Summary
Det overordnede målet med denne artikkelen er å standardisere protokollen for isolasjon, karakterisering og differensiering av cardiac stamceller (CSCs) fra voksen mus hjertet. Her beskriver vi en tetthet gradert sentrifugering metode for å isolere murine CSCs og utdypet metoder for CSC kultur, spredning og differensiering inn cardiomyocytes.
Abstract
Myocardial infarction (MI) er en ledende årsak til sykelighet og dødelighet verden. Et hovedmål for regenerativ medisin er å fylle døde myokard etter MI. Selv om flere strategier har blitt brukt til å regenerere myokard, fortsatt stilk cellen terapi en stor tilnærming til fylle døde myokard en MI hjerte. Samler bevis antyder tilstedeværelsen av bosatt cardiac stamceller (CSCs) i voksen hjertet og endokrine og/eller paracrine effekter på cardiac gjenfødelse. CSC isolering og karakterisering og differensiering mot hjerteinfarkt celler, spesielt cardiomyocytes, er imidlertid en teknisk utfordring. Studien gitt vi en enkel metode for isolasjon, karakterisering og differensiering av CSCs fra voksen mus hjertet. Her beskriver vi en tetthet gradert metode for isolering av CSCs, der hjertet er fordøyd av en 0,2% collagenase II løsning. Betegner de isolerte CSCs, vurdert vi uttrykk for CSCs/hjerte dataindikatorer Sca-1, NKX2-5 og GATA4 og pluripotency/stemness markører OCT4, SOX2 og Nanog. Vi har også bestemt spredning potensialet i isolerte CSCs dyrking dem i en Petriskål og vurdere uttrykk for spredning markøren Ki-67. For å vurdere differensiering potensialet i CSCs, valgte vi syv - til ti - dager kultivert CSCs. Vi overført dem til en ny plate med en cardiomyocyte differensiering medium. De er ruges i en celle kultur inkubator for 12 dager, mens differensiering mediet endres hver tredje dag. Differensiert CSCs express cardiomyocyte-spesifikke indikatorer: actinin og troponin jeg. Dermed CSCs isolert med denne protokollen har stemness og kardiale markører, og de har et potensial for spredning og differensiering mot cardiomyocyte avstamning.
Introduction
Iskemisk hjertesykdom, inkludert hjerteinfarkt (MI), er en viktig dødsårsak rundt verden1. Stilk cellen terapi for regenererende døde myokard er fortsatt en stor tilnærming forbedre hjerte funksjonen av en MI hjertet2,3,4,5. Ulike typer stamceller har brukt å fylle døde myokard og forbedre hjerte funksjon av en MI hjerte. De kan grovt deles inn embryonale stamceller6 og voksne stamceller. I voksen stilk celler brukt ulike typer stamceller som Ben margtransplantasjon-avledet mononukleære celler7,8, mesenchymal stamceller hentet fra benmargen9,10, fettvev 11,12, og navlestreng13og CSCs14,15. Stamceller kan fremme cardiac gjenfødelse endokrine og/eller paracrine handlinger16,17,18,19,20. Imidlertid er en stor begrensning av stilk cellen terapi å skaffe et tilstrekkelig antall stamceller som kan spre og/eller skille mot et bestemt hjerte avstamning21,22. Autologous og allogenic transplantasjon av stamceller er en viktig utfordring i stamcelleforskningen terapi9. CSCs kan være en bedre tilnærming for cardiac regenerering fordi de er utledet fra hjertet, og de kan være mer lett atskilt i cardiac overleveringslinjer enn ikke-hjerte stamceller. Dermed reduseres risikoen for teratoma. I tillegg kan endokrine og paracrine effekten av CSCs, som exosomes og miRNAs fra CSCs, være mer effektivt enn andre typer stamceller. Dermed CSCs fortsatt et bedre alternativ for cardiac gjenfødelse23,24.
Selv om CSCs er en bedre kandidat for cardiac gjenfødelse en MI hjerte på grunn av deres hjerte opprinnelse, er en stor begrensning med CSCs mindre avkastning på grunn av mangel på en effektiv isolasjon metode. En annen begrensning kan være svekket differensiering av CSCs mot cardiomyocytes, avstamning,2,,25,,26,,27. For å omgå disse begrensningene, er det viktig å utvikle en effektiv protokoll for CSC isolasjon, karakterisering, og differensiering mot cardiac avstamning. Det er ingen enkelt akseptabel markør for CSCs og en bestemt celle-overflate markør-baserte isolering av CSCs gir mindre CSCs. Her standardisere vi en enkel gradient sentrifugering tilnærming for å isolere CSCs fra musen hjertet som er kostnadseffektiv og resulterer i en økt avkastning på CSCs. Disse isolerte CSCs kan velges for bestemt celle-overflate markører ved fluorescens-aktivert celle shorting. I tillegg til CSCs isolasjon gitt vi en protokoll for CSC kultur, karakterisering, og differensiering mot cardiomyocyte avstamning. Derfor presenterer vi en elegant metode for å isolere, karakteriserer, kultur, og skille CSCs fra voksen mus hjerter (figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bolig, anestesi, og offer av mus ble utført etter godkjent IACUC protokollen av University of Nebraska Medical Center.
1. materiale
- Bruk 10 - 12 uke-gamle C57BL/6J svart mannlig mus, holdt internt i institusjonelle dyr anlegget, for isolering av CSCs. CSCs kan også isoleres fra ikke-gravid kvinne mus.
- Sterilisere alle nødvendige Kirurgiske instrumenter, inkludert kirurgisk saks, fine kirurgisk saks, buede shank tang og en kirurgisk blad, autoklavering dem før euthanasia museklikk.
- Forberede CSC isolasjon buffere i steriliserte stand og lagre dem på 4 ° C på is. Buffere inkluderer polysucrose og natrium diatrizoate løsning tilpasset en tetthet av 1.077 g/mL, ufullstendig Dulbecco endret Eagle's Medium, 1 x Ham balansert salt løsning (HBSS), og celle kultur-klasse 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS). Forbered en 1% collagenase II lagerløsning (filtrert og steriliseres) og en 0,2% fungerende løsning i HBSS.
- Holde vev kultur materialet sterilisert tilstanden i fravær av smittefarlige stoffer skap, inkludert en 10 mm Petriskål, en 6-vel plate, en 24-vel plate, T-25 og T-75 kultur flasker, 15 mL og 50 mL konisk rør og disponibel serologisk Pipetter med 40-µm og 100 -µm celle siler med 0.22-µm filtre.
- Sterilisere den 1000-µL pipette-spisser av autoklav med 10-µL og 200-µL.
- Bruk Pudderfrie nitrilhansker og 70% etanol for å opprettholde en steril tilstand gjennom hele eksperimentet.
- Bruk 10% blekemiddel som desinfeksjonsmiddel.
- Bruke kommersielt tilgjengelige CSC vedlikehold medium og cardiomyocytes differensiering medium for kultur og differensiering av CSCs, henholdsvis.
2. isolering metoden av Cardiac stamceller
- Euthanize fire til fem voksne mannlige (eller ikke-gravide kvinner) mus med en CO2 kammer. Fastsette hver musens armene på en separat disseksjon papp med pinner eller selvklebende tape.
- Spray 70% etanol på musen for å kvitte seg med utenfor bakterier og opprettholde sterilisert tilstand under høsting av hjertet. Lage et snitt med saks i magen og kuttet huden fra magen til thorax i en rett linje. Fjern skinnet fra begge sider av den midterste kuttet å fjerne mageområdet av hud og hår. Ved hjelp av saks og pinsetter, kuttet membranen under brystkasse.
- Åpne bryst hulrom museklikk ved å kutte brystkasse i panseret. Avdekke hjertet og fjerne blodet i hjertet. Vaske området rundt hjertet med iskald PBS å kvitte seg med alle blod i hjertet.
- Dissekere hjertet kirurgisk saks og pinsett. Plass hjertet i en 100 mm Petriskål inneholder 10 mL av iskalde PBS.
- Palpitate hjertet med buet shank tang og fjerne gjenværende blodet i hjertet.
- Bruk hele hjerte for isolering av CSCs.
- Overføre alle fire eller fem hele hjerter til en 50-mL konisk rør som inneholder 10 mL av iskalde HBSS. Holde røret på is inntil videre behandling.
- Tørk innenfor og utenfor en biosafety kabinett med 70% etanol å skape et sterilisert miljø. Sterilisere hjertet inneholder røret og andre nødvendige materialer med 70% etanol. Plass hjertet inneholder røret i fravær av smittefarlige stoffer skap for videre behandling.
- Overføre hjertene til et 100 mm Petriskål inneholder 10 mL av iskalde HBSS. Vask hjerter igjen av palpating for å fjerne eventuelle gjenværende blod i hjertet. Endre HBSS løsningen etter hver vask å sikre fullstendig fjerning av blod.
- Skjær hjerter i små biter med fine kirurgisk saks eller en kirurgisk blad i en 100 mm Petriskål inneholder 5-7 mL HBSS løsning. Hold hvert hjerte med en tang og bruk en kirurgisk fine saks eller en kirurgisk blad for å kutte hjertet i 2 til 4 mm biter. Endre HBSS løsningen jevnlig for å sikre blod-fri HBSS. Hakke hjerter i HBSS løsningen.
- Sentrifuge hakket vevet 500 x g ved 4 ° C i 5 min. Forkast nedbryting og holde pellet.
- Resuspend pellet i 5-6 mL av 0,2% collagenase II løsning i et 50-mL konisk rør. Volumet av collagenase løsning skal nesten 1,5 - til 2 ganger volumet av pellet.
Merk: For fordøyelsen av vev, 0,2% collagenase jeg og 2,5 U/mL dispase løsning kan erstatte 0,2% collagenase II. Bruke en nesten lik antall dispase løsning på collagenase jeg løsning. - Grundig blande pellet med 0,2% collagenase II løsning agitating røret eller rock røret på en shaker på 75 x g i 45-60 min på 37 ° C. Rist røret kraftig hånd etter hver 20-30 minutter å forsterke lyse.
- Triturate lysed vev blandingen med en 5 mL serologisk pipette og et 1-mL pipette tips for å distansere vev klumpen i én celle suspensjon.
Merk: For å få maks gjenoppretting av CSCs, triturate lysis blandingen i minst 5 minutter. Hvis vev klumper er relativt stort, kutte spissen av et 1-mL pipette tips med saks eller et kirurgisk blad og bruke den for føden. - Stopp den enzymatiske lysis av vev ved å legge til kommersielt tilgjengelig CSC vedlikehold medium. Legge til nesten 2-3 x så mye vedlikehold medium som volumet av lysed vev i trinn 2.14.
- Fordøyd celle suspensjon passere en 100 µm celle sil for å fjerne noen ufordøyd vev brikker.
- Gjenta trinn 2,16 bruker en 40-µm celle sil.
- Skille cellene til tetthet gradert sentrifugering. For separasjon av celler, forsiktig overlappe en lik mengde av filtratet over polysucrose og natrium diatrizoate løsning. For eksempel først legge 20 mL polysucrose og natrium diatrizoate løsning i et 50-mL konisk rør og deretter legge til 20 mL filtratet fra trinn 2,17 over polysucrose og natrium diatrizoate løsningen.
Merk: Prewarm polysucrose og natrium diatrizoate løsning på 37 ° C før bruk med celler. Legge til filtratet fra trinn 2,17 over polysucrose og natrium diatrizoate løsningen veldig sakte og forsiktig å unngå en blanding av de to løsningene. Dette anses å være et avgjørende skritt. - Sentrifuge røret som inneholder begge løsninger på 500 x g for 20 min ved romtemperatur bruker en swing bøtte sentrifuge. Angi centrifuge for riktig separasjon av CSCs og en lavere akselerasjon og retardasjon hastighet for å unngå å blande de to løsningene. Dette er et viktig skritt i CSC isolasjon. Sett røret som inneholder gradient blandingen svært sakte uten forstyrrelser i en sentrifuge og sette den for sentrifugering.
- Ta ut buffy frakken med ekstra løsning fra øvre laget med en 1-mL pipette eller en plast Pasteur pipette i et 15-mL sterilisert rør. Dette buffy laget inneholder CSCs.
Merk: Ta ekstra forholdsregler under pipettering av buffy pelsen ikke å ta ut polysucrose og natrium diatrizoate løsning laget fordi det er giftig for CSCs. - Legge til en lik mengde CSC vedlikehold medium i cellen suspensjon fra trinn 2,20 og bland det riktig å nøytralisere den gjenværende polysucrose og natrium diatrizoate løsning, hvis den finnes.
- Sentrifuge over cellen suspensjon på 500 x g i 5 min på 4 ° C. Kast nedbryting.
- Resuspend pellet i 7-10 mL av ufullstendig DMEM medium og sentrifuge det 500 x g i 5 min på 4 ° C å kvitte seg med alle gjenværende polysucrose og natrium diatrizoate løsning.
- Samle pellets, som inneholder de renset CSCs.
- Resuspend pellet i 1 mL av CSC vedlikehold medium, beregne CSC og bruke pellet for kultur. Vil telle CSC nummeret, bruk Trypan blå flekker og en hemocytometer. Med fire mannlige mus hjerter er avkastningen av CSCs ~1.8 millioner.
- Frø CSCs i en 6-brønnen plate belagt med en 0.02% gelatin løsning som inneholder 0,5% fibronectin. Bruk 2 mL av komplette vedlikeholdelse medium for seeding. Inkuber kultur plate i en inkubator på 37 ° C med 5% CO2.
- Erstatt medium for kultur CSCs med komplett CSC vedlikehold medium hver dag til dag. Etter det endre mediet på alternative dager.
- Bestemme veksten av CSCs ved å observere dem under et mikroskop.
3. kultur vedlikehold og tidens hjerte stamceller
- Kultur i isolerte CSCs i et kommersielt tilgjengelig vedlikehold medium. Erstatte kultur medium med fersk vedlikehold medium på alternative dager. Når CSC kulturen har nådd confluency, overføre CSCs til en ny plate belagt med gelatin og fibronectin, som nevnt i trinn 2.26. Koble de kultiverte CSCs av enzymatisk celle dissosiasjon buffer. Følge standard protokoll for cellen dissosiasjon kultur plate. På dette stadiet anses CSCs på passage 0 (P0) scenen.
- Kultur P0 CSCs i en ny gelatin og fibronectin-belagt plate i fullstendig CSC vedlikehold medium på 37 ° C i en 5% CO2 inkubator, la dem være confluent, og følg deretter trinn 3.1 å få passering 1 (P1) CSCs. Store P1 CSCs i flytende nitrogen eller bruke dem for op menter.
- Frø 0,5 millioner celler i en 6-vel plate eller 1 million celler i T-25 å opprettholde CSC kulturen i den innledende fasen.
- Passasje CSCs når de blir 85% - 90% confluent. CSCs kan kultivert i vedlikehold medium opptil fire til seks uker.
Merk: Holde innledende seeding tettheten av CSCs relativt høy (40% - 50%) fordi, på lavere seeding tetthet, CSCs kan endre deres morfologi til flatt og langstrakt.
4. karakterisering av Cardiac stamceller
- Betegner de kultiverte CSCs, observere dem under en phage-kontrast eller lys-feltet mikroskop. Sted CSC inneholder plate målet med fluorescerende mikroskop. Angi forstørrelsen ganske lav (10 X) fokusere cellene. Bruk kontrast aperture for å observere cellene. Øke forstørrelsen til 20 X ved å endre linsen og bilde CSCs. økningen målet til 40 X og bilde av CSCs. I to dager, CSCs vises nesten rundt i form, men størrelsen på cellen øker med tiden, og i syv dager, CSCs vises nesten sylindriske i form (figur 1A - 1 C).
- Utføre immunostaining av CSCs med markører for pluripotency/stemness (OCT4, SOX2 eller Nanog), spredning (Ki-67) (figur 2A - 2D) og kardiale opprinnelse/stamfar celler (Sca-1, NKX2-5 eller GATA4) (figur 3A - 3 C).
- For immunostaining av CSCs, frø 10.000 CSCs i en 24-brønnen plate.
- Neste dag (etter 18-24 h), fikse CSCs i 300 µL av 4% paraformaldehyde i 10 min.
- Vask CSCs med 500 µL av iskalde PBS, 3 x med 5 minutters intervaller.
- Permeabilize CSCs med 300 µL på 0,2% Triton X-100 fortynnet i PBS i 10 min.
- Vask CSCs med 500 µL av iskalde PBS, 3 x med 5 minutters intervaller.
- Utføre blokkering av CSCs med 300 µL av 1% BSA fortynnet i PBST (PBS + 0,1% mellom 20) eller 300 µL av 10% vanlig kylling serum fortynnet i PBST 1t.
- Inkuber CSCs i 200 µL primære antistoff fortynnet i blokkering løsning overnatting på 4 ° C. Fortynne det primære antistoffet som anbefalt av dataarket av antistoffer eller som standardisering.
- Vask CSCs med 500 µL av iskalde PBS, 3 x med 5 minutters intervaller.
- Inkuber CSCs i 200 µL sekundære antistoff fortynnet i blokkering løsning (se trinn 4.2.6) 1t ved romtemperatur. Fortynne det sekundære antistoffet som anbefalt av dataarket av antistoffer eller som standardisering.
- Vask CSCs med 500 µL av iskalde PBS, 3 x med 5 minutters intervaller.
- Counterstain CSCs med 200 µL av DAPI (1 µg/mL) fortynnet i PBS i 5 min.
- Vask CSCs 1 x med 500 µL av iskalde PBS. Deretter Legg 300 µL av iskalde PBS i hver brønn.
- Utføre bildevisning fluorescens mikroskop. Følg instruksjonene i fluorescerende imaging, slik som å unngå lys på tallerkenen. Holde kultur plate under mikroskopet. Fokusere cellene ved ulike forstørrelser. Observere cellene under fase kontrast og/eller annen eksitasjon filtre og lagre bilder.
- Lagre platen i mørket på 4 ° C.
5. differensiering av Cardiac stamceller i Cardiomyocyte
- For differensiering av CSCs, frø 500.000 CSCs i en 6-vel plate med 2 mL prewarm (37 ° C) kommersielt tilgjengelig CSC vedlikehold medium.
- Inkuber platen inneholder CSCs i en CO2 inkubator på 37 ° C. Tillate CSCs å feste og sprer til sub confluent vekst. Hvis mediet blir gule, erstatte kultur medium med fersk vedlikehold medium.
- På 85% - 90% confluency, erstatter vedlikehold mediet med 2 mL prewarm (37 ° C) cardiomyocytes differensiering medium. Inkuber platen i en CO2 inkubator på 37 ° C 2-3 uker.
- Endre differensiering mediet hver 2-3 d. observere CSCs' morfologi under et mikroskop hver gang under medium endre for å sikre god kultur betingelsene.
- Etter 12 d CSC kultur i differensiering medium, bilde CSCs for differensiering markører etter en standard immunostaining protokollen (se trinnene 4.2.1 - 4.2.14). Lagre fluorescerende bildene for uttrykket for cardiomyocytes (figur 4A - 4B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Studien isolerte vi CSCs fra 10 - 12 uke-gamle C57BL/6J mannlige mus hjerter. Her har vi presentert en enkel metode for CSC isolering og karakterisering bruke markører for pluripotency. Vi har også presentert et elegant metode for CSC differensiering og karakterisering av CSCs som differensiert mot cardiomyocytes avstamning. Vi observerte en spindel figur morfologi av 2 - til 3-dager-kulturperler CSCs under fase kontrast mikroskop (figur 1A og 1B). Vi fant en endring i morfologi av CSCs på 7 dager kultur i vedlikehold medium, der tiden stamceller blir langstrakte (figur 1 c). Vi preget CSCs for markører for pluripotency og fant at de uttrykke OCT4, SOX2 og Nanog (figur 2A - 2 C). Vi fant også at CSCs sprer på kultur medium og uttrykke spredning markøren Ki-67 (figur 2D). For å karakterisere kardial opprinnelsen til CSCs, bestemt vi uttrykket av cardiac markører Sca-1, NKX2-5 og GATA4 i CSCs. Vi fant et uttrykk av cardiac markører i kulturperler CSCs (figur 3A - 3 C). For å bestemme differensiering av CSCs mot cardiomyocyte avstamning, kultivert vi CSCs i cardiomyocyte differensiering medium i 12 dager. Etter 12 dager, vi fotografert de differensierte CSCs for cardiomyocyte markører actinin og troponin jeg. Vi observerte at cardiomyocyte markører ble uttrykt i differensiert CSCs (figur 4A - 4B). Samlet sett viser disse resultatene at vi ble isolert CSCs fra musen hjerte og at disse CSCs kan spre og differensiere mot cardiomyocytes avstamning.
Figur 1: morfologi av kultivert CSCs. Disse skjermbildene viser kontrast avbildning av kultivert CSCs, nemlig representant CSCs etter 2 dager med dyrking i vedlikehold medium på (A1) 20 X og (A2) 40 X mål, representant CSCs etter 3 dager for dyrking i vedlikehold medium på) B1) 20 X og (B2) 40 X målsettinger og representant CSCs etter 7 dager med dyrking i vedlikehold medium på (C1) 20 X og (C2) 40 X mål. Skala barer er 100 µm for 40 X forstørrelse og 200 µm for 20 X forstørrelse.
Figur 2: karakterisering av CSCs for pluripotency markører. Disse skjermbildene viser representant fluorescens avbilding av kultivert CSCs for markører for pluripotency (OCT4, SOX2 og Nanog) og spredning (Ki-67). Paneler A viser uttrykk for OCT4 (grønn) og DAPI (blå) i CSCs på (A1) 20 X og (A2) 40 X forstørrelse. Paneler B viser uttrykk for SOX2 (grønn) og DAPI (blå) i CSCs på (B1) 20 X og (B2) 40 X forstørrelse. Paneler C viser uttrykk for Nanog (grønn) og DAPI (blå) i CSCs på (C1) 20 X og (C2) 40 X forstørrelse. Paneler D Vis uttrykk for Ki-67 (rød) og DAPI (blå) i CSCs på (D1) 20 X og (D2) 40 X forstørrelse. Skala barer er 100 µm for 40 X forstørrelse og 200 µm for 20 X forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: karakterisering av CSCs for cardiac markører. Disse skjermbildene viser representant fluorescens avbilding av kultivert CSCs for cardiac markører. Paneler A Vis uttrykk av Sca-1 (rød) og DAPI (blå) i CSCs på (A1) 20 X og (A2) 40 X forstørrelse. Paneler B viser uttrykk for NKX2-5 (grønn) og DAPI (blå) i CSCs på (B1) 20 X og (B2) 40 X forstørrelse. Paneler C viser uttrykk for GATA4 (rød) og DAPI (blå) i CSCs på (C1) 20 X og (C2) 40 X forstørrelse. Skala barer er 100 µm for 40 X forstørrelse og 200 µm for 20 X forstørrelse.
Figur 4: karakterisering av CSC differensiering mot cardiomyocyte avstamning. Disse skjermbildene viser representant fase kontrast og fluorescens bildebehandling for 12-dagers differensiert CSCs. (A) dette panelet viser uttrykk for cardiomyocyte merke actinin i differensiert CSCs, med (a) en fase-kontrakt Bilde, (b ) en fluorescens bildet av DAPI (flekker kjernen), (c) en fluorescens bildet av actinin (grønn), og (d) en flettet bilde paneler en - c. Forstørrelsene er 40 X. (B) dette panelet viser uttrykk for cardiomyocyte markør troponin jeg i differensiert CSCs, med (en) en fase-kontrakt Bilde, (b) en fluorescens bildet av DAPI (flekker kjernen), (c) en fluorescens bilde av Troponin jeg (grønn), og (d) en sammenslåtte bildet paneler en - c. Forstørrelsene er 40 X. Skala barer er 100 µm for 40 X forstørrelse og 200 µm for 20 X forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: skjematisk fremstilling av de ulike trinnene i CSC isolasjon, kultur og differensiering. Vi brukte kirurgisk fjernet hjerter fra fire til fem voksne mus for isolering av CSCs. Trinnvis prosessen med CSC isolasjon, kultur og differensiering mot cardiomyocytes overleveringslinjer presenteres. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De avgjørende skritt i denne CSC isolasjon protokollen er som følger: 1) sterilisert betingelse må opprettholdes for utvinning av hjerter fra mus. Enhver kontaminering under hjertet utvinning kan kompromittere kvaliteten av CSCs. 2) blod må fjernes fullstendig før hakking hjertet som er gjort av flere vasker hele hjerte og hjertet stykker med HBSS løsning. 3) hjertet brikkene må være helt lysed i en enkeltcelle suspensjon collagenase løsning. 4) polysucrose og natrium diatrizoate gradient løsningen for separasjon av cellene må være prewarmed. 5) medium for CSC kultur må være prewarmed. 6) der CSCs under frø i en kultur parabol skal være høy fordi, i lav confluency, CSCs kan endre deres morfologi. 7) CSC nummeret skal være scoret etter isolasjon fra hjertet og før plating i en kultur parabol. Antall CSCs angir effektiviteten av isolasjon fra hjertet. Telling av CSCs er viktig for såing av CSCs i kultur plate.
Vi brukte voksen mus for å isolere CSCs, som har blitt brukt av andre etterforskere i gnager modeller23,28. CSCs kan isoleres fra neonatal gnager hjerter29,30 og selv fra biopsy av et hjerte31. Tidligere rapportert CSC isolasjon protokollene har noen begrensninger, som mindre avkastning, en kompleks isolasjon prosedyre, en lang varighet for differensiering, og mindre cardiomyocyte differensiering potensielle32,33, 34. the CSC isolasjon protokollen presenteres her er enkel: det tar mindre tid og kostnadseffektiv og mer effektivt i CSC avkastning. Videre de isolerte CSCs er Sca-1+ ve (en godt akseptert markør for musen CSCs) (tall 1A1 - 3 c 2). Differensiering av CSCs trenger andre protokoller tre til fire uker35,36. Men krever denne protokollen 12 dager (tall 4A - 4B). Gradient sentrifugering-baserte CSC isolasjon presenteres her gir ~1.8 millioner CSCs fra fire mannlige mus hjerter.
Selv om avkastningen av CSCs er høy, er en begrensning av denne protokollen ensartethet og renhet av de isolerte CSCs. Fordi det ingen er enkelt akseptabel for CSCs, er det vanskelig å bruke en enkelt-celle-overflate markør for å velge CSCs. CSCs isolert av denne protokollen kan imidlertid brukes til å få uniform innbyggere CSCs basert på en bestemt markør eller flere markører av CSCs, bruker fluorescens-aktivert celle sortering. Dermed denne metoden CSC isolasjon er kostnadseffektivt med en høy avkastning og muligheten til å få en enhetlig CSC populasjon basert på bestemt celle-overflate-marker(s).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet er støttet i deler av National Institutes of Health tilskudd HL-113281 og HL116205 til Paras Kumar Mishra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson laboratory, USA | Stock no. 000664 | |
| Antibodies: | |||
| OCT4- | Abcam | ab18976 (rabbit polyclonal) | OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| SOX2 | Abcam | ab97959 (rabbit polyclonal) | SOX2-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Nanog | Abcam | ab80892 (rabbit polyclonal) | Nanog-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Ki67 | Abcam | ab16667 (rabbit polyclonal) | Ki67-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Sca I | Millipore | AB4336 (rabbit polyclonal) | Sca I Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| NKX2-5 | Santa Cruz | sc-8697 (goat polyclonal) | NKX2-5-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| GATA4 | Abcam | ab84593 (rabbit polyclonal) | GATA4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| MEF2C | Santa Cruz | sc-13268 (goat polyclonal) | MEF2C-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Troponin I | Millipore | MAB1691 (mouse monoclonal) | Troponin I-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Actinin | Millipore | MAB1682 (mouse monoclonal) | Actinin-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| ANP | Millipore | AB5490 (mouse polyclonal) | ANP-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Alex Fluor-488 checken anti-rabbit | Life technology | Ref no. A21441 | |
| Alex Fluor-594 goat anti-rabbit | Life technology | Ref no. A11012 | |
| Alex Fluor-594 rabbit anti-goat | Life technology | Ref no. A11078 | |
| Alex Fluor-488 checken anti-mouse | Life technology | Ref no. A21200 | |
| Alex Fluor-594 checken anti-goat | Life technology | Ref no. A21468 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture medium: | |||
| CSC maintenance medium | Millipore | SCM101 | Note: For CSC culture, PBS or incomplete DMEM medium was used for washing the cells |
| cardiomyocytes differentiation medium | Millipore | SCM102 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Isolation buffer: | |||
| polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077) | Sigma | 10771 | |
| HBSS | Gibco | 2018-03 | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Dispase solution | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| PBS | LONZA | S1226 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermoscientific | A1110501 | |
| Other reagents: | |||
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Normal checken serum | Vector laboratory | S3000 | |
| DAPI solution | Applichem | A100,0010 | Dapi, working concentration-1 µg/mL |
| Trypan blue | Biorad | 145-0013 | |
| Trypsin | Sigma | T4049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| Formaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | ACROS | Cas No. 900-293-1 | |
| Tween 20 | Fisher Sceintific | Lot No. 160170 | |
| Ethanol | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue culture materials: | |||
| 100 mm petri dish | Thermo Scientific | ||
| 6-well plate | Thermo Scientific | ||
| 24-well plate | Thermo Scientific | ||
| T-25 flask | Thermo Scientific | ||
| T-75 flask | Thermo Scientific | ||
| 15 ml conical tube | Thermo Scientific | ||
| 50 mL conical tube | Thermo Scientific | ||
| 40 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 100 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 10 mL syring | BD | Ref no. 309604 | |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette tips | Fisher Scientific | ||
| 5 mL, 10mL, 25 mL disposible plastic pipette | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Centrufuge machine | Thermo Scientific | LEGEND X1R centrifuge | |
| EVOS microscope | Life technology | ||
| Automated cell counter | Biorad | ||
| Cell counting slide | Biorad | 145-0011 | |
| Pippte aid | Thermo Scientific | S1 pipet filler | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments: | |||
| Surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Fine surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Curve shank forceps | Fine Scientific Tool | ||
| Surgical blade | Fine Scientific Tool |
References
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146 (2017).
- Nguyen, P. K., Rhee, J. W., Wu, J. C. Adult Stem Cell Therapy and Heart Failure, 2000 to 2016: A Systematic Review. The Journal of the American Medical Association Cardiology. 1, 831-841 (2000).
- Emmert, M. Y., et al. Safety and efficacy of cardiopoietic stem cells in the treatment of post-infarction left-ventricular dysfunction - From cardioprotection to functional repair in a translational pig infarction model. Biomaterials. 122, 48-62 (2017).
- Silvestre, J. S., Menasche, P. The Evolution of the Stem Cell Theory for Heart Failure. EBioMedicine. 2, 1871-1879 (2015).
- Terzic, A., Behfar, A. Stem cell therapy for heart failure: Ensuring regenerative proficiency. Trends in Cardiovascular Medicine. 26, 395-404 (2016).
- Yamada, S., et al. Embryonic stem cell therapy of heart failure in genetic cardiomyopathy. Stem Cells. 26, 2644-2653 (2008).
- Sadek, H. A., Martin, C. M., Latif, S. S., Garry, M. G., Garry, D. J. Bone-marrow-derived side population cells for myocardial regeneration. Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 173-181 (2009).
- Vrtovec, B., et al. Effects of intracoronary CD34+ stem cell transplantation in nonischemic dilated cardiomyopathy patients: 5-year follow-up. Circulation Research. 112, 165-173 (2013).
- Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. The Journal of American Medical Association. 308, 2369-2379 (2012).
- Guijarro, D., et al. Intramyocardial transplantation of mesenchymal stromal cells for chonic myocardial ischemia and impaired left ventricular function: Results of the MESAMI 1 pilot trial. International Journal of Cardiology. 209, 258-265 (2016).
- Bobi, J., et al. Intracoronary Administration of Allogeneic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells Improves Myocardial Perfusion But Not Left Ventricle Function, in a Translational Model of Acute Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 6, (2017).
- Suzuki, E., Fujita, D., Takahashi, M., Oba, S., Nishimatsu, H. Adipose tissue-derived stem cells as a therapeutic tool for cardiovascular disease. World Journal of Cardiology. 7, 454-465 (2015).
- Gao, L. R., et al. Intracoronary infusion of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells in acute myocardial infarction: double-blind, randomized controlled trial. BMC Medicine. 13, 162 (2015).
- Simpson, D. L., et al. A strong regenerative ability of cardiac stem cells derived from neonatal hearts. Circulation. , S46-S53 (2012).
- Kazakov, A., et al. C-kit(+) resident cardiac stem cells improve left ventricular fibrosis in pressure overload. Stem Cell Research. 15, 700-711 (2015).
- Ong, S. G., et al. Cross talk of combined gene and cell therapy in ischemic heart disease: role of exosomal microRNA transfer. Circulation. 130, S60-S69 (2014).
- Sahoo, S., Losordo, D. W. Exosomes and cardiac repair after myocardial infarction. Circulation Research. 114, 333-344 (2014).
- Zhang, Z., et al. Pretreatment of Cardiac Stem Cells With Exosomes Derived From Mesenchymal Stem Cells Enhances Myocardial Repair. Journal of the American Heart Association. 5, (2016).
- Ibrahim, A. G., Cheng, K., Marban, E. Exosomes as critical agents of cardiac regeneration triggered by cell therapy. Stem Cell Reports. 2, 606-619 (2014).
- Emanueli, C., Shearn, A. I., Angelini, G. D., Sahoo, S. Exosomes and exosomal miRNAs in cardiovascular protection and repair. Vascular Pharmacology. 71, 24-30 (2015).
- Menasche, P. Cardiac cell therapy: lessons from clinical trials. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, 258-265 (2011).
- Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell Stem Cell. 17, 11-22 (2015).
- Takamiya, M., Haider, K. H., Ashaf, M. Identification and characterization of a novel multipotent sub-population of Sca-1(+) cardiac progenitor cells for myocardial regeneration. PLoS One. 6, e25265 (2011).
- Cambria, E., et al. Translational cardiac stem cell therapy: advancing from first-generation to next-generation cell types. NPJ Regenerative Medicine. 2, 17 (2017).
- Bruyneel, A. A., Sehgal, A., Malandraki-Miller, S., Carr, C. Stem Cell Therapy for the Heart: Blind Alley or Magic Bullet? Journal of Cardiovascular Translational Research. 9, 405-418 (2016).
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12, 689-698 (2013).
- Oh, H., Ito, H., Sano, S. Challenges to success in heart failure: Cardiac cell therapies in patients with heart diseases. Journal of Cardiology. 68, 361-367 (2016).
- Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9, 1662-1681 (2014).
- Rutering, J., et al. Improved Method for Isolation of Neonatal Rat Cardiomyocytes with Increased Yield of C-Kit+ Cardiac Progenitor Cells. Journal of Stem Cell Research and Therapy. 5, 1-8 (2015).
- Saravanakumar, M., Devaraj, H. Distribution and homing pattern of c-kit+ Sca-1+ CXCR4+ resident cardiac stem cells in neonatal, postnatal, and adult mouse heart. Cardiovascular Pathology. 22, 257-263 (2013).
- Monsanto, M. M., et al. Concurrent Isolation of 3 Distinct Cardiac Stem Cell Populations From a Single Human Heart Biopsy. Circulation Research. 121, 113-124 (2017).
- Vidyasekar, P., Shyamsunder, P., Santhakumar, R., Arun, R., Verma, R. S. A simplified protocol for the isolation and culture of cardiomyocytes and progenitor cells from neonatal mouse ventricles. European Journal of Cell Biology. 94, 444-452 (2015).
- Dergilev, K. V., et al. Comparison of cardiac stem cell sheets detached by Versene solution and from thermoresponsive dishes reveals similar properties of constructs. Tissue Cell. 49, 64-71 (2017).
- Zaruba, M. M., Soonpaa, M., Reuter, S., Field, L. J. Cardiomyogenic potential of C-kit(+)-expressing cells derived from neonatal and adult mouse hearts. Circulation. 121, 1992-2000 (1992).
- Wang, H., et al. Isolation and characterization of a Sca-1+/CD31- progenitor cell lineage derived from mouse heart tissue. BMC Biotechnology. 14, 75 (2014).
- Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4, 232-243 (2009).
