Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפקת חומצות גרעין וירוס מהירה מהדם כל וירוס-לא פעיל. החילוץ מתבצע ישירות על צינורות איסוף דם ואינו דורש שום ציוד או חשמל. השיטה אינה תלויה למתקני המעבדה וניתן להשתמש בהם בכל מקום (למשל, בבתי-חולים שדה).
Abstract
האבחון מהיר של זיהום חיוני עבור ניהול התפרצות, הסיכון הבלימה, הטיפול בחולה. אנחנו בעבר הראו שיטה מהירה המיטה איון של וירוס האבולה במהלך לקיחת דמים לבדיקות בטוח חומצת גרעין (NA) על-ידי הוספת מאגר פירוק מסחריות/איגוד ישירות לתוך צינורות איסוף דם ואקום. באמצעות גישה זו המיטה איון, פיתחנו פשוטה, מהירה ובטוחה המיטה נה החילוץ שיטת הגילוי עוקבות של וירוס בדם כל פירוק/איגוד להשבית-מאגר. החילוץ נה מתבצע ישירות על צינורות איסוף דם, דורש ציוד או חשמל.
לאחר הדם נאסף לתוך המאגר פירוק/איגוד, התוכן מעורבבים. בהטלת הצינורית ביד, ולא התערובת מודגרת למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. חלקיקים מגנטיים זכוכית (MGPs) מתווספים הצינור, התוכן ומערבבים על ידי flipping הצינור אוסף בעבודת יד. MGPs ואז נאספים בצד הצינור איסוף הדם באמצעות מחזיק מגנטי או מגנט, גומייה. MGPs נשטפים שלוש פעמים, אחרי התוספת של מאגר • תנאי ישירות לתוך הצינור אוסף, NAs מוכנות לבדיקות נה, כגון qPCR או לולאה איזותרמי הגברה (מנורה), ללא הסרת MGPs של התגובה. שיטת החילוץ נה אינה תלויה כלשהו למתקני המעבדה, ניתן בקלות להשתמש בכל מקום (למשל, בבתי חולים שדה ובתי החולים בידוד במחלקות). כאשר שיטה זו החילוץ נה משולב עם המנורה, מכשיר נייד, ניתן לקבל אבחון בתוך 40 דקות של אוסף דם.
Introduction
במצבים התפרצות וירוס, כאשר בחולים מרותקים במחלקות בידוד חולים או כאשר נדרשת אבחנה מהירה, מדויקת, פשוטה ובטוחה בשלב של טיפול מולקולרית אבחון הכרחי הסגר לחולה הטיפול ואת הסיכון. שני האחרונים ויראלי התפרצויות, של וירוס האבולה (EBOV) במערב אפריקה (2013) והוירוס Zika בדרום אמריקה (2015), הגדילו את עניין משופרת בשלב של טיפול מולקולרית בדיקות אבחון, כגון שעתוק במהופך בתיווך לולאה איזותרמי הגברה (RT-המנורה)1,2 ו- recombinase פולימראז הגברה (RPA)3,4. RT-המנורה והן RPA הן בדיקות מולקולריות מהירה, רגיש, ספציפי שניתן לבצע על ההכנות דוגמה מפושטת. . הוירוס Zika RT-המנורה יש כבר בשילוב עם וזמינותו זרימה לרוחב (LFA), אשר יכול לזהות וירוס Zika בדגימות דם מלא שאינם מטוהרים בתוך 30 דקות1; עם זאת, עבור EBOV, אשר מסווגים חיידק קבוצה 4 סיכון והוא מדבק מאוד, הדגימות צריך להתנהל תחת אבטחה ברמה 4 תנאים (BSL-4) ו לא פעיל לפני כל הפרוצדורות האבחוניות בטוח שניתן לבצע.
שיטות איון פשוטה EBOV, כגון התוספת של פירוק מאגרי מדגם2,3,4,5, שימשו במהלך ההתפרצות; עם זאת, שיטות אלה דורשים טיפול בתנאים BSL-4 עם ציוד מעבדה, כגון ארונות אבטחה BSL-3, צנטריפוגות, חימום בלוקים, פיפטות, לכל הפחות. ציוד זה קיים בדרך כלל לא במחלקות בידוד או בבתי-חולים שדה. כדי להתגבר על האתגר הזה, נעשים ניסיונות לבצע אבחון מזוודות3ולאחר מספר מכשירים ניידים, מכונות כבר מפותחת [למשל, מכשיר נייד להפקת חומצות גרעין (NA)]6. עם זאת, עדיין דוגמאות EBOV-חיובית עליך ניתן להשבית התקנים אלה שניתן יהיה להשתמש בהם.
אנחנו דיווחו בעבר כי שיטה איון וירוס המיטה מהירה עבור EBOV7, וירוס Vaccinia, וירוס אבעבועות הפרות8 על ידי תוספת של מאגר פירוק מסחריות/איגוד אל צינורות איסוף דם ואקום רגיל, המאפשר הישיר העברה של דם מן המטופל לתוך מאגר השתקה של כרומוזום7. איון זה ישירה ומיידית בתוך מערכת סגורה מבטלת את הצורך טיפול בדגימות משתמש בכל בלימה קפדני, כגון תנאי BSL-47, הדגימות ניתן לטפל בתנאים רגילים BSL-2. שיטה זו איון היא תואמים מספר מערכות חילוץ נה, כמו רובוטים ערכות טיהור יד7; עם זאת, שיטות אלה דורשים ציוד מעבדה, כגון רובוטים, בדיקות חשמל, אשר אינם תמיד נוכח הגדרות שדה או בתוך בית החולים בידוד במחלקות.
בדו ח זה, אנו מתארים פשוטה, מהירה ובטוחה ידנית נה החילוץ שיטת זיהוי מולקולרי עוקבות של נגיף בדם כל פירוק/איגוד להשבית-מאגר. שיטת החילוץ נה אינו דורש שום ציוד שאינו בעל מגנט/מגנטי. אין צנטריפוגות, חימום בלוקים או חשמל יש צורך החילוץ נה. לפיכך, שיטה זו אינה תלויה למתקני המעבדה, ניתן בקלות להשתמש בכל מקום (למשל, בבתי-חולים שדה, במחלקות בידוד בבית החולים, או עם הגדרות משאבים נמוכה). שיטת החילוץ NA היא מהירה ופשוטה, והוא יכול לשמש ישירות בבדיקות נה במורד הזרם, כגון qPCR, RT-qPCR, מנורה או RT-המנורה. כאשר שיטה זו החילוץ נה משולב עם המנורה, מונחה הסוללה איזותרמי מכשיר נייד, ניתן לקבל אבחנה המיטה בתוך 40 דקות של אוסף דם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ועדת אתיקה במחקר ביו-רפואי, בירת אזור נתן הסכמה מדעת, כל השיטות המתוארות כאן מ'מניעת מסקירה על ידי מערכת הוועדה האתית, על פי החוק הדני על פרויקטי פיתוח וזמינותו.
1. הכנה שפופרות ואקום אוסף דם וירוס איון והפקת נה מהירה
התראה: המאגר המשמש עבור פרוטוקול זה מכיל guanidinium thiocyanate (GITC) של חומרים פעילי שטח ללא יונית, שהינם חומרים מגרים. לקחת אמצעי בטיחות מעבדה המתאים ברדס זרימה ושימוש ללבוש כפפות בעת טיפול זה. הימנע כל העור, קשר עין. אם המאגר ישפך, השטח מזוהמים חייב לא להיות נקיים ישירות עם כלורמין או נתרן תת-כלורי (המרכיבים הפעילים ב "אקונומיקה") כי תערובת זו עלול להוביל להיווצרות של ציאניד רעיל ראשית, נגב המאגר שנשפך עם רקמת סופג. בשלב הבא, לנקות את השטח עם אתנול 70% ולאחר מכן עם מים, ולהשתמש בסופו של דבר, כלורמין או נתרן תת-כלורי.
- כדי להכין את שפופרות ואקום של איסוף הדם, להזריק 1.6 מ של המאגר פירוק מסחריים ספציפיים לתוך שפופרת ואקום EDTA מ"ל 4 מאת ניקב את המכסה של הצינור באמצעות מחט 25 G x 1 ומזרק 3 מ.
הערה: אינם מסירים את המכסה של שפופרת הואקום. שואב האבק חייבת להישמר. - אחסן את שפופרות ואקום המכיל מאגר בטמפרטורת החדר עד השימוש.
הערה: הצינורות יציבים לפחות שנה אחת לאחר ההכנה שלהם.
2. הכנה של מאגרי לחילוץ נה
- כדי להכין את מאגרי לחילוץ נה, במקום 1.8 שני mL, mL 4.5 שני, וצינורות 3.6 mL אחד בארון תקשורת.
- להוסיף, באמצעות pipetting, 960 µL של חלקיקים מגנטיים זכוכית (MGPs) צינור נקי mL 1.8 ו תווית עם MGPs. Resuspend את המתלים MGP לחלוטין לפני pipetting זה.
הערה: MGPs נוטים לאסוף במהירות בתחתית הצינורית. - להוסיף, על-ידי pipetting, 4 מ של שטיפת מאגר אני אל צינור נקי 4.5 מ ל, באותיות WB-1.
התראה: לשטוף מאגר I מכילה guanidinium כלוריד, וזה מגרה. לקחת אמצעי בטיחות מעבדה המתאים ברדס זרימה ושימוש ללבוש כפפות בעת טיפול זה. הימנע כל העור, קשר עין. - להוסיף, על-ידי pipetting, mL 1.5 שטיפת המאגר השני אל צינור נקי mL 3.6, באותיות WB-2.
- להוסיף, על-ידי pipetting, 3 מ של שטיפת מאגר השלישי כדי צינור נקי 4.5 מ עם מדבקה. כמו WB-3.
- להוסיף, מאת pipetting, µL 100 • תנאי המאגר כדי צינור נקי mL 1.8 עם מדבקה. כמו EB.
- לאחסן המאגרים aliquoted בטמפרטורת החדר עד השימוש.
הערה: הצינורות יציבים עבור חודש אחד לפחות לאחר ההכנה שלהם.
3. איסוף דם מחולים עם סימנים ותסמינים להידבקות בווירוס
התראה: לקחת אמצעי בטיחות מעבדה המתאימה בעת איסוף דם מן המטופל. ללבוש כפפות ומשקפיים. אם החולה בבידוד, אנא עקוב אחר הליכי אבטחה רמה 4.
- כדי לאסוף תוך ורידי דם מן המטופל, השתמש מחט פרפר עם סיומת small-bore צינורות, שפופרת ואקום אוסף דם המכיל מאגר פירוק/איגוד. לנוח היד של המטופל בעמדה כלפי מטה ומקם את הצינור אוסף נמוך יותר מאשר המחט פרפר. את המחט פרפר לווריד של המטופל ולצרף את אוסף דם בצינור הסיומת small-bore.
הערה: פעולה זו תמנע זרימה חזרה. - אחרי האוסף דם, מערבבים את התוכן של הצינור על ידי flipping הצינור 5 - 10 פעמים.
הערה: בשל הוואקום שנותרו בצינור אוסף דם המכיל mL 1.6 פירוק/איגוד המאגר, היקף המדגם שנאספו באופן אוטומטי יהיה מ ל 1.6. - לחטא החיצוני של הצינור באמצעות אתנול 70%.
- דגירה של הצינורות עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול פה, ניתן לאחסן את צינורות איסוף דם מלאה ב-20 ° C, 5 ° C, 25 ° C או 37 ° C בחודש לפחות 17. - ממשיכים ישירות השיטה פשוטה של מיצוי נה.
4. פשוטה נה החילוץ של הדם כולו
- לטהר נה מהדם פירוק/איגוד להשבית מאגר שנאספו, לערבב התוכן של הצינור על ידי flipping הוואקום צינור ביד x 5-10.
- הסר את המכסה של הצינור בקפידה, לשחרר את המכסה.
- שופכים את aliquot מוכן של MGPs (1 מ"ל) ישירות לתוך הצינור איסוף דם.
- במקום מכסה חדש מהצינור אוסף דם בשימוש על הצינור המכיל את הדגימה.
- מניחים אצבע על המכסה כדי להבטיח כי הצינור סגורה בחוזקה ומערבבים את התוכן של הצינור על ידי flipping הצינור אוסף דם ביד 5 - 10 פעמים.
- הכנס את הצינור מחזיק מגנטי ולשמור אצבע על המכסה כדי להבטיח שהצינור נסגר בחוזקה.
- להעיף את מחזיק מגנטי עם הצינור כמה פעמים ביד כדי לוודא כי כל MGPs נאספים בצד של הצינור עם המגנט.
הערה: מחזיק מגנטי יכול להיות מוחלף עם מגנט מוארך, גומייה. - הסר את המכסה של הצינור ולמחוק את התוכן של הצינור באמצעות פיפטה חד פעמיות או פשוט על-ידי יציקת התוכן לתוך צינור אוסף 50 מ.
הערה: להימנע אירוסולים מהצינור אוסף 50 מ על-ידי סגירת הצינור עם מכסה. - שופכים את aliquot מוכן של WB-1 (4 מ ל) ישירות לתוך הצינור אוסף דם.
- מקם את המכסה על המרקע ומניחים אצבע על המכסה כדי להבטיח שהצינור נסגר בחוזקה.
- הסר את הצינור מחזיק מגנטי, לשמור את המכסה הידק בבטחה עם האצבע.
הערה: אם באמצעות מגנט גומייה, פשוט להסיר את הגומייה מגנט מהצינור. - Resuspend את MGPs על ידי flipping הצינור אוסף דם ביד 5 - 10 פעמים.
- חזור על שלבים 4.6-4.8.
- שופכים את aliquot מוכן של WB-2 (1.5 מ"ל) ישירות לתוך הצינור אוסף דם.
- מקם את המכסה על המרקע ולהסיר את הצינור ממחזיק מגנטי.
הערה: אם באמצעות מגנט גומייה, פשוט להסיר את הגומייה מגנט מהצינור. - מניחים אצבע על המכסה כדי להבטיח שהצינור נסגר בחוזקה.
- Resuspend את MGPs על ידי flipping הצינור אוסף דם למשך כמה שניות בעבודת יד.
- חזור על שלב 4.6-4.8.
- שופכים את aliquot מוכן של WB-3 (3 מ"ל) ישירות לתוך הצינור אוסף דם.
- מקם את המכסה על המרקע ולהסיר את הצינור ממחזיק מגנטי.
הערה: אם באמצעות מגנט גומייה, פשוט להסיר את הגומייה מגנט מהצינור. - מניחים אצבע על המכסה כדי להבטיח שהצינור נסגר בחוזקה.
- Resuspend את MGPs על ידי flipping הצינור אוסף דם ביד 5 - 10 פעמים.
- חזור על שלבים 4.6-4.8.
- שופכים את aliquot מוכן של EB (100 µL) ישירות לתוך הצינור אוסף דם.
- מקם את המכסה על המרקע ולהסיר את הצינור ממחזיק מגנטי.
הערה: אם באמצעות מגנט גומייה, פשוט להסיר את הגומייה מגנט מהצינור. - Resuspend את MGPs ב EB על-ידי הקשה הצינור אוסף דם 5 - 10 פעמים עם האצבע.
הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן, ואת הצינורות שניתן לאחסן ב-20 ° C. - העברה droplet אחד (5-8 µL) של MGPs resuspended המיקס במורד הזרם של התגובה הגברה נה באמצעות פיפטה חד פעמיות של 1.5 mL (הגברה נה במורד הזרם בכל אבחון assay כגון מנורה/RT-מנורה או מבחני qPCR/RT-qPCR יכול לשמש).
הערה: NAs לדבוק MGPs, כדי להיות בטוח לשימוש MGPs את התגובה הגברה נה במורד הזרם. מערבבים את המתלים MGP לפני השימוש. לאחר ערבוב, תאסוף MGPs בחלק התחתון של הצינור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול המובאת כאן פשוט ויעיל, ניתן להחיל באופן כללי על כל assay מולקולרית שיש לבצע על דגימות דם מלא זיהומיות לא פעיל עם המאגר פירוק/איגוד. שזרימת הדם איון ו נה החילוץ מוצג באיור 1, לרבות הכנת דם אוסף שפופרות ואקום7 (איור 1 א'), אוסף דם7 (איור 1B), החילוץ NA ( 1C דמויות - 1 H), וניתוח במורד הזרם NA (איור 1I).
עקב פרוטוקול החילוץ נה פשוטה, MGPs לא יוסרו מן השלב • תנאי ו לכן NAs נוטים לדבוק MGPs. כל ניתוח מולקולרית במורד הזרם, כגון qPCR או ניתוח המנורה, חייב להתבצע ישירות על MGPs (איור 1I ו איור 2) על מנת להבטיח תוצאה חיובית.
שיטת החילוץ NA היא דגימות דם כל יעיל, ו RNA או DNA-וירוס-חיובי עם המון נגיפי נמוך ככל 130-3,000 עותקים/mL ניתן לחלץ וניתח באמצעות qPCR או RT-qPCR (איור 3).
באמצעות שיטת החילוץ נה, מנורה או RT-המנורה מונחת הסוללה איזותרמי מכשיר נייד עבור דגימות דם כל וירוס-חיובית, ניתן לקבל אבחון בתוך 40 דקות מאוסף הדם (איור 4).
איור 1 : זרימת עבודה לחילוץ נה מפושטת של דגימות דם. (א) הכנת שפירוק/איגוד מאגר הדם ואקום האוסף מנורות באמצעות מחט ומזרק. (B) לאסוף הדם באמצעות מחט פרפר. (ג) מקום ברכבת התחתית אוסף דם בבעל, להסיר את המכסה, ויוצקים את MGPs לתוך הצינור. (D) סגור את הצינור עם מכסה חדש, לערבב את התוכן על ידי היפוך הצינורית ביד. (E) לאסוף MGPs בצד הצינור אוסף דם על ידי flipping הצינורית בתוך מחזיק מגנטי. (F) להסיר תגובת שיקוע באמצעות פיפטה חד פעמיות. (G) שופכים המאגרים לשטוף או • תנאי ישירות לתוך הצינור איסוף דם וחזור הפעולות המוצג בחלוניות D - F. (H) לוח זה מראה את MGPs מוכן לשימוש ישיר ב- qPCR, התגובה RT-qPCR, מנורה או RT-המנורה. (אני) העברה אחת droplet (5-8 µL) של MGPs על צינור התגובה PCR או המנורה באמצעות פיפטה חד פעמיות של 1.5 mL. פאנל A ו- B: דמות זו שונתה מ. Rosenstierne et al. 7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : NA זיהוי של דגימות דם כל וירוס-חיוביות 28 חילוץ באמצעות השיטה פשוטה של מיצוי נה. דם מלא דוגמאות שלילי שנבדקו (1.6 מ"ל) עבור וירוס היו מתובל או DNA-וירוס [וירוס אפשטיין בר (EBV) (2.0 x 104 - 1.0 x 103 עותקים/mL)] או של RNA-וירוס [וירוס הפטיטיס C (בזכות) (6.0 x 105 - 3.0 x 103 עותקים/mL)] או וירוס דנגה (DENV) (1.7 x 108 - 1.7 x 106 עותקים/mL). NAs חולצו באמצעות השיטה המתוארת לעיל, NAs שחולצו נותחו ב כפולים על-ידי ספציפי qPCR ללא צורך במיקור חוץ, RT-PCR, מנורה או RT-המנורה, עם או בלי MGPs. ה- x-ציר = שיטת זיהוי נה, y-ציר = אחוז הדגימות החיוביות qPCR/המנורה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : רגישות של השיטה פשוטה של מיצוי נה. עבור הוכחת הרעיון של השיטה, וירוס סוג דם כל היה מתובל ההכנות RNA או DNA וירוס שונים המכילים עומס נגיפי מוגדרים, NAs חולצו באמצעות שיטת החילוץ נה מפושטת. (א) כל סוג דם (1.4 מ"ל) היה מתובל µL 200 של דילולים 10-fold של תקן EBOV מוכן למטרות אבחון (ENIVD), אשר הוכנה מן ההתפרצות האחרונה Guéckédou/גינאה (2.0 x 106 עותקים/mL). NAs שחולצו נותחו ב כפולים על-ידי EBOV ספציפיים RT-qPCR ללא צורך במיקור חוץ7 באמצעות הצנטרפוגה התרמיים של MX3005P. (B) דם (1.2 מ"ל) היה מתובל µL 400 של דילולים 10-fold של בזכות מי סרום מתוקננת מספקת דוגמה (1.2 x 106 IU/mL). NAs שחולצו נותחו ב כפולים על-ידי ללא צורך במיקור חוץ בזכות ספציפיים RT-qPCR באמצעות הצנטרפוגה התרמיים של MX3005P. (ג) דם (1.2 מ"ל) היה מתובל µL 400 של ריכוזים שונים של EBV (2.0 x 104 עותקים/mL, 8.0 x 103 עותקים/mL, 2.7 x 103 עותקים/mL ו- 9.3 x 102 עותקים/mL). NAs שחולצו נותחו ב כפילויות על ידי qPCR EBV ספציפי ללא צורך במיקור חוץ. דם מלא (D) (1.2 מ"ל) היה מתובל µL 400 של דילולים 10-fold של וירוס BK (1.3 x 104 עותקים/mL). NAs שחולצו נותחו ב כפולים על-ידי qPCR BK ספציפי ללא צורך במיקור חוץ. ה- x-ציר = הריכוז הסופי של וירוס במדגם מחודדים דם (עותקים/mL או IU/mL), y-ציר = ערך Ct (זאת אומרת ± SD). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : פשוטה החילוץ נה ו RT-מנורה או המנורה באמצעות מכשיר נייד איזותרמי. (א) בשל חוסר EBOV-חיוביות דגימות דם כל המחלקה של וירוס & מיקרוביולוגית אבחון מיוחד, סטטנס סרום אינסטיטוט, דנמרק, 1.4 מ של דם מלא שלילית היה מתובל µL 200 של דילולים שונים של EBOV תקן שהוכנו למטרות אבחון (ENIVD). הדגימות מחודדים עברה הוצאה נה באמצעות שיטת החילוץ נה מפושטת, נותחו על ידי לתגובה ספציפית EBOV RT-המנורה. כפקד שלילי, נכללה דגימת דם שלילי. ה- x-ציר = הריכוז הסופי של EBOV במדגם מחודדים דם (עותקים/mL), y-ציר = את דקות לחיובי. (B) עבור הוכחת הרעיון, דם (1.6 מ ל) aliquots מחולים 7, שאובחנו חיובי עבור EBV (13,000-500 עותקים/mL) המחלקה של וירוס & מיקרוביולוגית אבחון מיוחד, סטטנס סרום אינסטיטוט, דנמרק, עברה של NA חילוץ באמצעות שיטת החילוץ נה מפושטת, נותחו על ידי לתגובה ספציפית EBV המנורה באמצעות מונחה הסוללה ג'יני II איזותרמי המכשיר הנייד. כפקד שלילי, נכלל מדגם פרוו B19-חיוביות. ה- x-ציר = עומס נגיפי של EBV במדגם החולה (עותקים/mL), y-ציר = את דקות לחיובי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בדו ח זה, אנו מתארים פשוטה, מהירה ובטוחה ידנית המיטה נה החילוץ שיטת זיהוי מולקולרי במורד הזרם של נגיף בדם כל פירוק/איגוד להשבית-מאגר. שיטת החילוץ נה שתואר פותחה כדי להתבצע ישירות על דגימות דם נאסף הדם ואקום צינורות אוסף המכיל את פירוק/איגוד מאגר (טבלה של חומרים)7. מאגר ספציפי חלבונית EBOV7 , הוא המרכיב הקריטי בשיטה. אחרי האוסף דם, אנו ממליצים המקננת הצינור לפחות 20 דקות7 על מנת להבטיח של איון מוחלט של המדגם. איון EBOV המיטה מבטלת את הצורך בטיפול דוגמיות EBOV-חיובית בתנאים קפדניים הבלימה, כגון תנאי BSL-4, ומאפשר את הדוגמאות כדי להתנהל בתנאים רגילים BSL-2. סביר כי אחרים פתוגנים ארבע קבוצת סיכון, כגון הווירוס לאסה וירוס מרבורג, הנגיף שפעת קונגו קרים גם מומת על ידי מאגר זה, אבל זה נשאר יוצג.
שיטת החילוץ נה שתואר פותחה כדי לבצע ליד מטופל במחלקה בידוד בבית החולים או בבית חולים שדה ודורש, לכן, אין ציוד מעבדה, כגון צנטריפוגות, חימום בלוקים או חשמל. כל שיטת החילוץ נה דורש הם הצינורות המכילים אמצעי אחסון קבוע של MGPs או שטיפת מאגרים, מחזיק מגנטי פיפטות חד פעמיות. הכנה מראש של הצינורות המכילים מאגרי מפשט את הפרוטוקול מכיוון שהוא מבטל את הצורך פיפטות, במקום זאת, הם שפכו המאגרים aliquoted ישירות לתוך הצינורות מדגם. מחזיק מגנטי יתפוס את MGPs המכילים NA, ומתווך טיפול קל של המדרגות לשטוף. מחזיק מגנטי הרבה למגנט רגיל, גומייה במקרה מחזיק מגנטי אינו זמין; עם זאת, מחזיק מגנטי מפחיתה את הסיכון על הידיים להפיל את הצינור ונשפך התוכן בשעת החלת את המגנט ואת הגומייה. בגלל צמיגות של המדגם לא פעיל-מאגר דם פירוק/איגוד, פיפטות חד פעמיות משמשים כדי להסיר את המאגרים תגובת שיקוע/נוזל/שטיפת מהצינור. פיפטות חד פעמיות יכול להיות מוחלף על ידי ישירה שוטף של התכנים מהצינור לתוך צינור ומפקחת, אבל שימו לב לא כדי ליצור כל טיפות בחוץ. אם טיפות נוצרים, השטח מזוהמים חייב לא להיות נקיים ישירות עם כלורמין או נתרן תת-כלורי (המרכיבים הפעילים ב "אקונומיקה") כי תערובת זו עלול להוביל להיווצרות של ציאניד רעיל לכן, אם נשפך קודם, מנגבת את השפכים ברקמות ספיגה. בשלב הבא, לנקות את השטח עם אתנול 70% ולאחר מכן עם הרבה מים, ולהשתמש בסופו של דבר, כלורמין או נתרן תת-כלורי. זה כולל כל הפסולת אשר בא במגע עם המאגר פירוק/איגוד (כולל הצינור ומפקחת על פיפטות חד פעמיות). במקום זאת, לאסוף את כל הפסולת במיכל אשפה נפרד, רק לחטא החיצוני של המכולה עם 70% אתנול.
NAs הם בדרך כלל eluted מן MGPs במהלך שלב חימום, אך שלב זה חימום הוסר בפרוטוקול מפושטת נה החילוץ לבטל את השימוש של חשמל וציוד. לכן, NAs נוטים לדבוק MGPs, אשר, לכן, יש להוסיף וזמינותו זיהוי נה במורד הזרם לצורך זיהוי חיובי NA. MGPs מועברים לתערובת התגובה במורד הזרם באמצעות droplet אחד מן פיפטה חד פעמיות 1.5 mL. תוספת זו אינה בדיוק. כפי התוספת נורמלי באמצעות פיפטה עצה של פין; עם זאת, התוספת unprecise של נה/MGPs המנורה, תערובת התגובה RT-המנורה, qPCR או RT-qPCR לא לעכב את התגובה או להשפיע על האות זריחה ב- assay האבחון שלנו ללא צורך במיקור חוץ. בכל זאת, זה עשוי להיות שונה assay assay, אנו ממליצים כי כל בדיקה נה במורד הזרם מאומת, כי הרגישות של וזמינותו נבדק באמצעות שיטת החילוץ נה מפושטת. שיטת החילוץ NA היא יחסית רגיש, דגימות דם מלא המכיל של DNA או RNA וירוס נמוך כמו 3,000 עותקים/mL יכול בקלות להיות חילוץ, זוהה בבדיקות מולקולריות במורד הזרם, כגון qPCR. המטען הנגיפי בדגימות קליניות הוא בדרך כלל גבוה מאוד בשלב אקוטי של דלקת, וירוסים שפעת, כגון EBOV לאסה וירוס, וירוס שפעת קרים קונגו, בדרך כלל להכיל יותר מ- 105 עותקים/mL9 ,10,11. לכן, וירוסים בדגימות אלה ניתן בקלות להבחין בשיטה זו החילוץ נה. עם זאת, איון MPLB של וירוסים שאינם7EBOV, Vaccinia או אבעבועות הפרות וירוס8 נותר יוצג.
השיטה פשוטה של מיצוי נה יכולה להתבצע במחלקות בידוד חולים או הגדרות שדה, והוא אידיאלי עבור אבחון מולקולרי בשלב של טיפול. עם זאת, השיטה אינה ישימה עבור תפוקה גבוהה נה עקירות עקב הטיפול תרגולים צינור פתוח. אם נדרשים תפוקה גבוהה נה עקירות, דגימות דם מלא מוחלש בקלות יטוהר באמצעות נה החילוץ רובוטים7. חיסרון נוסף הוא הטיפול של ריאגנטים מזיקים כגון פירוק/איגוד מאגר [20-30% פוליאתילן גליקול p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl אתר ו- 30-50% guanidinium thiocyanate (GITC)]17 ו שטיפת המאגר אני (30-50% guanidinium כלוריד)17 צינור פתוח מחוץ ברדס זרימה. המאגר פירוק/איגוד בצורה מרוכזת נכלל בתוך שפופרת הואקום, עם האוסף של דם 1:1 (v/v), הריכוז מופחתת לפני פתיחת השפופרת. הפתיחה של שפופרת הואקום, הוספה/הסרת MGPs או שטיפת המאגר מתבצע תוך כמה שניות, לפיכך, הסיכון של שאיפה של אירוסולים הוא מינימלי. לאחר הסרת מאגר שטיפת-אני, ברכבת התחתית אין ריאגנטים מזיקים אחרים נעשה שימוש בפרוטוקול.
בדיקות מולקולריות בשלב של טיפול והתקנים רבים פותחו מאז ההתפרצות EBOV 20133,6,12,13,14,15,16 . עם זאת, רבים של בדיקות אלה עדיין דורשים טיפול למעלה-stream של זיהומיות ארונות אבטחה BSL-3 גשמי, ובבית של מינימום, ציוד, כגון פיפטות, צנטריפוגות, ואת רחובות חימום או חשמל. השימוש של אבטחה ארונות מסבך ומאריך את אבחנה מהירה. איון שתואר וירוס המיטה עם אוסף ישירה של דם לתוך הצינורות איון וירוס בשילוב עם שיטת החילוץ נה מפושטת מבטל את הצורך עבור אבטחה ארונות חשמל, מתקני המעבדה. בנוסף, כי השיטה פשוטה של מיצוי נה ניתן לבצע ליד החולה, בשילוב עם תגובת המנורה התקן נייד איזותרמי מונחה סוללה, ניתן לקבל אבחנה מולקולרית המיטה בטוח בתוך 40 דקות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים Susanne מרגריטה לופס רסמוסן וג'נסן Kolbjørn Solvej לסיוע טכני שלהם ועל לטיפול הדגימות קליניים. פרויקט זה הוא חלק. האיחוד EbolaMoDRAD, אשר קיבלה מימון חדשני רפואה היוזמה 2 Joint Undertaking תחת גרנט הסכם N ° 115843. זה Joint Undertaking מקבל תמיכה המחקר של האיחוד האירופי אופק 2020, ותוכנית חדשנות EFPIA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL) | Becton Dickinson | 368861 | |
| Plus Blood Collection | Becton Dickinson | 362725 | |
| 23G x 1 needle | Becton Dickinson | 300800 | |
| LUER LOK syringe (3 mL) | Becton Dickinson | 309658 | |
| Butterfly needle with small-bore extension tubing | Jørgen Kruuse A/S | 121714 | |
| 1% Virkon | Nomeco A/S | 849265 | |
| MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lysis/Binding Buffer - Refill | Roche Diagnostics A/S | 03246752001 | |
| MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit | Roche Diagnostics A/S | 3038505001 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL) | Thermo Fisher Scientific | 375418 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379189 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379146 | |
| DynaMag™-5 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Thermo Scientific™ Samco™ Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 231 | |
| Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 |
References
- Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).
- Benzine, J. W., Brown, K. M., et al. Molecular Diagnostic Field Test for Point-of-Care Detection of Ebola Virus Directly from Blood. Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 3), S234-S242 (2016).
- Faye, O., Faye, O., et al. Development and deployment of a rapid recombinase polymerase amplification Ebola virus detection assay in Guinea in 2015. Euro Surveillance. 20 (44), 10-18 (2015).
- Yang, M., Ke, Y., et al. Development and Evaluation of a Rapid and Sensitive EBOV-RPA Test for Rapid Diagnosis of Ebola Virus Disease. Scientific Reports. 6, (2016).
- Smither, S. J., Weller, S. A., et al. Buffer AVL alone does not inactivate Ebola virus in a representative clinical sample type. Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3148-3154 (2015).
- Byrnes, S., Fan, A., et al. A Portable, Pressure Driven, Room Temperature Nucleic Acid Extraction and Storage System for Point of Care Molecular Diagnostics. Analytical Methods. 5 (13), 3177-3184 (2013).
- Rosenstierne, M. W., Karlberg, H., et al. Rapid bedside inactivation of Ebola virus for safe nucleic acid tests. Journal of Clinical Microbiology. 54 (10), 2521-2529 (2016).
- Vinner, L., Fomsgaard, A. Inactivation of orthopoxvirus for diagnostic PCR analysis. Journal of Virological Methods. 146, 401-404 (2007).
- Schmitz, H., Köhler, B., et al. Monitoring of clinical and laboratory data in two cases of imported Lassa fever. Microbes and Infection. 4 (1), 43-50 (2002).
- De La Vega, M. A., Caleo, G., et al. Ebola viral load at diagnosis associates with patient outcome and outbreak evolution. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4421-4428 (2015).
- Hasanoglu, I., Guner, R., et al. Dynamics of viral load in Crimean Congo hemorrhagic fever. Journal of Medical Virology. 90 (4), 639-643 (2017).
- Biava, M., Colavita, F., et al. Evaluation of a rapid and sensitive RT-qPCR assay for the detection of Ebola Virus. Journal of Virological Methods. 252, 70-74 (2018).
- Fernández-Carballo, B. L., McBeth, C., et al. Continuous-flow, microfluidic, qRT-PCR system for RNA virus detection. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (1), 33-43 (2017).
- Weller, S. A., Bailey, D., et al. Evaluation of the Biofire FilmArray Biothreat E-test (v2.5) for rapid identification of Ebola virus disease in heat-treated blood samples obtained in Sierra Leone and United Kingdom. Journal of Clinical Microbiology. 54 (1), 114-119 (2015).
- Semper, A. E., Broadhurst, M. J., et al. Performance of the GeneXpert Ebola Assay for Diagnosis of Ebola Virus Disease in Sierra Leone: A Field Evaluation Study. PLoS Medicine. 13 (3), e1001980 (2016).
- Biocartis. Instructions for Use: Idylla TM Ebola Virus Triage Test. , https://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/Safety/EmergencySituations/UCM503944.pdf (2016).
- MPLC. Total Nucleic Acid Isolation Kit. Safety data sheet version 1.7. , https://pim-eservices.roche.com/DownloadDocument/SDS/DE/en/03038505001 (2015).
