Summary
यहां, हम वायरस से तेजी से वायरस न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद-निष्क्रिय पूरे खून । निष्कर्षण सीधे रक्त संग्रह ट्यूबों में किया जाता है और कोई उपकरण या बिजली की आवश्यकता है । विधि प्रयोगशाला सुविधाओं पर निर्भर नहीं है और कहीं भी इस्तेमाल किया जा सकता है (जैसे, क्षेत्र अस्पतालों में).
Abstract
एक संक्रमण के तेजी से निदान प्रकोप प्रबंधन, जोखिम में शामिल करने के लिए आवश्यक है, और रोगी की देखभाल । हम पहले सुरक्षित न्यूक्लिक एसिड के लिए रक्त नमूने के दौरान Ebola वायरस के तेजी से बेडसाइड निष्क्रियता के लिए एक विधि दिखाया है (ना) एक वाणिज्यिक lysis/बाइंडिंग बफर सीधे निर्वात रक्त संग्रह ट्यूबों में जोड़कर परीक्षण । इस बेडसाइड निष्क्रियण दृष्टिकोण का उपयोग कर, हम एक सुरक्षित, तेजी से विकसित किया है, और सरलीकृत बेडसाइड न निष्कर्षण विधि lysis/बाइंडिंग बफर-निष्क्रिय पूरे रक्त में एक वायरस के बाद का पता लगाने के लिए । ना निष्कर्षण सीधे रक्त संग्रह ट्यूबों में किया जाता है और कोई उपकरण या बिजली की आवश्यकता है ।
रक्त lysis/बाध्यकारी बफर में एकत्र किया जाता है के बाद, सामग्री हाथ से ट्यूब flipping द्वारा मिश्रित कर रहे हैं, और मिश्रण कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए तैयार है । चुंबकीय कांच के कणों (MGPs) ट्यूब करने के लिए जोड़ रहे हैं, और सामग्री हाथ से संग्रह ट्यूब flipping द्वारा मिश्रित कर रहे हैं । MGPs तो एक चुंबकीय धारक या एक चुंबक और एक रबर बैंड का उपयोग कर रक्त संग्रह ट्यूब की तरफ एकत्र कर रहे हैं । MGPs तीन बार धोया जाता है, और के बाद रेफरेंस बफर के अलावा सीधे संग्रह ट्यूब में, NAs ना परीक्षणों के लिए तैयार कर रहे हैं, जैसे qPCR या इज़ोटेर्माल पाश प्रवर्धन (चिराग), प्रतिक्रिया से MGPs को हटाने के बिना. ना निष्कर्षण विधि किसी भी प्रयोगशाला सुविधाओं पर निर्भर नहीं है और आसानी से कहीं भी इस्तेमाल किया जा सकता है (जैसे, क्षेत्र अस्पतालों और अस्पताल के आइसोलेशन वार्ड में). जब यह ना निष्कर्षण विधि दीपक और एक पोर्टेबल साधन के साथ संयुक्त है, एक निदान रक्त संग्रह के ४० मिनट के भीतर प्राप्त किया जा सकता है ।
Introduction
वायरस फैलने की स्थिति में, जब रोगियों को अस्पताल के आइसोलेशन वार्ड तक ही सीमित कर रहे हैं या जब एक तेजी से निदान की जरूरत है, एक सुरक्षित, सरल, और सटीक बात की देखभाल आणविक निदान रोगी देखभाल और जोखिम में शामिल करने के लिए आवश्यक है । दो हाल ही में वायरल प्रकोप, Ebola वायरस (इबोव एमआर) पश्चिम अफ्रीका में (२०१३) और दक्षिण अमेरिका (२०१५) में Zika वायरस, के सुधार बिंदु में रुचि बढ़ गई है देखभाल आणविक नैदानिक परीक्षणों, जैसे रिवर्स प्रतिलेखन पाश के रूप में मध्यस्थता इज़ोटेर्माल प्रवर्धन (भ-दीपक)१,२ आणि recombinase पोलीमरेज़ प्रवर्धन (RPA)३,४. दोनों RT-लैंप और RPA तेजी से संवेदनशील हैं, और विशिष्ट आणविक परीक्षण है कि सरलीकृत नमूना तैयारी पर किया जा सकता है । Zika वायरस के लिए, आरटी-दीपक एक पार्श्व प्रवाह परख (एलएफए) है, जो गैर में Zika वायरस का पता लगाने कर सकते है के साथ संयुक्त किया गया है 30 मिनट1के भीतर पूरे रक्त के नमूने शुद्ध; हालांकि, इबोव एमआर के लिए, जो एक जोखिम समूह के रूप में वर्गीकृत किया गया है 4 रोगज़नक़ और अत्यधिक संक्रामक है, नमूनों की जरूरत है के तहत संभाला जा करने के लिए एक उच्च सुरक्षा स्तर 4 (बीएसएल-4) शर्तों और निष्क्रिय से पहले किसी भी सुरक्षित नैदानिक प्रक्रियाओं किया जा सकता है ।
इबोव एमआर, जैसे नमूना2,3,4,5करने के लिए lysis बफ़र्स के अतिरिक्त के लिए सरलीकृत निष्क्रियकरण विधियों का प्रकोप के दौरान उपयोग किया गया; हालांकि, इन पद्धतियों बीएसएल-3 सुरक्षा अलमारियां, केंद्रापसारक, हीटिंग ब्लॉक, और पिपेट, एक ंयूनतम पर के रूप में प्रयोगशाला उपकरण, के साथ-4 शर्तों के तहत प्रबंधन की आवश्यकता है । यह उपकरण सामान्य रूप से आइसोलेशन वार्ड में या बाहर के फील्ड अस्पतालों में मौजूद नहीं है । इस चुनौती को दूर करने के लिए, प्रयास सूटकेस3में निदान करने के लिए किया गया है, और कई पोर्टेबल उपकरणों और मशीनों को विकसित किया गया है [जैसे, न्यूक्लिक एसिड (NA) निष्कर्षण के लिए एक पोर्टेबल डिवाइस]6। हालांकि, इबोव एमआर-धनात्मक नमूने अभी भी इन उपकरणों का उपयोग किया जा सकता से पहले निष्क्रिय किया जा करने के लिए की आवश्यकता है ।
हम पहले इबोव एमआर7, Vaccinia वायरस, और Cowpox वायरस8 के लिए एक रैपिड बेडसाइड वायरस निष्क्रियता विधि की सूचना दी है एक वाणिज्यिक lysis के अलावा/बाध्यकारी बफर साधारण वैक्यूम रक्त संग्रह ट्यूबों के लिए, प्रत्यक्ष के लिए अनुमति निष्क्रियता बफर7में रोगी से रक्त का हस्तांतरण । एक बंद व्यवस्था में यह प्रत्यक्ष और तत्काल निष्क्रियता बीएसएल-4 शर्तों7के रूप में किसी भी कठोर रोकथाम, का उपयोग कर नमूनों से निपटने की जरूरत खत्म हो जाती है, और नमूनों सामान्य बीएसएल-2 शर्तों के तहत संचालित किया जा सकता है । इस निष्क्रियण विधि कई ना निष्कर्षण प्रणालियों के साथ संगत है, जैसे रोबोट और हाथ शुद्धि किट7; हालांकि, इन पद्धतियों की आवश्यकता है प्रयोगशाला उपकरण, जैसे रोबोट, केंद्रापसारक, और बिजली, जो हमेशा क्षेत्र सेटिंग्स या अंदर अस्पताल के आइसोलेशन वार्ड में मौजूद नहीं हैं ।
इस रिपोर्ट में, हम वर्णन एक सुरक्षित, तेजी से, और सरल मैनुअल न निष्कर्षण विधि lysis/बाध्यकारी बफर-निष्क्रिय पूरे रक्त में एक वायरस के बाद आणविक पता लगाने के लिए । ना निष्कर्षण विधि किसी भी एक चुंबक के अलावा अंय उपकरणों की आवश्यकता नहीं है/ कोई केंद्रापसारक, हीटिंग ब्लॉक, या बिजली ना निष्कर्षण के लिए आवश्यक हैं । इसलिए, इस विधि प्रयोगशाला सुविधाओं पर निर्भर नहीं है और आसानी से कहीं भी इस्तेमाल किया जा सकता है (जैसे, क्षेत्र अस्पतालों में, अस्पताल के आइसोलेशन वार्ड में, या कम संसाधन सेटिंग्स के साथ). ना निष्कर्षण विधि तेजी से और सरल है और किसी भी बहाव ना परीक्षणों में सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है, ऐसे qPCR के रूप में, आर टी-qPCR, दीपक, या आर टी दीपक । जब यह ना निष्कर्षण विधि दीपक और एक पोर्टेबल बैटरी चालित इज़ोटेर्माल साधन के साथ संयुक्त है, एक बेडसाइड निदान रक्त संग्रह के ४० मिनट के भीतर प्राप्त किया जा सकता है ।
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Protocol
जैव चिकित्सा अनुसंधान नैतिकता, पूंजी क्षेत्र पर समिति ने सूचित सहमति दे दी है, और सभी तरीकों यहां वर्णित नैतिक समिति प्रणाली द्वारा एक समीक्षा से छूट दी गई है, परख विकास परियोजनाओं पर डेनिश कानून के अनुसार ।
1. वायरस निष्क्रियता और तेजी से न निष्कर्षण के लिए रक्त संग्रह वैक्यूम ट्यूबों की तैयारी
चेतावनी: इस प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल किया बफर guanidinium thiocyanate (GITC) और एक गैर ईओण surfactant, जो अड़चन है शामिल हैं । उचित प्रयोगशाला सुरक्षा उपायों ले लो, एक प्रवाह हुड का उपयोग करें, और दस्ताने पहनते है जब यह हैंडलिंग । किसी भी त्वचा और आंख के संपर्क से बचें । अगर बफर गिरा दिया है, दूषित सतह chloramine या सोडियम हाइपोक्लोराइट ("ब्लीच" में सक्रिय तत्व) के साथ सीधे संक्रमित नहीं होना चाहिए, क्योंकि इस मिश्रण विषाक्त साइनाइड के गठन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । सबसे पहले, शोषक ऊतक के साथ गिरा बफर पोंछ । अगले, ७०% इथेनॉल के साथ सतह साफ और फिर पानी के साथ, और अंत में, chloramine या सोडियम हाइपोक्लोराइट का उपयोग करें ।
- रक्त संग्रह वैक्यूम ट्यूबों तैयार करने के लिए, एक 25 ग्राम x 1 सुई और एक 3 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर ट्यूब के ढक्कन puncturing द्वारा एक 4 मिलीलीटर EDTA वैक्यूम ट्यूब में विशिष्ट वाणिज्यिक lysis बफर के १.६ मिलीलीटर सुई ।
नोट: वैक्यूम ट्यूब के ढक्कन न निकालें । वैक्यूम बनाए रखा जाना चाहिए । - वैक्यूम ट्यूब कमरे के तापमान पर बफर युक्त उपयोग जब तक स्टोर ।
नोट: ट्यूबों अपनी तैयारी के बाद कम से कम 1 साल के लिए स्थिर हैं ।
2. न निष्कर्षण के लिए बफ़र्स की तैयारी
- एक ना निष्कर्षण के लिए बफ़र्स तैयार करने के लिए, दो १.८ मिलीलीटर, दो ४.५ मिलीलीटर, और एक रैक में एक ३.६ मिलीलीटर ट्यूबों रखें ।
- जोड़ें, pipetting द्वारा, चुंबकीय ग्लास कणों की ९६० µ एल (एक साफ १.८ एमएल ट्यूब करने के लिए MGPs) और यह MGPs के साथ लेबल । एमजीपी निलंबन से पहले ही पूरी तरह से उसे निलंबित कर देना.
नोट: MGPs जल्दी ट्यूब के तल पर इकट्ठा करते हैं । - जोड़ें, pipetting द्वारा, धो के 4 मिलीलीटर बफर मैं एक साफ ४.५ एमएल ट्यूब करने के लिए और यह पश्चिम बंगाल के रूप में लेबल-1 ।
चेतावनी: धो बफर मैं guanidinium क्लोराइड, जो अड़चन है शामिल हैं । उचित प्रयोगशाला सुरक्षा उपायों ले लो, एक प्रवाह हुड का उपयोग करें, और दस्ताने पहनते है जब यह हैंडलिंग । किसी भी त्वचा और आंख के संपर्क से बचें । - जोड़ें, द्वारा pipetting, १.५ मिलीलीटर धोने बफर द्वितीय के एक साफ ३.६ एमएल ट्यूब और यह पश्चिम बंगाल के रूप में लेबल-2 ।
- जोड़ें, pipetting द्वारा, 3 मिलीलीटर धोने बफर III के लिए एक साफ ४.५ मिलीलीटर ट्यूब और यह पश्चिम बंगाल के रूप में लेबल-3 ।
- जोड़ने के लिए, pipetting द्वारा, १०० µ एल रेफरेंस बफर की एक साफ १.८ एमएल ट्यूब और लेबल के रूप में EB ।
- कमरे के तापमान पर aliquoted बफ़र्स का उपयोग करने तक संग्रहीत करें ।
नोट: ट्यूबों अपनी तैयारी के बाद कम से कम 1 महीने के लिए स्थिर हैं ।
3. लक्षण और एक वायरस के संक्रमण के लक्षण के साथ रोगियों से रक्त संग्रह
चेतावनी: रोगी से पूरे रक्त का संग्रह करते समय उचित प्रयोगशाला सुरक्षा उपाय लें । दस्ताने और चश्मे पहनें । यदि रोगी अलगाव में है, तो कृपया का पालन करें सुरक्षा स्तर 4 प्रक्रियाओं ।
- रोगी से नसों में पूरा खून इकट्ठा करने के लिए, छोटे बोर विस्तार टयूबिंग और एक रक्त संग्रह वैक्यूम ट्यूब एक lysis/बाइंडिंग बफर युक्त के साथ एक तितली सुई का उपयोग करें । एक नीचे की स्थिति और स्थिति में संग्रह ट्यूब तितली सुई से कम में रोगी की बांह आराम करो । रोगी की नस में तितली सुई डालें और छोटे बोर विस्तार करने के लिए रक्त संग्रह वैक्यूम ट्यूब संलग्न ।
नोट: यह वापस प्रवाह को रोकने जाएगा । - रक्त संग्रह के बाद ट्यूब की शुरआत करके ट्यूब की सामग्री को 5-10 बार मिलाएं ।
नोट: lysis/बाइंडिंग बफ़र की १.६ मिलीलीटर युक्त रक्त संग्रह ट्यूब में शेष निर्वात के कारण, एकत्र नमूने की मात्रा स्वचालित रूप से १.६ मिलीलीटर हो जाएगा । - ट्यूब के बाहर ७०% इथेनॉल का उपयोग कर संक्रमित ।
- कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए ट्यूब की मशीन ।
नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है और पूर्ण रक्त संग्रह ट्यूबों में संग्रहित किया जा सकता है-20 ° c, 5 ° c, 25 ° c या ३७ ° c के लिए 1 महीने में7. - सरलीकृत न निष्कर्षण पद्धति के लिए सीधे जारी रखें ।
4. पूरे खून की सरल न निष्कर्षण
- lysis/बाध्यकारी बफर से शुद्ध करने के लिए-निष्क्रिय एकत्र रक्त, हाथ से वैक्यूम ट्यूब flipping द्वारा ट्यूब की सामग्री मिश्रण 5-10x ।
- ट्यूब के ढक्कन को सावधानीपूर्वक निकालें और ढक्कन का निर्वहन करें ।
- MGPs के तैयार aliquot (1 मिलीलीटर) सीधे रक्त संग्रह ट्यूब में डालो ।
- नमूना युक्त ट्यूब पर एक अप्रयुक्त रक्त संग्रह ट्यूब से एक नया ढक्कन रखें ।
- यह सुनिश्चित करने के लिए कि ट्यूब कसकर बंद है और हाथ से 5-10 बार रक्त संग्रह ट्यूब flipping द्वारा ट्यूब की सामग्री मिश्रण को ढक्कन पर एक उंगली रखें ।
- ट्यूब को चुंबकीय धारक में लगाएं और ट्यूब को कसकर बंद करने के लिए ढक्कन पर एक उंगली रखें ।
- सभी MGPs ट्यूब के पक्ष में चुंबक के साथ एकत्र कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए हाथ से कई बार ट्यूब के साथ चुंबकीय धारक फ्लिप ।
नोट: चुंबकीय धारक एक लंबी चुंबक और एक रबर बैंड के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है । - ट्यूब के ढक्कन निकालें और या तो एक डिस्पोजेबल पिपेट का उपयोग करके या बस एक ५० मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में सामग्री डालने के द्वारा ट्यूब की सामग्री को त्यागें ।
नोट: एक ढक्कन के साथ ट्यूब बंद करके ५० मिलीलीटर संग्रह ट्यूब से एयरोसोल्स से बचें । - वाइड-1 (4 एमएल) के तैयार aliquot को सीधे ब्लड कलेक्शन ट्यूब में डालें ।
- ट्यूब पर ढक्कन प्लेस और ट्यूब कसकर बंद कर दिया है यह सुनिश्चित करने के लिए ढक्कन पर एक उंगली जगह है ।
- चुंबकीय धारक से ट्यूब निकालें, ढक्कन सुरक्षित रखने के एक उंगली से मजबूत ।
नोट: यदि एक चुंबक और एक रबर बैंड का उपयोग कर, बस रबर बैंड और ट्यूब से चुंबक हटा दें । - 5-10 बार हाथ से रक्त संग्रह ट्यूब flipping द्वारा MGPs reसस्पेंड ।
- दोहराएँ चरण ४.६-४.८.
- वाइड-2 (१.५ एमएल) के तैयार aliquot को सीधे ब्लड कलेक्शन ट्यूब में डालें ।
- ढक्कन को ट्यूब पर रखें और ट्यूब को चुंबकीय धारक से हटा दें ।
नोट: यदि एक चुंबक और एक रबर बैंड का उपयोग कर, बस रबर बैंड और ट्यूब से चुंबक हटा दें । - ढक्कन पर एक उंगली प्लेस सुनिश्चित करने के लिए ट्यूब कसकर बंद है ।
- हाथ से कुछ सेकंड के लिए रक्त संग्रह ट्यूब flipping द्वारा MGPs reसस्पेंड ।
- दोहराएँ चरण ४.६-४.८.
- वाइड-3 (3 एमएल) के तैयार aliquot को सीधे ब्लड कलेक्शन ट्यूब में डालें ।
- ढक्कन को ट्यूब पर रखें और ट्यूब को चुंबकीय धारक से हटा दें ।
नोट: यदि एक चुंबक और एक रबर बैंड का उपयोग कर, बस रबर बैंड और ट्यूब से चुंबक हटा दें । - ढक्कन पर एक उंगली प्लेस सुनिश्चित करने के लिए ट्यूब कसकर बंद है ।
- 5-10 बार हाथ से रक्त संग्रह ट्यूब flipping द्वारा MGPs reसस्पेंड ।
- दोहराएँ चरण ४.६-४.८.
- EB (१०० µ l) के तैयार aliquot को सीधे रक्त संग्रह ट्यूब में डाल दें ।
- ढक्कन को ट्यूब पर रखें और ट्यूब को चुंबकीय धारक से हटा दें ।
नोट: यदि एक चुंबक और एक रबर बैंड का उपयोग कर, बस रबर बैंड और ट्यूब से चुंबक हटा दें । - MGPs EB में रक्त संग्रह ट्यूब दोहन द्वारा 5-10 बार एक उंगली के साथ reसस्पेंड ।
नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है, और ट्यूबों-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है । - स्थानांतरण एक छोटी बूंद (5-8 µ एल) के बहाव ना प्रवर्धन प्रतिक्रिया मिश्रण एक १.५ मिलीलीटर प्रयोज्य पिपेट (किसी भी बहाव निदान ना प्रवर्धन परख जैसे दीपक/rt-चिराग या qPCR/rt-qPCR परख का उपयोग करने के लिए reसस्पैंड MGPs का इस्तेमाल किया जा सकता है) ।
नोट: NAs MGPs के लिए छड़ी, तो बहाव ना प्रवर्धन प्रतिक्रिया में MGPs का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित हो जाएगा । उपयोग करने से पहले एमजीपी सस्पेंशन को मिलाएं । मिश्रण के बाद, MGPs ट्यूब के नीचे जमा होगा ।
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Representative Results
प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत सरल और कुशल है और मोटे तौर पर किसी भी आणविक परख के लिए लागू किया जा सकता है संक्रामक पूरे रक्त lysis/बाध्यकारी बफर के साथ निष्क्रिय नमूनों पर प्रदर्शन किया जाएगा । रक्त निष्क्रियता और ना निष्कर्षण के लिए कार्यप्रवाह रक्त संग्रह वैक्यूम ट्यूबों7 (आंकड़ा 1a), रक्त संग्रह7 (आंकड़ा 1b), ना निष्कर्षण की तैयारी सहित 1 चित्रामें दिखाया गया है ( आंकड़े 1C -एक ज), और बहाव ना विश्लेषण (चित्रा 1I) ।
सरलीकृत ना निष्कर्षण प्रोटोकॉल के कारण, MGPs को रेफरेंस स्टेप से नहीं निकाला जाता है, और इसलिए, NAs MGPs से चिपके रहते हैं । किसी भी बहाव आणविक विश्लेषण, qPCR या दीपक विश्लेषण के रूप में, MGPs पर सीधे प्रदर्शन किया जाना चाहिए (चित्रा 1I और चित्रा 2) एक सकारात्मक परिणाम सुनिश्चित करने के लिए.
ना निष्कर्षण विधि कुशल है, और आरएनए-या डीएनए वायरस-सकारात्मक पूरे वायरल लोड के साथ रक्त के नमूनों के रूप में कम के रूप में १३०-३,००० प्रतियां/एमएल निकाला जा सकता है और या तो qPCR या RT-qPCR (चित्रा 3) का उपयोग कर विश्लेषण ।
ना निष्कर्षण विधि, दीपक या आरटी-लैंप, और एक पोर्टेबल बैटरी वायरस-सकारात्मक पूरे रक्त के नमूनों के लिए इज़ोटेर्माल डिवाइस चालित का उपयोग करना, एक निदान ४० के भीतर रक्त संग्रह से प्राप्त किया जा सकता है (चित्रा 4) ।
चित्रा 1 : के लिए कार्यप्रवाह सरलीकृत ना पूरे रक्त के नमूनों की निकासी । (क) एक सुई और एक सिरिंज का उपयोग कर lysis/बाइंडिंग बफर वैक्यूम रक्त संग्रह ट्यूब तैयार करें । (ख) एक तितली सुई का उपयोग कर रक्त इकट्ठा । (ग) एक धारक में रक्त संग्रह ट्यूब प्लेस, ढक्कन हटा दें, और MGPs ट्यूब में डाल दिया । (घ) एक नए ढक्कन के साथ ट्यूब बंद करो और हाथ से ट्यूब flipping द्वारा सामग्री मिश्रण । (ङ) चुंबकीय धारक में नलियों की शुरआत करते हुए रक्त संग्रह ट्यूब की ओर MGPs को एकत्र करना. (च) एक डिस्पोजेबल पिपेट का उपयोग कर supernatant निकालें । (छ) वॉश या रेफरेंस बफ़र्स सीधे रक्त संग्रह ट्यूब में डालना और पैनलों डी - एफमें दिखाए गए कार्यों को दोहराना । (ज) यह पैनल एक qPCR, rt-qPCR, लैंप, या आरटी-लैंप प्रतिक्रिया में प्रत्यक्ष उपयोग के लिए तैयार MGPs दिखाता है । (I) MGPs की एक छोटी बूंद (5-8 µ एल) एक पीसीआर या दीपक प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए एक १.५ मिलीलीटर डिस्पोजेबल पिपेट का उपयोग कर हस्तांतरण । पैनल ए और बी: यह आंकड़ा Rosenstierne एट अल से संशोधित किया गया है । 7. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 : ना 28 वायरस का पता लगाने-सकारात्मक पूरे रक्त नमूने सरलीकृत ना निष्कर्षण विधि का उपयोग कर निकाले । पूरे रक्त के नमूनों (१.६ मिलीलीटर) एक वायरस के लिए नकारात्मक परीक्षण या तो एक डीएनए वायरस के साथ नुकीला थे [Epstein-बर्र वायरस (EBV) (२.० x 104 -१.० x 103 प्रतियां/एमएल)] या एक आरएनए-वायरस [हेपेटाइटिस सी वायरस (HCV) (६.० x 105 -३.० x 103 प्रतियां/ या एक डेंगू वायरस (देंव) (१.७ x 108 -१.७ x 106 प्रतियां/ nas ऊपर वर्णित विधि का उपयोग कर निकाले गए थे, और निकाले NAs में विशिष्ट द्वारा डुप्लिकेट में विश्लेषण किया गया घर qPCR, आर टी-पीसीआर, दीपक, या आर टी दीपक, के साथ या MGPs के बिना । x-अक्ष = न डिटेक्शन पद्धति, y-अक्ष = qPCR/लैंप में धनात्मक नमूनों का प्रतिशत । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3 : सरलीकृत न निष्कर्षण विधि की संवेदनशीलता । विधि की अवधारणा का एक सबूत के लिए, वायरस नकारात्मक पूरे खून अलग आरएनए या डीएनए वायरस एक परिभाषित वायरल लोड युक्त तैयारी के साथ नुकीला था, और NAs सरलीकृत ना निष्कर्षण विधि का उपयोग कर निकाले गए थे । (एक) नकारात्मक पूरे रक्त (१.४ मिलीलीटर) Guéckédou/गिनी (२.० x 106 प्रतियां/एमएल) में हाल ही में प्रकोप से तैयार किया गया था, जो नैदानिक प्रयोजनों (ENIVD) के लिए तैयार इबोव एमआर मानक के 10 गुना कमजोर पड़ने के २०० µ एल के साथ नुकीला था । निकाले NAs एक में घर इबोव एमआर-विशिष्ट RT-qPCR7 एक MX3005P थर्मल साइकिल चालक का उपयोग करके डुप्लिकेट में विश्लेषण किया गया । (ख) पूरे रक्त (१.२ मिलीलीटर) एक HCV जो मानकीकृत सीरम नमूना (१.२ x 106 IU/एमएल) के 10 गुना कमजोर पड़ने के ४०० µ l के साथ नुकीला था । निकाले गए NAs एक में घर HCV-विशिष्ट RT-qPCR एक MX3005P थर्मल साइकिल चालक का उपयोग करके डुप्लिकेट में विश्लेषण किया गया । (ग) पूरे रक्त (१.२ मिलीलीटर) EBV के विभिन्न सांद्रता के ४०० µ l के साथ नुकीला था (२.० x 104 प्रतियां/एमएल, ८.० x 103 प्रतियां/एमएल, २.७ एक्स 103 प्रतियां/एमएल, और ९.३ एक्स 102 प्रतियां/ निकाले गए NAs में एक घर EBV-विशिष्ट qPCR द्वारा डुप्लिकेट में विश्लेषण किया गया । (घ) पूरे रक्त (१.२ मिलीलीटर) एक बीके वायरस (१.३ x 104 प्रतियां/एमएल) के 10 गुना कमजोर पड़ने के ४०० µ एल के साथ नुकीला था । निकाले गए NAs डुप्लिकेट में एक घर में बीके विशिष्ट qPCR द्वारा विश्लेषण किया गया । x-अक्ष = एक वायरस के अंतिम एकाग्रता में नुकीला पूरे रक्त का नमूना (प्रतियां/एमएल या IU/एमएल), y-अक्ष = सीटी-मान (मतलब ± एसडी) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 : सरलीकृत ना निष्कर्षण और आरटी-दीपक या दीपक एक पोर्टेबल इज़ोटेर्माल डिवाइस का उपयोग कर । (क) विषाणु एवं सूक्ष्मजीवविज्ञानी विशेष निदान विभाग में इबोव एमआर-पॉजीटिव पूरे रक्त के नमूनों की कमी के कारण, Statens सीरम Institut, डेनमार्क, १.४ मिलीलीटर का ऋणात्मक सारा रक्त इबोव एमआर के विभिन्ना कमजोरयों के २०० µ l के साथ नुकीला था नैदानिक प्रयोजनों के लिए तैयार मानक (ENIVD) । नुकीला नमूनों एक न निष्कर्षण सरलीकृत ना निष्कर्षण विधि का उपयोग कर चला गया और एक इबोव एमआर-विशिष्ट आर टी दीपक प्रतिक्रिया द्वारा विश्लेषण किया गया । एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, एक नकारात्मक पूरे रक्त का नमूना शामिल किया गया था । x-अक्ष = इबोव एमआर की अंतिम एकाग्रता में नुकीला पूरे रक्त का नमूना (प्रतियां/एमएल), y-अक्ष = सकारात्मक करने के लिए मिनट । (ख) अवधारणा का एक सबूत के लिए, पूरे रक्त (१.६ मिलीलीटर) 7 रोगियों से aliquots, वायरस और सूक्ष्मजीवविज्ञानी विशेष निदान, Statens सीरम Institut, डेनमार्क के विभाग में EBV (१३,०००-५०० प्रतियां/एमएल) के लिए सकारात्मक निदान, एक एनए निष्कर्षण सरलीकृत न निष्कर्षण विधि का उपयोग कर और एक EBV-विशिष्ट दीपक प्रतिक्रिया द्वारा पोर्टेबल बैटरी चालित जिनी द्वितीय इज़ोटेर्माल डिवाइस का उपयोग कर विश्लेषण किया गया । एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, एक परवो B19-सकारात्मक नमूना शामिल किया गया था. x-अक्ष = एक रोगी के नमूने में EBV के वायरल लोड (प्रतियां/एमएल), y-अक्ष = सकारात्मक करने के लिए मिनट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
इस रिपोर्ट में, हम एक सुरक्षित, तेजी से, और सरल मैनुअल बेडसाइड न निष्कर्षण विधि के बहाव आणविक lysis/बाध्यकारी बफर में एक वायरस की जांच के लिए-निष्क्रिय पूरे रक्त का वर्णन । वर्णित ना निष्कर्षण विधि सीधे पूरे रक्त वैक्यूम रक्त संग्रह ट्यूब में एकत्र lysis/बाध्यकारी बफर (सामग्री की मेज)7युक्त नमूनों पर किया जा करने के लिए विकसित किया गया था । इस विशिष्ट बफ़र इबोव एमआर7 निष्क्रिय करता है और विधि में महत्वपूर्ण घटक है । रक्त संग्रह के बाद, हम नमूना की एक पूरी निष्क्रियता सुनिश्चित करने के क्रम में कम से 207 मिनट के लिए ट्यूब मशीन की सिफारिश । बेडसाइड इबोव एमआर निष्क्रियता, ऐसे बीएसएल-4 शर्तों के रूप में कठोर रोकथाम की स्थिति के तहत किसी भी इबोव एमआर-सकारात्मक नमूनों से निपटने के लिए की आवश्यकता को समाप्त, और नमूनों सामान्य बीएसएल-2 शर्तों के तहत संचालित किया जा करने के लिए अनुमति देता है. यह संभावना है कि अंय जोखिम समूह चार रोगजनकों, जैसे लासॅ वायरस, Marburg वायरस, और क्रीमिया कांगो रक्तस्रावी बुखार वायरस भी इस बफर द्वारा निष्क्रिय कर रहे हैं, लेकिन यह दिखाई देता है ।
वर्णित ना निष्कर्षण विधि एक अस्पताल आइसोलेशन वार्ड में एक रोगी के बगल में या एक क्षेत्र अस्पताल में प्रदर्शन किया जा करने के लिए विकसित किया गया था और इसलिए, इस तरह के केंद्रापसारक के रूप में कोई प्रयोगशाला उपकरण, की आवश्यकता है, हीटिंग ब्लॉक, या बिजली. सब है कि न निष्कर्षण विधि की आवश्यकता है MGPs या धोने बफ़र्स, एक चुंबकीय धारक, और प्रयोज्य पिपेट की एक निश्चित मात्रा युक्त ट्यूबों रहे हैं । बफ़र्स युक्त ट्यूबों के पूर्व तैयारी प्रोटोकॉल सरल क्योंकि यह पिपेट के लिए की जरूरत समाप्त, और इसके बजाय, aliquoted बफ़र्स सीधे नमूना ट्यूबों में डाल रहे हैं । चुंबकीय धारक ना युक्त MGPs को पकड़ता है और एक आसान हैंडलिंग के लिए धो चरणों की मध्यस्थता । चुंबकीय धारक एक साधारण चुंबक और एक रबर बैंड के मामले में एक चुंबकीय धारक उपलब्ध नहीं है के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है; हालांकि, चुंबकीय धारक ट्यूब छोड़ने और चुंबक और रबर बैंड लगाने जब सामग्री को गिराने के जोखिम पर हाथ कम कर देता है । lysis/बाध्यकारी बफर की चिपचिपाहट के कारण-निष्क्रिय पूरे रक्त नमूना, डिस्पोजेबल पिपेट ट्यूब से supernatant/तरल/धो बफ़र्स को दूर करने के लिए उपयोग किया जाता है । प्रयोज्य पिपेट एक अपशिष्ट संग्रह ट्यूब में ट्यूब से सामग्री का एक सीधा घनघोर द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है, लेकिन ट्यूब के बाहर किसी भी बूंदें नहीं बनाने के लिए कृपया ध्यान रखें । यदि बूंदें बनाई जाती हैं, तो दूषित सतह को कभी भी chloramine या सोडियम हाइपोक्लोराइट ("ब्लीच" में सक्रिय सामग्री) से संक्रमित नहीं होना चाहिए क्योंकि यह मिश्रण विषैले साइनाइड के गठन के लिए नेतृत्व कर सकता है । इसलिए, अगर पहले गिरा, एक शोषक ऊतक के साथ फैल पोंछ । अगले, ७०% इथेनॉल के साथ सतह साफ और फिर पानी के बहुत सारे के साथ, और अंत में, chloramine या सोडियम हाइपोक्लोराइट का उपयोग करें । यह सब बेकार है कि lysis/बाध्यकारी बफर (अपशिष्ट संग्रह ट्यूब और प्रयोज्य पिपेट सहित) के साथ संपर्क में रहा है शामिल हैं । इसके बजाय, एक अलग अपशिष्ट कंटेनर में सभी अपशिष्ट इकट्ठा और केवल ७०% इथेनॉल के साथ कंटेनर के बाहर संक्रमित ।
NAs आम तौर पर एक हीटिंग कदम के दौरान MGPs से eluted हैं, लेकिन इस हीटिंग कदम सरलीकृत न निष्कर्षण प्रोटोकॉल में हटा दिया गया है बिजली और उपकरणों के उपयोग को समाप्त करने के लिए । इसलिए, NAs करने के लिए छड़ी MGPs, जो, इसलिए, एक सकारात्मक न पता लगाने के लिए बहाव न जांच परख करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए करते हैं । MGPs एक १.५ मिलीलीटर डिस्पोजेबल पिपेट से एक छोटी बूंद का उपयोग बहाव प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं । यह अतिरिक्त एक पंख टिप पिपेट का उपयोग कर सामान्य अलावा के रूप में के रूप में सटीक नहीं है; हालांकि, ना/MGPs के दीपक, आर टी-दीपक, qPCR, या आर टी-qPCR प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए गलत इसके अलावा प्रतिक्रिया को बाधित नहीं करता है या हमारे घर में नैदानिक परख में प्रतिदीप्ति संकेत प्रभावित करते हैं । फिर भी, इस परख से परख करने के लिए अलग हो सकता है, और हम अनुशंसा करते है कि हर बहाव ना परीक्षण मांय है, और है कि परख की संवेदनशीलता सरलीकृत ना निष्कर्षण विधि का उपयोग कर परीक्षण किया है । ना निष्कर्षण विधि अपेक्षाकृत संवेदनशील है, और पूरे रक्त एक डीएनए या आरएनए वायरस युक्त के रूप में कम के रूप में ३,००० प्रतियां/एमएल आसानी से निकाला जा सकता है और बहाव आणविक परीक्षणों में पाया, ऐसे qPCR के रूप में । नैदानिक नमूनों में वायरल लोड आमतौर पर एक संक्रमण की तीव्र चरण के दौरान बहुत अधिक है, और रक्तस्रावी बुखार वायरस, जैसे इबोव एमआर, लासॅ वायरस, और क्रीमिया कांगो रक्तस्रावी ज्वर वायरस, आमतौर पर 10 से अधिक5 प्रतियां/ ,10,11. इसलिए, इन नमूनों में वायरस आसानी से इस ना निष्कर्षण विधि का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है । हालांकि, इबोव एमआर7, Vaccinia, और Cowpox वायरस8 के अलावा अन्य वायरसों की MPLB निष्क्रियता दिखाई देने लगती है ।
सरलीकृत ना निष्कर्षण विधि अस्पताल आइसोलेशन वार्ड में या क्षेत्र सेटिंग्स में किया जा सकता है और बिंदु की देखभाल आणविक निदान के लिए आदर्श है । हालांकि, विधि उच्च-प्रवाह न निकालने के लिए एक खुली ट्यूब के हाथों पर हैंडलिंग के कारण के लिए लागू नहीं है । यदि उच्च प्रवाह ना निकालने की जरूरत है, निष्क्रिय पूरे रक्त के नमूनों को आसानी से ना निष्कर्षण रोबोट7का उपयोग कर शुद्ध किया जा सकता है । एक अंय नुकसान ऐसे lysis/बाध्यकारी बफर के रूप में हानिकारक रिएजेंट की हैंडलिंग है [20-30% पॉलीथीन ग्लाइकोल पी-(1, 1, 3, 3-tetramethylbutyl)-फिनाइल ईथर और 30-50% guanidinium thiocyanate (GITC)]17 और धो बफर मैं (30-50% guanidinium क्लोराइड) एक प्रवाह हूड के बाहर एक खुली ट्यूब में17 । lysis/बाइंडिंग बफ़र केंद्रित रूप में वैक्यूम ट्यूब के भीतर और रक्त 1:1 (v/v) के संग्रह के साथ निहित है, ट्यूब खोलने से पहले एकाग्रता कम है । निर्वात ट्यूब के उद्घाटन और MGPs या धोने बफर के हटाने/मैं कुछ सेकंड के भीतर प्रदर्शन किया है और, इसलिए, एयरोसोल्स की साँस लेना के जोखिम कम है. धोने बफर के हटाने के बाद-मैं, ट्यूब से, कोई अन्य हानिकारक एजेंट प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है ।
कई तेजी से बिंदु की देखभाल आणविकपरीक्षणों और उपकरणों २०१३3,6,12,13,14,15, 16 में इबोव एमआर प्रकोप के बाद से विकसित किया गया है . हालांकि, इन परीक्षणों के कई अभी भी एक अप की आवश्यकता है, संक्रामक सामग्री की धारा हैंडलिंग, बीएसएल-3-सुरक्षा अलमारियां, और एक ंयूनतम पर, प्रयोगशाला उपकरण, जैसे पिपेट, केंद्रापसारक, और हीटिंग ब्लॉक, या बिजली । सुरक्षा अलमारियां का उपयोग पेचीदा है और एक तेजी से निदान लंबे समय तक । वर्णित बेडसाइड वायरस वायरस निष्क्रियता ट्यूब में रक्त के प्रत्यक्ष संग्रह के साथ निष्क्रियता न निष्कर्षण विधि के साथ संयुक्त-सुरक्षा अलमारियां, बिजली, और प्रयोगशाला सुविधाओं के लिए की आवश्यकता समाप्त । इसके अतिरिक्त, क्योंकि सरलीकृत न निष्कर्षण विधि रोगी के बगल में किया जा सकता है और एक पोर्टेबल बैटरी चालित इज़ोटेर्माल डिवाइस में एक दीपक प्रतिक्रिया के साथ संयुक्त, एक सुरक्षित बेडसाइड आणविक निदान ४० मिनट के भीतर प्राप्त किया जा सकता है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम उनकी तकनीकी सहायता के लिए और नैदानिक नमूनों को संभालने के लिए सुसैन लोपेस Rasmussen और Solvej Kolbjørn जेंसेन को धन्यवाद देते हैं । यह परियोजना EbolaMoDRAD कंसोर्टियम का हिस्सा है, जिसने अनुदान करार N ° 115843 के तहत नवीन दवा पहल 2 संयुक्त उपक्रम से धन प्राप्त किया है । यह संयुक्त उपक्रम यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम और EFPIA से समर्थन प्राप्त करता है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL) | Becton Dickinson | 368861 | |
| Plus Blood Collection | Becton Dickinson | 362725 | |
| 23G x 1 needle | Becton Dickinson | 300800 | |
| LUER LOK syringe (3 mL) | Becton Dickinson | 309658 | |
| Butterfly needle with small-bore extension tubing | Jørgen Kruuse A/S | 121714 | |
| 1% Virkon | Nomeco A/S | 849265 | |
| MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lysis/Binding Buffer - Refill | Roche Diagnostics A/S | 03246752001 | |
| MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit | Roche Diagnostics A/S | 3038505001 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL) | Thermo Fisher Scientific | 375418 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379189 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379146 | |
| DynaMag™-5 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Thermo Scientific™ Samco™ Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 231 | |
| Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 |
References
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