel roboter og hånd rensing kits7; disse metodene krever imidlertid laboratorieutstyr og som roboter, sentrifuger og elektrisitet, som ikke alltid tilstede i innstillinger eller i sykehus isolasjon menigheter.
I denne rapporten beskriver vi en trygg, rask og forenklet manuell NA utvinning metode for påfølgende molekylær påvisning av virus i lyse binding buffer-inaktivert fullblod. NA utvinning metoden krever ikke utstyr enn en magnet/magnetisk holder. Ingen sentrifuger, oppvarming blokker eller strøm er nødvendig for NA utvinning. Derfor, denne metoden er ikke avhengig av laboratoriet og lett kan brukes hvor som helst (f.eksi feltet sykehus, sykehus isolasjon avdelinger eller med lav-ressurs innstillinger). NA utvinning metoden er rask og enkel og kan brukes direkte i nedstrøms NA tester, som qPCR, RT-qPCR, lampe eller RT-lampe. Denne NA utvinning metoden er kombinert med lampe og et bærbart batteri-drevet isotermiske instrument, kan sengen diagnosen oppnås innen 40 min av blod samling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Komiteen for biomedisinsk forskning etikk, regioner har gitt samtykke, og alle metodene som er beskrevet her har vært fritatt fra en gjennomgang av etiske komiteen systemet, i henhold til danske analysen utviklingsprosjekter.
1. utarbeidelse av blod samling vakuum-rør for Virus deaktivering og rask NA utvinning
FORSIKTIG: Bufferen for denne protokollen inneholder guanidinium thiocyanate (GITC) og en ikke-ioniske surfactant, som er irriterende. Ta riktige laboratorium sikkerhetstiltak, bruke flyt hette og bruke hansker når du håndterer den. Unngå hud og øyekontakt. Hvis bufferen er sølt, må forurenset overflaten aldri desinfiseres direkte med chloramine eller natriumhypokloritt (de aktive ingrediensene i "blekemiddel") fordi denne blandingen kan føre til dannelse av giftig cyanid. Først tørke opp sølt buffer med absorberende vevet. Deretter rengjøre overflaten med 70% etanol, og deretter med vann, og til slutt bruke chloramine eller natriumhypokloritt.
- For å forberede blod samling vakuum-rør, injisere 1.6 mL av bestemte kommersielle lyseringsbuffer i en 4 mL EDTA vakuumrør av punktering lokket på røret med en 25 G x 1 p og en 3 mL sprøyte.
Merk: Ikke Fjern lokket av vakuumrør. Vakuum må opprettholdes. - Lagre vakuum-rør som inneholder bufferen ved romtemperatur før bruk.
Merk: Rørene er stabile i minst ett år etter forberedelsen.
2. utarbeidelse av buffere for NA utvinning
- Å forberede bufferne for uttrekking NA, sted to 1.8 mL, to 4.5 mL og en 3,6 mL rør i et rack.
- Legge ved pipettering, 960 µL av magnetiske glass partikler (MGPs) til en ren 1,8 mL og Merk det med MGPs. Resuspend MGP suspensjon helt før pipettering det.
Merk: MGPs tendens til å raskt samle nederst på røret. - Legge til, av pipettering, 4 mL vaskebuffer jeg til en ren 4,5 mL tube og merke det som WB-1.
FORSIKTIG: Vaskebuffer I inneholder guanidinium natriumklorid, som er irriterende. Ta riktige laboratorium sikkerhetstiltak, bruke flyt hette og bruke hansker når du håndterer den. Unngå hud og øyekontakt. - Legge til, av pipettering, 1,5 mL vaskebuffer II til en ren 3,6 mL tube og merke det som WB-2.
- Legge til, av pipettering, 3 mL vaskebuffer III til en ren 4,5 mL tube og merke det som WB-3.
- Legge til, av pipettering, 100 µL av elueringsbufferen til en ren 1,8 mL tube, og Merk den som EB.
- Lagre aliquoted bufferne ved romtemperatur før bruk.
Merk: Rørene er stabil for minst 1 måned etter forberedelsen.
3. blod samling fra pasienter med tegn og symptomer på en virusinfeksjon
FORSIKTIG: Ta riktige laboratorium sikkerhetstiltak når fullblod fra pasienten. Bruk hansker og briller. Hvis pasienten er isolert, følg biosikkerhet nivå 4 prosedyrer.
- For å samle intravenøs fullblod fra pasienten, bruk en sommerfugl nål med små-bar forlengelse rør og en blod samling vakuumrør som inneholder en lysis binding buffer. Hvile pasientens arm i en nedadgående stilling og plasser samling røret lavere enn sommerfugl nålen. Butterfly nålen i fotsporene til pasienten og fest blod samling vakuumrør til små-bar forlengelse.
Merk: Dette hindrer tilbake-flow. - Etter samlingen blod, bland innholdet i røret ved å bla røret 5 - 10 ganger.
Merk: På grunn av det gjenværende vakuumet i blod samling røret som inneholder 1.6 mL lysis binding bufferen, volumet av prøven samlet vil automatisk bli 1.6 mL. - Desinfiser utsiden av røret med 70% etanol.
- Inkuber rør for 20 min ved romtemperatur.
Merk: Protokollen kan pauses her og full blod samling rør kan lagres på 20 ° C, 5 ° C, 25 ° C eller 37 ° C i minst 1 måned7. - Fortsette direkte til forenklet NA utvinning metoden.
4. forenklet NA utvinning av hele blod
- For å rense NA fra lysis binding buffer-inaktivert samlet blod, blanding rør innholdet i røret ved å bla vakuum for hånd 5-10 x.
- Fjern lokket på røret nøye og utslipp lokket.
- Hell i forberedt aliquot prøvde MGPS (1 mL) direkte inn i blod samling røret.
- Plass nye lokk fra en ubrukt blod samling rør på røret som inneholder utvalget.
- Plass fingeren på lokket å sikre at røret er tett lukket og bland innholdet i røret ved å bla blod samling rør for hånd 5 - 10 ganger.
- Sett røret i magnetiske holderen og holde en finger på lokket å sikre røret er tett lukket.
- Vend magnetiske holderen med røret noen ganger hånden å sørge for at alle MGPs er samlet på siden av røret med magneten.
Merk: Magnetisk innehaveren kan erstattes med en langstrakt magnet og en gummi band. - Fjern lokket av røret og kaste innholdet i røret ved å bruke en engangs pipette eller bare ved å helle innholdet i en 50 mL samling rør.
Merk: Unngå aerosoler fra 50 mL samling røret ved å lukke røret med lokk. - Hell i forberedt aliquot WB-1 (4 mL) direkte inn i blod samling røret.
- Sett lokket på røret og plassere en finger på lokket å sikre røret er tett lukket.
- Fjern røret fra magnetiske innehaveren, holde lokket sikkert strammes med en finger.
Merk: Hvis du bruker en magnet og en gummi band, bare fjerne gummi band og magnet fra røret. - Resuspend MGPs ved å bla blod samling rør for hånd 5 - 10 ganger.
- Gjenta 4.6-4.8.
- Hell i forberedt aliquot av WB-2 (1,5 mL) direkte inn i blod samling røret.
- Sett lokket på røret og fjerne røret fra magnetiske abonnenten.
Merk: Hvis du bruker en magnet og en gummi band, bare fjerne gummi band og magnet fra røret. - Plass fingeren på lokket å sikre røret er tett lukket.
- Resuspend MGPs ved å bla blod samling rør i noen sekunder for hånd.
- Gjenta trinn 4.6-4.8.
- Hell i forberedt aliquot WB-3 (3 mL) direkte inn i blod samling røret.
- Sett lokket på røret og fjerne røret fra magnetiske abonnenten.
Merk: Hvis du bruker en magnet og en gummi band, bare fjerne gummi band og magnet fra røret. - Plass fingeren på lokket å sikre røret er tett lukket.
- Resuspend MGPs ved å bla blod samling rør for hånd 5 - 10 ganger.
- Gjenta 4.6-4.8.
- Hell i forberedt aliquot av EB (100 µL) direkte inn i blod samling røret.
- Sett lokket på røret og fjerne røret fra magnetiske abonnenten.
Merk: Hvis du bruker en magnet og en gummi band, bare fjerne gummi band og magnet fra røret. - Resuspend MGPs i EB ved å tappe blod samling røret 5 - 10 ganger med en finger.
Merk: Protokollen kan pauses her og rør kan lagres på 20 ° C. - Overføre en dråpe (5-8 µL) av de resuspended MGPs til nedstrøms NA forsterkning reaksjonen blanding med en 1,5 mL disponibel pipette (alle nedstrøms diagnostiske NA forsterkning analysen som LAMP/RT-lampe eller qPCR/RT-qPCR analyser kan brukes).
Merk: NAs vil holde seg til MGPs, så husk å bruke MGPs i nedstrøms NA forsterkning reaksjonen. Bland MGP suspensjon før bruk. Etter miksing samler MGPs nederst på røret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen presenteres her er enkel og effektiv og bredt kan brukes på noen molekylær analysen utføres på smittsomme hele blodprøver inaktivert med lyse binding bufferen. Arbeidsflyten for blod inaktivering og NA utvinning er vist i figur 1, inkludert utarbeidelse av blod samling vakuum-rør7 (figur 1A), blod samling7 (figur 1B), NA utvinning ( Tallene 1 c - 1 H), og nedstrøms NA analyse (figur 1I).
På grunn av forenklet NA utvinning protokollen, MGPs fjernes ikke fra elueringsrør trinn, og derfor NAs har en tendens til å holde seg til MGPs. Alle nedstrøms molekylær analyse, for eksempel qPCR eller lampe analyse, må utføres direkte på MGPs (figur 1I og figur 2) for å sikre et positivt resultat.
NA utvinning metoden er effektiv og RNA - eller DNA-virus-positiv hele blodprøver med viral belastning så lavt som 130-3000 Kopier/mL kan trekkes ut og analyseres ved hjelp qPCR eller RT-qPCR (Figur 3).
Bruker metoden NA utvinning, lampe eller RT-lampe og en bærbar batteri-drevet isotermiske enhet for virus-positive hele blodprøver, kan en diagnose oppnås innen 40 min fra blod samling (Figur 4).
Figur 1 : Arbeidsflyt for forenklet NA utvinning av hele blodprøver. (A) forberede lysis binding buffer vakuum blod samling rør med en nål og en sprøyte. (B) samle blod bruker en sommerfugl nål. (C) sted blod samling røret i en holder, Fjern lokket, og hell MGPs i røret. (D) lukke røret med nye lokk og bland innholdet ved å bla røret for hånd. (E) samle MGPs på siden av blod samling røret ved å bla røret i magnetiske holderen. (F) fjerne nedbryting bruker en engangs pipette. (G) hell vask eller elueringsrør bufferne direkte i blod samling rør og gjenta handlingene vises i paneler D - F. (H) dette panelet viser MGPs direkte brukes i en qPCR, RT-qPCR, lampe eller RT-lampe reaksjon. (jeg) overføre en dråpe (5-8 µL) MGPs til en PCR eller lampe reaksjon tube med en 1,5 mL disponibel pipette. Panelet A og B: Dette tallet har blitt endret fra Rosenstierne et al. 7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : NA påvisning av 28 virus-positive hele blodprøver utdraget benytter forenklet NA utvinning metoden. Hele blodprøver (1.6 mL) testet negativ for virus var piggete med enten en DNA-virus [Epstein - Barr virus (EBV) (2.0 x 104 - 1.0 x 103 Kopier/mL)] eller en RNA-virus [hepatitt C-viruset (HCV) (6.0 x 105 - 3.0 x 103 Kopier/mL)] eller en Dengue virus (DENV) (1,7 x 108 - 1,7 x 106 Kopier/mL). NAs ble hentet ved hjelp av metoden beskrevet ovenfor, og utdraget NAs ble analysert i duplikat av bestemte interne qPCR, RT PCR, lampe eller RT-lampe, med eller uten MGPs. X-akse = NA oppdagelse metode, y-akse = prosentandelen av prøver positiv i qPCR/lampe. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Følsomheten til forenklet NA utvinning metoden. Et bevis på konseptet av metoden, virus negative fullblod ble tilsatt forskjellige RNA eller DNA virus preparater som inneholder et definert viral belastning og NAs ble hentet ved hjelp av forenklet NA utvinning metoden. (A) Negative fullblod (1,4 mL) ble tilsatt 200 µL av 10 ganger fortynninger av EBOV standard forberedt for diagnoseformål (ENIVD), som ble utarbeidet fra den siste utbruddet i Guéckédou/Guinea (2,0 x 106 Kopier/mL). Utdraget NAs ble analysert i duplikat av et internt EBOV-spesifikke RT-qPCR7 benytter et MX3005P termisk cycler. (B) fullblod (1,2 mL) ble tilsatt 400 µL av 10 ganger fortynninger av en HCV som standardisert serum prøve (1.2 x 106 IU/mL). Utdraget NAs ble analysert i duplikat av et internt HCV-spesifikke RT-qPCR med et MX3005P termisk cycler. (C) fullblod (1,2 mL) ble tilsatt 400 µL av ulike konsentrasjoner av EBV (2.0 x 104 Kopier/mL, 8.0 x 103 Kopier/mL, 2.7 x 103 Kopier/mL og 9.3 x 102 Kopier/mL). Utdraget NAs ble analysert i duplikat av et internt EBV-spesifikke qPCR. (D) fullblod (1,2 mL) ble tilsatt 400 µL av 10 ganger fortynninger av BK virus (1,3 x 104 Kopier/mL). Utdraget NAs ble analysert i duplikat av et internt BK-spesifikke qPCR. X-akse = siste konsentrasjonen av virus i piggete fullblod utvalget (Kopier/mL eller IU/mL), y-akse = Ct-verdien (gjennomsnittlig ± SD). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Forenklet NA utvinning og RT-lampe eller LAMP bruke en bærbar isotermiske enhet. (A) på grunn av manglende EBOV-positive hele blodprøver på avdeling av Virus & mikrobiologisk spesielle diagnostikk, Statens Serum Institut, Danmark, 1,4 mL av negative fullblod ble tilsatt 200 µL av ulike fortynninger av EBOV standard forberedt for diagnoseformål (ENIVD). Piggete prøvene gjennomgikk uttrekking NA bruke forenklet NA utvinning metoden og ble analysert av en EBOV-spesifikke RT-lampe reaksjon. Som en negativ kontroll ble en negativ hele blodprøve. X-akse = siste konsentrasjonen av EBOV i piggete fullblod utvalget (Kopier/mL), y-akse = min til positive. (B) en konseptbeviskode fullblod (1.6 mL) dele fra 7 pasienter, diagnostisert positive EBV (13.000-500 kopier/mL) på avdeling av Virus & mikrobiologisk spesielle diagnostikk, Statens Serum Institut, Danmark, gjennomgikk en NA trekking med metoden for forenklet NA-utvinning og ble analysert av en EBV-spesifikke lampe reaksjon med bærbart batteri-drevet Genie II isotermiske enhet. Som en negativ kontroll ble en Parvo B19-positiv prøve. X-akse = viral belastningen av EBV i en pasient prøve (Kopier/mL), y-akse = min til positive. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne rapporten beskriver vi en trygg, rask og enkel manuell sengen NA utvinning metode for nedstrøms molekylær påvisning av virus i lyse binding buffer-inaktivert fullblod. Beskrevet NA utvinning metoden ble utviklet for å utføres direkte på hele blodprøver i vakuum blod samling rør som inneholder lysis binding buffer (Tabell for materiale)7. Denne tjenestespesifikke bufferen deaktiverer EBOV7 og er den kritiske komponenten i metoden. Etter samlingen blod anbefaler vi rugende røret for minst 20 min7 for å sikre en komplett inaktivering av prøven. Sengen EBOV inaktivering eliminerer behovet for håndtering noen EBOV-positive eksempler under strenge containment forhold, for eksempel BSL-4 forhold, og lar prøvene skal håndteres under normale BSL-2 forhold. Det er sannsynlig at andre risiko gruppen fire patogener, som Lassa viruset, Marburg viruset og Krim Kongo hemoragisk feber viruset er også inaktivert av bufferen, men dette er fortsatt å bli vist.
Beskrevet NA utvinning metoden ble utviklet utføres ved en pasient i et sykehus isolasjon menighet eller en feltsykehus, og derfor krever ikke laboratorieutstyr og som sentrifuger, oppvarming blokker eller elektrisitet. Alle som krever NA utvinning metoden er rør som inneholder et fast antall MGPs eller vaskebuffere, magnetiske innehaver og disponibel pipetter. Det pre-forberedelsen av rørene som inneholder buffere forenkler protokollen fordi det eliminerer behovet for Pipetter, og i stedet aliquoted bufferne er strømmet direkte inn i prøven rørene. Magnetisk abonnenten fanger MGPs inneholder NA og formidler en enkel håndtering av vask trinnene. Magnetisk innehaveren kan erstattes med en vanlig magnet og en gummi band i tilfelle en magnetisk holder ikke er tilgjengelig. men reduserer magnetisk holderen hands-on risikoen for droppet tuben og søle innholdet når bruke magnet og strikk. På grunn av viskositeten av lysis binding buffer-inaktivert fullblod prøven brukes disponibel Pipetter å fjerne nedbryting/væske/vaskebuffere fra røret. De disponible Pipetter kan erstattes med en direkte helle innholdet fra tuben til en innsamling rør, men vær oppmerksom på ikke å skape noen dråper utenfor røret. Hvis dråper er opprettet, må forurenset overflaten aldri desinfiseres direkte med chloramine eller natriumhypokloritt (de aktive ingrediensene i "blekemiddel") fordi denne blandingen kan føre til dannelse av giftig cyanid. Derfor hvis sølt først, tørk opp spill med en absorberende vev. Deretter rengjøre overflaten med 70% etanol, og deretter med mye vann, og til slutt bruke chloramine eller natriumhypokloritt. Dette inkluderer alle avfall som har vært i kontakt med lyse binding bufferen (inkludert innsamling røret og disponibel Pipetter). I stedet, samle alle avfall i en egen beholder med avfall og bare desinfisere utsiden av beholderen med 70% etanol.
NAs er normalt elut fra MGPs under en oppvarming trinn, men dette oppvarming trinnet er fjernet i forenklet NA utvinning protokollen for å fjerne bruken av elektrisitet og utstyr. Derfor pleier NAs å holde seg til MGPs, som derfor må legges til nedstrøms NA oppdagelsen analysen for en positiv NA oppdagelsen. MGPs overføres til nedstrøms reaksjonen blanding ved hjelp av et slippverktøy fra en 1,5 mL disponibel pipette. Dette tillegget er ikke så nøyaktig som den normale tillegget ved hjelp av en fin tips pipette; men unøyaktig tillegg av NA/MGPs til lampen, RT-lampe, qPCR eller RT-qPCR reaksjonen blanding ikke hemme reaksjonen eller påvirke fluorescens signalet i våre interne diagnostiske analysen. Likevel, dette kan variere fra analysen til analysen, og vi anbefaler at hver nedstrøms NA test er validert, og at følsomheten til analysen er testet ved hjelp av forenklet NA utvinning metoden. NA utvinning metoden er relativt sensitive, og hele blodprøver som inneholder et DNA eller RNA-virus så lavt som 3000 Kopier/mL kan enkelt trekkes ut og oppdaget i nedstrøms molekylær testene, for eksempel qPCR. Virusmengden i klinisk prøver er vanligvis svært høy i akutte fasen av en infeksjon, og hemoragisk feber virus, som EBOV, Lassa virus og Krim Kongo hemoragisk feber virus, inneholder vanligvis mer enn 105 Kopier/mL9 ,10,11. Derfor kan virus i disse prøvene lett bli oppdaget denne NA utvinning metoden. Men MPLB inaktivering av virus enn EBOV7, Vaccinia og Cowpox virus8 gjenstår å bli vist.
Forenklet NA utvinning metoden kan utføres i sykehus isolasjon avdelinger eller Feltinnstillinger, og er ideelt for point-of-care molekylær diagnostikk. Metoden er imidlertid ikke gjelder for høy gjennomstrømming NA utdrag på grunn av praktisk håndtering av en åpen. Hvis det trengs høy gjennomstrømming NA utdrag, kan deaktivert hele blodprøvene lett bli renset bruker NA utvinning roboter7. En annen ulempe er håndtering av skadelige reagenser som lysis binding buffer [20-30% polyetylenglykol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-fenyl Eter og 30-50% guanidinium thiocyanate (GITC)]17 og vaske bufferen jeg (30-50% guanidinium klor)17 i en åpen rør utenfor flyt hette. Lysis binding bufferen i konsentrert form er inneholdt innen vakuumrør og med innsamling av blod 1:1 (v/v), konsentrasjonen reduseres før røret er åpnet. Åpningen av vakuumrør og tillegg/fjerning av MGPs eller vaskebuffer jeg utføres innen få sekunder, og derfor risikoen for innånding av aerosoler er minimal. Etter fjerning av vaskebuffer-jeg, fra røret, brukes ingen andre skadelige reagenser i protokollen.
Mange rask point-of-care molekylær tester og enheter er utviklet siden EBOV utbruddet i 20133,6,12,13,14,15,16 . Men forlange mange av disse testene fremdeles en opp-stream håndtering smittsomme materiale, BSL-3 biosikkerhet skap, og på et minimum, laboratorieutstyr og som Pipetter, sentrifuger, og oppvarming blokker eller elektrisitet. Bruk av biosafety skap kompliserer og forlenger en rask diagnose. Beskrevet sengen virus inaktivering med direkte innsamling av blod inn i virus inaktivering rørene kombinert med forenklet NA utvinning metoden eliminerer behovet for biosikkerhet skap, strøm og laboratoriefasiliteter. I tillegg fordi forenklet NA utvinning metoden kan utføres ved siden av pasienten og kombinert med en lampe reaksjon i en bærbar batteri-drevet isotermiske enhet, fås en trygg sengen molekylær diagnose i 40 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Susanne Lopes Rasmussen og Solvej Kolbjørn Jensen for deres kundestøtte og håndtering klinisk prøvene. Dette prosjektet er en del av EbolaMoDRAD consortium, som har mottatt finansiering fra den nyskapende medisin initiativ 2 felles oppgave under grant avtalen N ° 115843. Denne felles forpliktelsen mottar støtte fra EUs horisonten 2020 forskning og innovasjon programmet og EFPIA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL) | Becton Dickinson | 368861 | |
| Plus Blood Collection | Becton Dickinson | 362725 | |
| 23G x 1 needle | Becton Dickinson | 300800 | |
| LUER LOK syringe (3 mL) | Becton Dickinson | 309658 | |
| Butterfly needle with small-bore extension tubing | Jørgen Kruuse A/S | 121714 | |
| 1% Virkon | Nomeco A/S | 849265 | |
| MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lysis/Binding Buffer - Refill | Roche Diagnostics A/S | 03246752001 | |
| MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit | Roche Diagnostics A/S | 3038505001 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL) | Thermo Fisher Scientific | 375418 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379189 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379146 | |
| DynaMag™-5 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Thermo Scientific™ Samco™ Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 231 | |
| Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 |
References
- Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).
- Benzine, J. W., Brown, K. M., et al. Molecular Diagnostic Field Test for Point-of-Care Detection of Ebola Virus Directly from Blood. Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 3), S234-S242 (2016).
- Faye, O., Faye, O., et al. Development and deployment of a rapid recombinase polymerase amplification Ebola virus detection assay in Guinea in 2015. Euro Surveillance. 20 (44), 10-18 (2015).
- Yang, M., Ke, Y., et al. Development and Evaluation of a Rapid and Sensitive EBOV-RPA Test for Rapid Diagnosis of Ebola Virus Disease. Scientific Reports. 6, (2016).
- Smither, S. J., Weller, S. A., et al. Buffer AVL alone does not inactivate Ebola virus in a representative clinical sample type. Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3148-3154 (2015).
- Byrnes, S., Fan, A., et al. A Portable, Pressure Driven, Room Temperature Nucleic Acid Extraction and Storage System for Point of Care Molecular Diagnostics. Analytical Methods. 5 (13), 3177-3184 (2013).
- Rosenstierne, M. W., Karlberg, H., et al. Rapid bedside inactivation of Ebola virus for safe nucleic acid tests. Journal of Clinical Microbiology. 54 (10), 2521-2529 (2016).
- Vinner, L., Fomsgaard, A. Inactivation of orthopoxvirus for diagnostic PCR analysis. Journal of Virological Methods. 146, 401-404 (2007).
- Schmitz, H., Köhler, B., et al. Monitoring of clinical and laboratory data in two cases of imported Lassa fever. Microbes and Infection. 4 (1), 43-50 (2002).
- De La Vega, M. A., Caleo, G., et al. Ebola viral load at diagnosis associates with patient outcome and outbreak evolution. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4421-4428 (2015).
- Hasanoglu, I., Guner, R., et al. Dynamics of viral load in Crimean Congo hemorrhagic fever. Journal of Medical Virology. 90 (4), 639-643 (2017).
- Biava, M., Colavita, F., et al. Evaluation of a rapid and sensitive RT-qPCR assay for the detection of Ebola Virus. Journal of Virological Methods. 252, 70-74 (2018).
- Fernández-Carballo, B. L., McBeth, C., et al. Continuous-flow, microfluidic, qRT-PCR system for RNA virus detection. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (1), 33-43 (2017).
- Weller, S. A., Bailey, D., et al. Evaluation of the Biofire FilmArray Biothreat E-test (v2.5) for rapid identification of Ebola virus disease in heat-treated blood samples obtained in Sierra Leone and United Kingdom. Journal of Clinical Microbiology. 54 (1), 114-119 (2015).
- Semper, A. E., Broadhurst, M. J., et al. Performance of the GeneXpert Ebola Assay for Diagnosis of Ebola Virus Disease in Sierra Leone: A Field Evaluation Study. PLoS Medicine. 13 (3), e1001980 (2016).
- Biocartis. Instructions for Use: Idylla TM Ebola Virus Triage Test. , https://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/Safety/EmergencySituations/UCM503944.pdf (2016).
- MPLC. Total Nucleic Acid Isolation Kit. Safety data sheet version 1.7. , https://pim-eservices.roche.com/DownloadDocument/SDS/DE/en/03038505001 (2015).
