Här presenterar vi ett protokoll för att uppskatta respiratoriska och fermentativa ämnesomsättningen genom att montera den exponentiella tillväxten av Saccharomyces cerevisiae till ekvationen exponentiell tillväxt. Beräkning av de kinetiska parametrarna tillåter för screening av påverkan av ämnen/föreningar på jäsning eller mitokondrie andning.
Saccharomyces cerevisiae celler i den exponentiella fasen upprätthålla sin tillväxt genom att producera ATP genom jäsning och/eller mitokondrie respiration. Jäsbara kolhalten reglerar främst hur jästceller generera ATP; Således driver variationen i jäsbara kolhydrater nivåer energisk metabolismen av S. cerevisiae. Detta dokument beskriver en hög genomströmning metod baserad på exponentiell jäst tillväxt att uppskatta effekterna av koncentrationen förändringar och naturen av kol källan på andningsorganen och fermentativa metabolism. Tillväxten av S. cerevisiae är mätt i en mikroplattan eller skakas koniska kolven genom bestämning av den optiska densiteten (OD) på 600 nm. Sedan byggs en tillväxtkurva genom plotting OD kontra tid, vilket gör att identifiering och val av den exponentiella fasen, och är utrustad med exponentiell ekvation att få kinetiska parametrar. Låg specifik tillväxt med högre fördubbling gånger representerar vanligtvis en respiratorisk tillväxt. Däremot indikerar högre specifik tillväxt med lägre fördubbling gånger fermentativa tillväxt. Tröskelvärden för fördubbling tid och tillväxthastighet är beräknat med välkända luftvägs- eller fermentativa villkor, såsom icke-jäsbara kolkällor eller högre koncentrationer av jäsbara sockerarter. Detta erhålls för varje specifik stam. Slutligen, de beräknade kinetiska parametrarna jämförs med tröskelvärdena att fastställa huruvida jästen visar fermentativa eller respiratorisk tillväxt. Fördelen med denna metod är dess relativa enkelhet för att förstå effekterna av en substans/förening på fermentativa eller respiratorisk metabolism. Det är viktigt att betona att tillväxt är en invecklad och komplicerad biologisk process. preliminära data från denna metod måste därför styrkas genom kvantifiering av syreförbrukning och ackumulering av jäsning biprodukter. Därmed, kan denna teknik användas som en preliminär genomgång av föreningar/ämnen som kan störa eller förbättra fermentativa eller respiratorisk metabolism.
Saccharomyces cerevisiae tillväxt har fungerat som ett värdefullt verktyg att identifiera dussintals fysiologiska och molekylära mekanismer. Tillväxt mäts primärt av tre metoder: seriespädningar för spot test, kolonibildande enhet räknar och tillväxtkurvor. Dessa tekniker kan användas ensamt eller i kombination med en mängd olika substrat, miljöförhållanden, mutanter och kemikalier för att undersöka specifika reaktioner eller fenotyper.
Mitokondriell andning är en biologisk process där tillväxt kinetik har tillämpats framgångsrikt för att upptäcka okända mekanismer. I detta fall komplettering tillväxt medier med icke-jäsbara kol källor såsom glycerol, laktat eller etanol (som metaboliseras uteslutande av mitokondriell respiration), som den enda källan för kol och energi tillåter för att utvärdera den respiratoriska tillväxt, vilket är viktigt att upptäcka störningar i oxidativ fosforylering aktivitet1. Däremot, är det komplicerat att använda tillväxt kinetiska modeller som en metod för att dechiffrera mekanismerna bakom jäsning.
Studien av jäsning och mitokondrie respiration är viktigt att klarlägga de molekylära mekanismerna bakom vissa fenotyper av Crabtree och Warburg effekter2,3. Effekten Crabtree kännetecknas av en ökning av glycolytic flux, förtryck av mitokondriell andning, och inrättandet av jäsning som den primära vägen att generera ATP i närvaro av höga koncentrationer av jäsbara kolhydrater (> 0,8 mM)4,5. Warburg effekten är metaboliskt analoga Crabtree resonemang, med skillnaden att i däggdjursceller, den viktigaste produkten av jäsning är laktat6. Faktiskt, Warburg effekten ställs ut av en mängd olika cancerceller, utlöser glukosupptag och konsumtion även i närvaro av syre7. Därmed, har studera den molekylära basen för växeln från andning att jäsning i Crabtree effekt både biotekniska återverkningar (för etanolproduktion) och potentiella effekter i cancerforskning.
S. cerevisiae tillväxt kan vara ett lämpligt verktyg att studera Crabtree och Warburg effekterna. Denna idé är baserad på det faktum att den jäst exponentiella fasen, de centrala vägar som används för att producera ATP är mitokondriell respiration och jäsning, som är nödvändiga för att upprätthålla tillväxten. Till exempel är tillväxten av S. cerevisiae intimt förknippad med funktionen av ATP-genererande vägar. I S. cerevisiae, mitokondriell respiration producerar cirka 18 ATP molekyler per glukos molekyl, medan jäsning genererar endast 2 ATP molekyler, förväntas därav att tillväxttakten har snäva länkar med metaboliska vägar producera ATP8. I detta avseende när jäsningen är den främsta vägen att generera ATP, kompenserar jästen låg ATP produktionen genom att öka andelen glukosupptag. Tvärtom, är glukos förbrukning av jästceller som använder mitokondriell andning som ATP huvudkällan låg. Detta indikerar att det är viktigt för jästen att sense kolhydrat tillgänglighet innan man kan avgöra hur ATP kommer att genereras. Därför glukos tillgänglighet spelar en viktig roll i övergången mellan jäsning och mitokondrie respiration i S. cerevisiae. I närvaro av stora mängder glukos föredrar jästen jäsning som den centrala vägen att generera ATP. Intressant, när jästen jäsa, upprätthålls specifika tillväxttakten vid högsta. Däremot, under låga nivåer av glukos producerar S. cerevisiae ATP med hjälp av mitokondriell respiration, upprätthålla lägre tillväxttakt. Därmed, variation i koncentrationen av glukos och användning av andra kolkällor framkalla förändringar i jästens preferens mellan fermentativa och respiratoriska tillväxt. Genom att beakta detta faktum med ekvationen exponentiell tillväxt, kan man få biologiska innebörden av kinetiska parametrar såsom fördubbling tid (Dt) och tillväxthastighet (µ). Till exempel hittades lägre µ värden när jästen använder mitokondriell andning som den primära vägen. Tvärtom, under förhållanden som gynnar jäsningen, hittades högre µ värden. Denna metod kan användas för att mäta de sannolika mekanismerna av kemikalier som påverkar jäsning och mitokondrie respiration i S. cerevisiae.
Syftet med denna uppsats är att föreslå en metod baserad på tillväxt kinetik för screening effekterna av en viss substans/förening på mitokondriell andning eller jäsning.
Lång tid har gått sedan J. Monod10 uttryckt att studiet av tillväxten av bakteriekulturer är den grundläggande metoden för mikrobiologi. Tillkomsten av de molekylära verktyg förseningar-användning och studie av tillväxten som en teknik. Trots komplexiteten i tillväxt vilket innebär många inbördes relaterade processer, kan dess underliggande mekanismer beskrivas med hjälp av matematiska modeller11. Detta är en robust metod som kan användas som ett kompletter…
The authors have nothing to disclose.
Projektet stöddes av bidrag av Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (licensnummer 293940) och Fundación TELMEX-TELCEL (licensnummer 162005585), både till IKOM.
Orbital Shaker | Thermo Scientific | 4353 | For inoculum incubation or conical fask cultures |
Bioscreen | Growth curves | C MBR | For batch cultures in microplates |
Glucose | Sigma | G7021 | For YPD broth preparation |
Peptone from casein, enzymatic digest | Sigma | 82303 | For YPD broth preparation |
Yeast extract | Sigma | 09182-1KG-F | For YPD broth preparation |
Bacteriological Agar | Sigma | A5306 | For YPD agar preparation |
NaH2PO4 | Sigma | S8282 | For SC broth preparation |
(NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | For SC broth preparation |
Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate | Sigma | Y1251 | For SC broth preparation |
Yeast synthetic drop-Out medium supplements | Sigma | Y1501 | For SC broth preparation |
Ammonium sulfate granular | J.T. Baker | 0792-R | For medium supplementation example |
Resveratrol | Sigma | R5010 | For medium supplementation example |
Galactose | Sigma | G8270 | For medium supplementation example |
Sucrose | Sigma | S7903 | For medium supplementation example |
Absolut ethanol | Merck | 107017 | For medium supplementation example |
Glycerol | J.T. Baker | 2136-01 | For medium supplementation example |
GraphPad Prism | GraphPad Software | For data analysis | |
Honeycomb microplates | Thermo Scientific | 9502550 | For microplate cultures |