Summary
Det overordnede mål med denne artikel er at standardisere protokol for isolation, karakterisering og differentiering af cardiac stamceller (CSCs) fra voksne mus hjerte. Her, beskriver vi en tæthed gradient centrifugering metode til at isolere murine CSCs og omstændige metoder til CSC kultur, spredning og differentiering i cardiomyocytes.
Abstract
Myokardieinfarkt (MI) er en førende årsag til sygelighed og dødelighed i hele verden. Et vigtigt mål for regenerativ medicin er at genopbygge døde myokardiet efter MI. Selv om flere strategier har været brugt til at regenerere myokardiet, forbliver stamcelleterapi en større tilgang til at genopbygge en MI hjerte døde myokardiet. Akkumulere beviser tyder på tilstedeværelsen af fastboende hjerte stamceller (CSCs) i den voksne hjerte og deres endokrine eller paracrine påvirkning af cardiac regenerering. CSC isolation og deres karakterisering og differentiering mod Myokardie celler, især cardiomyocytes, er imidlertid fortsat en teknisk udfordring. I den foreliggende undersøgelse forudsat vi en simpel metode til isolation, karakterisering og differentiering af CSCs fra voksne mus hjerte. Her, beskriver vi en tæthed gradient metode til isolering af CSCs, hvor hjertet er fordøjet af en 0,2% collagenase II løsning. For at karakterisere de isolerede CSCs, evalueret vi udtryk for CSCs/hjertestop markører Sca-1, NKX2-5 og GATA4 og pluripotency/stemness markører OCT4, SOX2 og Nanog. Vi har også besluttet spredning potentiale af isolerede CSCs ved dyrkning dem i en petriskål og vurdere udtryk for spredning markør Ki-67. Til evaluering af CSCs differentiering potentiale, valgte vi syv - til 10 - dage kulturperler CSCs. Vi overført dem til en ny plade med en cardiomyocyte differentiering medium. De er udruget i en celle kultur inkubator for 12 dage, mens differentiering medium er ændret hver tre dage. De differentierede CSCs express cardiomyocyte-specifikke markører: actinin og troponin jeg. Således, CSCs isoleret med denne protokol har stemness og hjerte markører, og de har et potentiale for spredning og differentiering mod cardiomyocyte afstamning.
Introduction
Iskæmisk hjertesygdom, herunder myokardieinfarkt (MI), er en væsentlig årsag til død omkring verden1. Stamcelleterapi for regenererende døde myokardiet forbliver en større tilgang til at forbedre hjertefunktion en MI hjerte2,3,4,5. Forskellige typer af stamceller har været brugt til at genopbygge døde myokardiet og forbedre hjertefunktion en MI hjerte. De kan groft inddeles i embryonale stamceller6 og voksne stamceller. I voksne stamceller, har forskellige typer af stamceller været brugt, såsom knoglemarv-afledte mononukleære celler7,8, mesenkymale stamceller fra knoglemarven9,10, fedtvæv 11,12, og navlestrengen13og CSCs14,15. Stamceller kan fremme hjerte regenerering gennem endokrine og/eller paracrine handlinger16,17,18,19,20. Imidlertid en stor begrænsning af stamcelleterapi er at opnå et tilstrækkeligt antal stamceller, der kan formere sig og/eller differentiere mod en bestemt hjerte lineage21,22. Autolog og allogen transplantation af stamceller er en vigtig udfordring i stamcelle terapi9. CSCs kunne være en bedre tilgang til hjerte regenerering, fordi de stammer fra hjertet og de lettere kan opdeles i hjertets lineages end ikke-hjerte stamceller. Det nedsætter risikoen for teratom. Derudover kunne de endokrin og paracrine effekter af CSCs, såsom exosomes og miRNAs afledt af CSCs, være mere effektiv end andre typer af stamceller. Således, CSCs stadig en bedre løsning for kardiale regenerering23,24.
Selv om CSCs er en bedre kandidat til hjerte regenerering i en MI hjertet på grund af deres hjerte oprindelse, er en stor begrænsning med CSCs mindre udbytte på grund af manglen på en effektiv isolation metode. En anden begrænsning kunne være nedsat differentiering af CSCs mod cardiomyocytes lineage2,25,26,27. For at omgå disse begrænsninger, er det vigtigt at udvikle en effektiv protokol til CSC isolation, karakterisering og differentiering mod hjerte afstamning. Der er ingen enkelt acceptable markør for CSCs og en bestemt celle-overflade markør-baserede isolering af CSCs udbytter mindre CSCs. Her, standardiserer vi en simpel gradient centrifugering tilgang for at isolere CSCs fra mus hjertet, der er omkostningseffektive og resulterer i en øget afkast på CSCs. Disse isolerede CSCs kan vælges for specifikke celle-overflade markører ved fluorescens-aktiveret celle kortslutning. Ud over CSCs isolation forudsat vi en protokol til CSC kultur, karakterisering og differentiering mod cardiomyocyte afstamning. Dermed, vi præsenterer en elegant metode til at isolere, karakterisere, kultur, og differentiere CSCs fra voksne mus hjerter (figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Boliger, anæstesi og ofringen af mus blev udført efter den godkendte IACUC protokol af University of Nebraska Medical Center.
1. materialer
- Brug 10 til 12 uger gamle C57BL/6J black mandlige mus, holdt in-house på institutionelle dyr facilitet til isolering af CSCs. CSCs kan også isoleres fra ikke-gravide hunmus.
- Sterilisere alle de nødvendige kirurgiske instrumenter, herunder kirurgiske saks, fine kirurgisk saks, buet skaft pincet og en kirurgiske kniv, ved autoklavering dem før eutanasi af musen.
- Forberede CSC isolation buffere i en steriliseret tilstand og gemme dem på 4 ° C på is. Disse buffere omfatter polysucrose og en natrium diatrizoate løsningen tilpasset til en tæthed af 1.077 g/mL, ufuldstændige Dulbecco ændret Eagle's Medium, 1 x skinke afbalanceret saltopløsning (HBSS), og celle kultur-grade 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Forbered en 1% collagenase II stamopløsning (filtreret og steriliseret) og en 0,2% brugsopløsning i HBSS.
- Holde vævskultur materialer i steriliseret betingelsen i biosikkerhed kabinet, herunder en 10 mm petriskål, en 6-godt plade, en 24-godt plade, T-25 og T-75 kultur kolber, 15 mL og 50 mL konisk rør, og engangs serologisk pipetter med 40-µm og 100 -µm celle sier med 0,22 µm filtre.
- Sterilisere 10 µL, 200 µL og 1.000-µL pipette tips af autoklave.
- Bruge pudderfrie nitrilhandsker og 70% ethanol til at vedligeholde en steril tilstand i hele eksperimentet.
- Bruge 10% blegemiddel som et desinfektionsmiddel.
- Bruge kommercielt tilgængelige CSC vedligeholdelse medium og cardiomyocytes differentiering medium for kultur og differentiering af CSCs, henholdsvis.
2. isolering metode af Cardiac stamceller
- Aflive fire til fem voksne mænd (eller ikke-gravid kvinde) mus ved hjælp af et CO2 kammer. Løse hver mus arme på en separat dissektion pap med stifter eller klæbrig bånd.
- Spray 70% ethanol på musen for at slippe af med uden for bakterier og opretholde den steriliserede tilstand under høsten af hjertet. Gøre et snit med en saks i midten af underlivet og skære huden fra maven op til brystkassen i en lige linje. Fjern skindet fra begge sider af den midterste cut til klart, abdominale område af hud og hår. Ved hjælp af saks og pincet, skære mellemgulvet under brystkassen.
- Åbn brysthulen med musen ved at skære brystkasse inde i hætten. Afsløre hjertet og fjerne blod nær hjertet. Vaske området omkring hjertet med iskold PBS til at slippe af enhver blod omkring hjertet.
- Dissekere hjertet ved hjælp af kirurgiske saks og pincet. Sted midt i en 100-mm petriskål indeholdende 10 mL iskold PBS.
- Palpitate hjertet med buet skaft pincet og fjerner resterende blodet inde i hjertet.
- Bruge hele hjertet til isolering af CSCs.
- Overføre alle fire eller fem hele hjerter til en 50 mL konisk tube indeholder 10 mL af iskolde HBSS. Hold røret på is indtil videre forarbejdning.
- Tør inde i og uden for en biosikkerhed kabinet med 70% ethanol til at oprette en steriliseret miljø. Sterilisere den hjerte-holdige rør og andre nødvendige materialer med 70% ethanol. Hjerte-holdige røret anbringes i biosikkerhed kabinet til videreforarbejdning.
- Overføre hjerter til en 100-mm petriskål indeholdende 10 mL iskold HBSS. Vask hjerter igen af føles for at fjerne enhver resterende blodet inde i hjertet. Ændre HBSS løsningen efter hver vask til at sikre en fuldstændig fjernelse af blod.
- Skær hjerterne i små stykker ved hjælp af fine kirurgisk saks eller en kirurgiske kniv i en 100-mm petriskål indeholdende 5-7 mL af HBSS løsning. Hold hvert hjerte med et par pincet og brug et par kirurgisk fine sakse eller en kirurgiske kniv til at skære hjertet i 2 - 4 mm stykker. Ændre HBSS løsningen ofte for at sikre, at blod-gratis HBSS. Hakkekød hjerter i HBSS-løsningen.
- Der centrifugeres hakket vævet på 500 x g ved 4 ° C i 5 min. Fjern supernatanten og holde pelleten.
- Resuspenderes i 5-6 mL 0,2% collagenase II løsning i en 50 mL konisk slange. Mængden af collagenase løsning bør være næsten 1,5 - til 2 - gange til omfanget af toerstoffet.
Bemærk: For fordøjelsen af væv, 0,2% collagenase 2,5 U/mL dispase løsning og jeg kan erstatte 0,2% collagenase II. Bruge en næsten lige saa stort volumen af dispase løsning til collagenase jeg løsning. - Blandes grundigt pellet med 0,2% collagenase II løsning af agiterer røret eller af vuggende røret på en shaker på 75 x g i 45-60 minutter ved 37 ° C. Rystes glasset kraftigt med Haanden efter hver 20-30 min til at forbedre lysering.
- Hakkede mængden væv blandingen ved hjælp af 5 mL serologisk pipette og en 1 mL pipette tip for at adskille væv klumper i encellede suspension.
Bemærk: For at få maksimal nyttiggørelse af CSCs, hakkede lysis blandingen i mindst 5 min. Hvis væv klumper er relativt store, skåret spidsen af en 1-mL pipette spids med en saks eller en kirurgiske kniv og bruge det til ændring. - Stoppe den enzymatiske lysering af væv ved at tilføje kommercielt tilgængelige CSC vedligeholdelse medium. Tilføj næsten 2-3 x så meget vedligeholdelse medium som mængden af det lysed væv i trin 2.14.
- Passere den fordøjede cellesuspension gennem en 100 µm celle si til at fjerne enhver ufordøjet væv stykker.
- Gentag trin 2.16 ved hjælp af en 40-µm celle si.
- Separate celler gennem tæthed gradient centrifugering. For separation af celler, forsigtigt overlejre et lige saa stort volumen af filtratet over polysucrose og natrium diatrizoate løsning. For eksempel, først, tilsættes 20 mL af polysucrose og natrium diatrizoate løsning i en 50 mL konisk slange og derefter tilføje 20 mL af filtratet fra trin 2.17 over polysucrose og natrium diatrizoate løsningen.
Bemærk: Prewarm polysucrose og natrium diatrizoate løsning ved 37 ° C før brug med celler. Tilføje filtratet fra trin 2.17 over polysucrose og natrium diatrizoate løsningen meget forsigtigt og langsomt til at undgå enhver sammenblanding af de to løsninger. Dette anses for at være et afgørende skridt. - Der centrifugeres i røret, der indeholder begge løsninger på 500 x g i 20 min. ved stuetemperatur ved hjælp af en swing spand centrifuge. Sæt centrifugen med en lavere hastighed, acceleration og deceleration at undgå at blande de to løsninger og for passende adskillelse af CSCs. Dette er et vigtigt skridt i CSC isolation. Lægge røret som indeholder gradient blandingen meget langsomt uden forstyrrelse inde i centrifugen og sæt den til centrifugering.
- Tegne buffy coat sammen med ekstra løsning fra det øverste lag ved hjælp af enten en 1 mL pipette eller en plastic Pasteur afpipetteres i en 15 mL steriliseret tube. Denne buffy lag vil indeholde CSCs.
Bemærk: Tage ekstra forholdsregler under Pipettering af buffy coat ikke at tegne polysucrose og natrium diatrizoate løsning lag, fordi det er giftigt for CSCs. - Tilføje et lige saa stort volumen af CSC vedligeholdelse medium til cellesuspension fra trin 2.20 og bland det ordentligt for at neutralisere de resterende polysucrose og natrium diatrizoate løsning, hvis den findes.
- Der centrifugeres i ovenstående cellesuspension ved 500 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten.
- Resuspenderes i 7-10 mL af ufuldstændig DMEM medium og centrifugeres ved 500 x g i 5 min. ved 4 ° C for at slippe af enhver resterende polysucrose og natrium diatrizoate løsning.
- Indsamle pellet, som indeholder de renset CSCs.
- Resuspenderes i 1 mL af CSC vedligeholdelse medium, antal CSC, og bruge pelleten for kultur. Hvis du vil tælle CSC antallet, brug Trypan blå farvning og en hemocytometer. Med fire mandlige mus hjerter er udbyttet af CSCs ~1.8 mio.
- Frø CSCs i en 6-godt kultur plade belagt med en 0.02% gelatine oploesning indeholdende 0,5% fibronektin. Brug 2 mL af komplet vedligeholdelse medium for såning. Inkuber kultur plade i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO2.
- Erstatte kultur CSCs medium med komplet CSC vedligeholdelse medium hver dag indtil den tredje dag. Efter dette, skal du ændre medium på alternative dage.
- Bestemme væksten af CSCs ved at observere dem under et mikroskop.
3. kultur vedligeholdelse og Passage af Cardiac stamceller
- Kultur de isolerede CSCs i et kommercielt tilgængelige vedligeholdelse medium. Erstatte næringssubstratet med friske vedligeholdelse medium på alternative dage. Når CSC kultur har nået confluency, overføre CSCs til en ny plade belagt med gelatine og fibronektin, som nævnt i trin 2.26. Frigøre de kulturperler CSCs af enzymatisk celle dissociation buffer. Følg standardprotokol for celle dissociation fra kultur plade. På dette tidspunkt betragtes CSCs på passage 0 (P0) fase.
- Kultur P0 CSCs i en ny gelatine og fibronektin-belagt plade i komplet CSC vedligeholdelse medium ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator, tillader dem at være sammenflydende, og følg derefter trin 3.1 at få passage 1 (P1) CSCs. Store P1 CSCs i flydende nitrogen eller bruge dem til erfaringer menter.
- Frø 0,5 millioner celler i en 6-godt plade eller 1 million celler i T-25 at opretholde CSC kultur i sin indledende fase.
- Passage CSCs når de bliver 85-90% sammenflydende. CSCs kan være kulturperler i vedligeholdelse medium op til fire til seks uger.
Bemærk: Hold den indledende seeding tæthed af CSCs relativt høj (40% - 50%), fordi på en lavere seeding tæthed, CSCs kan ændre deres morfologi til at flade og aflang.
4. Karakteristik af Cardiac stamceller
- For at karakterisere de kulturperler CSCs, overholde dem under en phage-kontrast eller lysfelt mikroskop. CSC-holdige pladen anbringes på målsætningen om en fluorescerende mikroskop. Angive forstørrelsen temmelig lav (10 X) at fokusere cellerne. Bruge fasekontrast blænde til at observere cellerne. Øge forstørrelsen til 20 X ved at ændre mål linse og image CSCs. stigning mål til 40 X og billed CSCs. I to dage, CSCs vises næsten runde i formen, men størrelsen af cellen stiger med tiden, og i syv dage, CSCs vises næsten cylindrisk form (figur 1A - 1 C).
- Udføre immunfarvning af CSCs med markører for pluripotency/stemness (OCT4, SOX2 eller Nanog), spredning (Ki-67) (figur 2A - 2D) og hjerte oprindelse-/ stamceller (Sca-1, NKX2-5 eller GATA4) (figur 3A - 3 C).
- Immunfarvning af CSCs seed 10.000 CSCs i en 24-godt kultur plade.
- Den næste dag (efter 18-24 h), lave CSCs i 300 µL af 4% PARAFORMALDEHYD i 10 min.
- Vaske CSCs med 500 µL af iskold PBS, 3 x med 5 min. mellemrum.
- Permeabilize CSCs med 300 µL af 0,2% Triton X-100 fortyndes i PBS i 10 min.
- Vaske CSCs med 500 µL af iskold PBS, 3 x med 5 min. mellemrum.
- Udføre blokering af CSCs med 300 µL 1% BSA fortyndet i PBST (PBS + 0,1% Tween 20) eller 300 µL af 10% normal kylling serum fortyndet i PBST for 1 h.
- Inkuber CSCs i 200 µL af primære antistof fortyndet i blokerende løsning natten over ved 4 ° C. Fortynd den primære antistof, som anbefalet af dataarket af antistoffer eller som standardisering.
- Vaske CSCs med 500 µL af iskold PBS, 3 x med 5 min. mellemrum.
- Inkuber CSCs i 200 µL af sekundær antistof fortyndet i blokerende løsning (Se trin 4.2.6) i 1 time ved stuetemperatur. Fortynd den sekundær antistof, som anbefalet af dataarket af antistoffer eller som standardisering.
- Vaske CSCs med 500 µL af iskold PBS, 3 x med 5 min. mellemrum.
- Counterstain CSCs med 200 µL af DAPI (1 µg/mL) fortyndet i PBS i 5 min.
- Vaske CSCs 1 x med 500 µL af iskold PBS. Tilføj derefter 300 µL af iskold PBS i hvert hul.
- Udføre imaging ved hjælp af et fluorescens mikroskop. Følg vejledningen i fluorescerende imaging, såsom at undgå direkte lys på pladen. Holde kultur plade under mikroskop. Fokusere celler ved forskellige forstørrelser. Observere celler under fase-kontrast og/eller forskellige excitation filtre og gemme billederne.
- Gemme pladen i mørke ved 4 ° C.
5. differentiering af Cardiac stamceller i Cardiomyocyte
- Differentiering af CSCs seed 500.000 CSCs i en 6-godt plade med 2 mL af prewarm (37 ° C) kommercielt tilgængelige CSC vedligeholdelse medium.
- Inkuber pladen som indeholder CSCs i en CO2 inkubator ved 37 ° C. Tillad CSCs vedhæfte og formere sig indtil sub sammenflydende vækst. Hvis mediet bliver gul, erstatte næringssubstratet med friske vedligeholdelse medium.
- På 85-90% confluency, erstatte vedligeholdelse medium med 2 mL af prewarm (37 ° C) cardiomyocytes differentiering medium. Inkuber plade i en CO2 inkubator ved 37 ° C i op til 2-3 uger.
- Ændre differentiering mellem hver 2-3 d. observere CSCs' morfologi under et mikroskop hver gang under medium ændres for at sikre god dyrkningsbetingelserne.
- Efter 12 d i CSC kultur i differentiering medium, billede CSCs for differentiering markører efter en standard immunfarvning protokol (Se trin 4.2.1 - 4.2.14). Gem den fluorescerende billeder nemlig udtryk for cardiomyocytes markører (figur 4A - 4B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den foreliggende undersøgelse isoleret vi CSCs fra 10 til 12 uger gamle C57BL/6J mandlige mus hjerter. Her har vi præsenteret en simpel metode til CSC isolering og karakterisering ved hjælp af markører for pluripotency. Vi præsenterede også en elegant metode til CSC differentiering og karakterisering af CSCs, der opdelte mod cardiomyocytes afstamning. Vi observerede en spindel figur morfologi af 2 - til 3-dage-kulturperler CSCs under et fasekontrast mikroskop (figur 1A og 1B). Vi har fundet en ændring i morfologi af CSCs på 7 dage af kultur i vedligeholdelse medium, i hvilket tidsrum stamcellerne blevet aflange (figur 1 c). Vi kendetegnet CSCs for markører for pluripotency og fundet, at de giver udtryk for OCT4, SOX2 og Nanog (figur 2A - 2 C). Vi fandt også, at CSCs formere dyrkningsmedium og express spredning markør Ki-67 (figur 2D). For at karakterisere CSCs hjerte oprindelse, bestemt vi udtryk for hjertets markører Sca-1, NKX2-5 og GATA4 i CSCs. Vi fandt et udtryk for hjertets markører i de kulturperler CSCs (figur 3A - 3 C). For at bestemme differentiering af CSCs mod cardiomyocyte afstamning, kulturperler vi CSCs i cardiomyocyte differentiering medium i 12 dage. Efter 12 dage, vi fotograferet de differentierede CSCs cardiomyocyte markører actinin og troponin jeg. Vi observerede, at cardiomyocyte markører kom til udtryk i differentierede CSCs (figur 4A - 4B). Samlet, disse resultater viser, at vi med held isoleret CSCs fra mus hjerte, og at disse CSCs kan formere sig og differentiere mod cardiomyocytes afstamning.
Figur 1: morfologi af kulturperler CSCs. Disse paneler viser fasekontrast billeddannelse af kulturperler CSCs, nemlig repræsentant CSCs efter 2 dages dyrkning i vedligeholdelse medium på (A1) 20 X og (A2) 40 X mål, repræsentant CSCs efter 3 dages dyrkning i vedligeholdelse medium på) B1) 20 X og (B2) 40 X mål og repræsentant CSCs efter 7 dages dyrkning i vedligeholdelse medium på (C1) 20 X og (C2) 40 X mål. Skala barer er 100 µm for de 40 X Forstørrelse og 200 µm til 20 X forstørrelse.
Figur 2: karakterisering af CSCs for pluripotency markører. Disse paneler viser repræsentative fluorescens billeddannelse af kulturperler CSCs for markører for pluripotency (OCT4, SOX2 og Nanog) og spredning (Ki-67). Paneler A Vis udtryk for OCT4 (grøn) og DAPI (blå) i CSCs på (A1) 20 X og (A2) 40 X forstørrelse. Paneler B Vis udtryk for SOX2 (grøn) og DAPI (blå) i CSCs på (B1) 20 X og (B2) 40 X forstørrelse. Paneler C Vis udtryk for Nanog (grøn) og DAPI (blå) i CSCs på (C1) 20 X og (C2) 40 X forstørrelse. Paneler D Vis udtryk for Ki-67 (rød) og DAPI (blå) i CSCs på (D1) 20 X og (D2) 40 X forstørrelse. Skala barer er 100 µm for de 40 X Forstørrelse og 200 µm til 20 X forstørrelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: karakterisering af CSCs for kardiale markører. Disse paneler viser repræsentative fluorescens billeddannelse af kulturperler CSCs for kardiale markører. Paneler A Vis udtryk for Sca-1 (rød) og DAPI (blå) i CSCs på (A1) 20 X og (A2) 40 X forstørrelse. Paneler B viser udtryk af NKX2-5 (grøn) og DAPI (blå) i CSCs på (B1) 20 X og (B2) 40 X forstørrelse. Paneler C Vis udtryk for GATA4 (rød) og DAPI (blå) i CSCs på (C1) 20 X og (C2) 40 X forstørrelse. Skala barer er 100 µm for de 40 X Forstørrelse og 200 µm til 20 X forstørrelse.
Figur 4: karakterisering af CSC differentiering mod cardiomyocyte slægt. Disse paneler viser repræsentant fase-kontrast og fluorescens billeddannelse af 12-dage opdelte CSCs. (A) dette panel viser cardiomyocyte markør actinin udtryk i differentierede CSCs med (a) en fase-kontrakt billede, (b ) et fluorescens billede af DAPI (farvnings-kerne), (c) et fluorescens billede af actinin (grøn) og (d) en flettede billede af paneler en - c. Forstørrelser er 40 X. (B) dette panel viser udtryk for den cardiomyocyte markør troponin I opdelte CSCs, med (en) et fase-kontrakt billede, (b) et fluorescens billede af DAPI (farvnings-kerne), (c) et fluorescens billede af troponin jeg (grøn), og (d) en flettede billede af paneler en - c. Forstørrelser er 40 X. Skala barer er 100 µm for de 40 X Forstørrelse og 200 µm til 20 X forstørrelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: skematisk fremstilling af de forskellige trin i CSC isolation, kultur og differentiering. Vi brugte kirurgisk fjernet hjerter fra fire til fem voksne mus til isolering af CSCs. Den trinvis proces af CSC isolation, kultur og differentiering mod cardiomyocytes lineages præsenteres. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin i protokollens CSC isolation er som følger. 1) en steriliseret tilstand skal opretholdes for udvinding af hjerter fra mus. Enhver forurening under hjertet udvinding kan forringe kvaliteten af CSCs. 2) blodet skal fjernes helt, før hakningen hjerte, der er udført af flere skylninger af hele hjertet og hjertet stykker med HBSS løsning. 3) hjerte stykker skal være helt mængden i en enkelt celle suspension med collagenase løsning. 4) den polysucrose og natrium diatrizoate gradient løsning til separation af celler skal være forvarmet. 5) medium for CSC kultur skal være forvarmet. 6) sammenløbet af CSCs under såning i en kultur parabol bør være høj, fordi i lav confluency, CSCs kan ændre deres morfologi. 7) CSC antallet bør være scorede efter isolation fra hjertet og før plating i en kultur skål. Antallet af CSCs angiver effektiviteten af isolation fra hjertet. Optællingen af CSCs er vigtigt for såning af CSCs i kultur plade.
Vi brugte voksne mus for at isolere CSCs, som er blevet brugt af andre efterforskere i gnavere modeller23,28. CSCs kan isoleres fra neonatal gnaver hjerter29,30 og endda fra biopsi af et menneskehjerte31. De tidligere rapporterede CSC isolation protokoller har nogle begrænsninger, såsom mindre udbytte, en kompleks isolation procedure, en lang varighed for differentiering og mindre cardiomyocyte differentiering potentielle32,33, 34. den CSC isolation protokol præsenteres her er simpelt: det tager mindre tid og er omkostningseffektivt og mere effektiv i CSC udbytte. Desuden de isolerede CSCs er Sca-1+ ve (godt accepteret markør for musen CSCs) (tal 1A1 - 3 c 2). For differentiering af CSCs skal andre protokoller tre til fire uger35,36. Denne protokol kræver imidlertid 12 dage (tal 4A - 4B). Den gradient centrifugering-baserede CSC isolation præsenteres her udbytter ~1.8 million CSCs fra fire mandlige mus hjerter.
Selv om udbyttet af CSCs er høj, er en begrænsning af denne protokol ensartethed og renhed af de isolerede CSCs. Fordi der er ingen enkelt acceptable markør for CSCs, er det svært at bruge en single-celleoverfladen markør til at vælge CSCs. CSCs isoleret af denne protokol kan dog bruges til at opnå en ensartet befolkning på CSCs baseret på en specifik markør eller flere markører for CSCs, ved hjælp af fluorescens-aktiveret celle sortering. Således, denne metode til CSC isolation er omkostningseffektiv med et højt udbytte og har mulighed for at få en ensartet CSC befolkning baseret på specifikke celleoverfladen marker(s).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde er i dele, støttet af National Institutes of Health tilskud HL-113281 og HL116205 til Paras Kumar Mishra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson laboratory, USA | Stock no. 000664 | |
| Antibodies: | |||
| OCT4- | Abcam | ab18976 (rabbit polyclonal) | OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| SOX2 | Abcam | ab97959 (rabbit polyclonal) | SOX2-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Nanog | Abcam | ab80892 (rabbit polyclonal) | Nanog-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Ki67 | Abcam | ab16667 (rabbit polyclonal) | Ki67-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Sca I | Millipore | AB4336 (rabbit polyclonal) | Sca I Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| NKX2-5 | Santa Cruz | sc-8697 (goat polyclonal) | NKX2-5-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| GATA4 | Abcam | ab84593 (rabbit polyclonal) | GATA4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| MEF2C | Santa Cruz | sc-13268 (goat polyclonal) | MEF2C-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Troponin I | Millipore | MAB1691 (mouse monoclonal) | Troponin I-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Actinin | Millipore | MAB1682 (mouse monoclonal) | Actinin-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| ANP | Millipore | AB5490 (mouse polyclonal) | ANP-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Alex Fluor-488 checken anti-rabbit | Life technology | Ref no. A21441 | |
| Alex Fluor-594 goat anti-rabbit | Life technology | Ref no. A11012 | |
| Alex Fluor-594 rabbit anti-goat | Life technology | Ref no. A11078 | |
| Alex Fluor-488 checken anti-mouse | Life technology | Ref no. A21200 | |
| Alex Fluor-594 checken anti-goat | Life technology | Ref no. A21468 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture medium: | |||
| CSC maintenance medium | Millipore | SCM101 | Note: For CSC culture, PBS or incomplete DMEM medium was used for washing the cells |
| cardiomyocytes differentiation medium | Millipore | SCM102 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Isolation buffer: | |||
| polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077) | Sigma | 10771 | |
| HBSS | Gibco | 2018-03 | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Dispase solution | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| PBS | LONZA | S1226 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermoscientific | A1110501 | |
| Other reagents: | |||
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Normal checken serum | Vector laboratory | S3000 | |
| DAPI solution | Applichem | A100,0010 | Dapi, working concentration-1 µg/mL |
| Trypan blue | Biorad | 145-0013 | |
| Trypsin | Sigma | T4049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| Formaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | ACROS | Cas No. 900-293-1 | |
| Tween 20 | Fisher Sceintific | Lot No. 160170 | |
| Ethanol | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue culture materials: | |||
| 100 mm petri dish | Thermo Scientific | ||
| 6-well plate | Thermo Scientific | ||
| 24-well plate | Thermo Scientific | ||
| T-25 flask | Thermo Scientific | ||
| T-75 flask | Thermo Scientific | ||
| 15 ml conical tube | Thermo Scientific | ||
| 50 mL conical tube | Thermo Scientific | ||
| 40 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 100 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 10 mL syring | BD | Ref no. 309604 | |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette tips | Fisher Scientific | ||
| 5 mL, 10mL, 25 mL disposible plastic pipette | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Centrufuge machine | Thermo Scientific | LEGEND X1R centrifuge | |
| EVOS microscope | Life technology | ||
| Automated cell counter | Biorad | ||
| Cell counting slide | Biorad | 145-0011 | |
| Pippte aid | Thermo Scientific | S1 pipet filler | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments: | |||
| Surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Fine surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Curve shank forceps | Fine Scientific Tool | ||
| Surgical blade | Fine Scientific Tool |
References
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146 (2017).
- Nguyen, P. K., Rhee, J. W., Wu, J. C. Adult Stem Cell Therapy and Heart Failure, 2000 to 2016: A Systematic Review. The Journal of the American Medical Association Cardiology. 1, 831-841 (2000).
- Emmert, M. Y., et al. Safety and efficacy of cardiopoietic stem cells in the treatment of post-infarction left-ventricular dysfunction - From cardioprotection to functional repair in a translational pig infarction model. Biomaterials. 122, 48-62 (2017).
- Silvestre, J. S., Menasche, P. The Evolution of the Stem Cell Theory for Heart Failure. EBioMedicine. 2, 1871-1879 (2015).
- Terzic, A., Behfar, A. Stem cell therapy for heart failure: Ensuring regenerative proficiency. Trends in Cardiovascular Medicine. 26, 395-404 (2016).
- Yamada, S., et al. Embryonic stem cell therapy of heart failure in genetic cardiomyopathy. Stem Cells. 26, 2644-2653 (2008).
- Sadek, H. A., Martin, C. M., Latif, S. S., Garry, M. G., Garry, D. J. Bone-marrow-derived side population cells for myocardial regeneration. Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 173-181 (2009).
- Vrtovec, B., et al. Effects of intracoronary CD34+ stem cell transplantation in nonischemic dilated cardiomyopathy patients: 5-year follow-up. Circulation Research. 112, 165-173 (2013).
- Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. The Journal of American Medical Association. 308, 2369-2379 (2012).
- Guijarro, D., et al. Intramyocardial transplantation of mesenchymal stromal cells for chonic myocardial ischemia and impaired left ventricular function: Results of the MESAMI 1 pilot trial. International Journal of Cardiology. 209, 258-265 (2016).
- Bobi, J., et al. Intracoronary Administration of Allogeneic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells Improves Myocardial Perfusion But Not Left Ventricle Function, in a Translational Model of Acute Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 6, (2017).
- Suzuki, E., Fujita, D., Takahashi, M., Oba, S., Nishimatsu, H. Adipose tissue-derived stem cells as a therapeutic tool for cardiovascular disease. World Journal of Cardiology. 7, 454-465 (2015).
- Gao, L. R., et al. Intracoronary infusion of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells in acute myocardial infarction: double-blind, randomized controlled trial. BMC Medicine. 13, 162 (2015).
- Simpson, D. L., et al. A strong regenerative ability of cardiac stem cells derived from neonatal hearts. Circulation. , S46-S53 (2012).
- Kazakov, A., et al. C-kit(+) resident cardiac stem cells improve left ventricular fibrosis in pressure overload. Stem Cell Research. 15, 700-711 (2015).
- Ong, S. G., et al. Cross talk of combined gene and cell therapy in ischemic heart disease: role of exosomal microRNA transfer. Circulation. 130, S60-S69 (2014).
- Sahoo, S., Losordo, D. W. Exosomes and cardiac repair after myocardial infarction. Circulation Research. 114, 333-344 (2014).
- Zhang, Z., et al. Pretreatment of Cardiac Stem Cells With Exosomes Derived From Mesenchymal Stem Cells Enhances Myocardial Repair. Journal of the American Heart Association. 5, (2016).
- Ibrahim, A. G., Cheng, K., Marban, E. Exosomes as critical agents of cardiac regeneration triggered by cell therapy. Stem Cell Reports. 2, 606-619 (2014).
- Emanueli, C., Shearn, A. I., Angelini, G. D., Sahoo, S. Exosomes and exosomal miRNAs in cardiovascular protection and repair. Vascular Pharmacology. 71, 24-30 (2015).
- Menasche, P. Cardiac cell therapy: lessons from clinical trials. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, 258-265 (2011).
- Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell Stem Cell. 17, 11-22 (2015).
- Takamiya, M., Haider, K. H., Ashaf, M. Identification and characterization of a novel multipotent sub-population of Sca-1(+) cardiac progenitor cells for myocardial regeneration. PLoS One. 6, e25265 (2011).
- Cambria, E., et al. Translational cardiac stem cell therapy: advancing from first-generation to next-generation cell types. NPJ Regenerative Medicine. 2, 17 (2017).
- Bruyneel, A. A., Sehgal, A., Malandraki-Miller, S., Carr, C. Stem Cell Therapy for the Heart: Blind Alley or Magic Bullet? Journal of Cardiovascular Translational Research. 9, 405-418 (2016).
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12, 689-698 (2013).
- Oh, H., Ito, H., Sano, S. Challenges to success in heart failure: Cardiac cell therapies in patients with heart diseases. Journal of Cardiology. 68, 361-367 (2016).
- Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9, 1662-1681 (2014).
- Rutering, J., et al. Improved Method for Isolation of Neonatal Rat Cardiomyocytes with Increased Yield of C-Kit+ Cardiac Progenitor Cells. Journal of Stem Cell Research and Therapy. 5, 1-8 (2015).
- Saravanakumar, M., Devaraj, H. Distribution and homing pattern of c-kit+ Sca-1+ CXCR4+ resident cardiac stem cells in neonatal, postnatal, and adult mouse heart. Cardiovascular Pathology. 22, 257-263 (2013).
- Monsanto, M. M., et al. Concurrent Isolation of 3 Distinct Cardiac Stem Cell Populations From a Single Human Heart Biopsy. Circulation Research. 121, 113-124 (2017).
- Vidyasekar, P., Shyamsunder, P., Santhakumar, R., Arun, R., Verma, R. S. A simplified protocol for the isolation and culture of cardiomyocytes and progenitor cells from neonatal mouse ventricles. European Journal of Cell Biology. 94, 444-452 (2015).
- Dergilev, K. V., et al. Comparison of cardiac stem cell sheets detached by Versene solution and from thermoresponsive dishes reveals similar properties of constructs. Tissue Cell. 49, 64-71 (2017).
- Zaruba, M. M., Soonpaa, M., Reuter, S., Field, L. J. Cardiomyogenic potential of C-kit(+)-expressing cells derived from neonatal and adult mouse hearts. Circulation. 121, 1992-2000 (1992).
- Wang, H., et al. Isolation and characterization of a Sca-1+/CD31- progenitor cell lineage derived from mouse heart tissue. BMC Biotechnology. 14, 75 (2014).
- Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4, 232-243 (2009).
