Summary
O objetivo geral deste artigo é a padronização do protocolo para o isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco cardíacas (CSCs) do fundo do coração de rato adulto. Aqui, descrevemos um método de centrifugação gradiente de densidade para isolar murino CSCs e métodos elaborados para CSC cultura, proliferação e diferenciação em cardiomyocytes.
Abstract
Infarto do miocárdio (MI) é das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Dos principais objetivos da medicina regenerativa é reabastecer o miocárdio morto depois de MI. Embora várias estratégias têm sido usadas para regenerar o miocárdio, terapia de células-tronco permanece uma grande abordagem para reabastecer o miocárdio morto de um coração de MI. Acumular evidências sugere a presença de células-tronco cardíacas (CSCs) residentes no coração adulto e seus efeitos endócrinas e/ou parácrina sobre regeneração cardíaca. No entanto, o isolamento do CSC e sua caracterização e diferenciação para células do miocárdio, especialmente cardiomyocytes, permanece um desafio técnico. No presente estudo, nós fornecemos um método simples para o isolamento, caracterização e diferenciação do CSCs do coração de rato adulto. Aqui, descrevemos um método de gradiente de densidade para a isolação do CSCs, onde o coração é digerido por uma solução II de colagenase de 0,2%. Para caracterizar os CSCs isolados, avaliamos a expressão de marcadores de CSCs/cardíaco Sca-1, NKX2-5 e GATA4 e marcadores de pluripotência/stemness OCT4, SOX2 e Nanog. Nós também determinou o potencial de proliferação de CSCs isolados cultivo-os em um prato de Petri e avaliando a expressão do marcador de proliferação Ki-67. Para avaliar o potencial de diferenciação de CSCs, selecionamos sete a dez dias cultivada CSCs. Estamos transferindo-os para uma nova placa com meio de diferenciação de casos. Eles são incubados em um incubador de cultura celular durante 12 dias, enquanto meio de diferenciação é trocado a cada três dias. Os CSCs diferenciados expressam marcadores de casos específicos: actinin e troponina eu. Assim, CSCs isolados com este protocolo tem stemness e marcadores cardíacos, e eles têm um potencial de proliferação e diferenciação em direção a linhagem de casos.
Introduction
Doença isquêmica do coração, incluindo infarto do miocárdio (MI), é das principais causas de morte em torno do mundo1. Terapia de células-tronco para regenerar o miocárdio morto continua a ser uma grande abordagem para melhorar a função cardíaca de um MI coração2,3,4,5. Diferentes tipos de células-tronco utilizaram para reabastecer o miocárdio morto e para melhorar a função cardíaca de um coração de MI. Eles podem ser amplamente classificados em células-tronco células-tronco embrionárias6 e adulto. Em células-tronco adultas, têm sido utilizados vários tipos de células-tronco, tais como células mononucleares de medula óssea-derivado7,8, células-tronco mesenquimais derivadas de medula óssea9,10, tecido adiposo 11,12e cordão umbilical13e CSCs14,15. Células-tronco podem promover regeneração cardíaca através do sistema endócrino e/ou parácrina ações16,17,18,19,20. No entanto, uma limitação importante da terapia de células-tronco está obtendo um número adequado de células-tronco que podem proliferar e/ou diferenciar-se em direção a uma linhagem cardíacas específicas21,22. Transplante autólogo e alogênico de células-tronco é um desafio importante na terapia de células-tronco9. CSCs poderiam ser uma melhor abordagem para regeneração cardíaca porque eles são derivados de coração e eles podem ser mais facilmente diferenciados em linhagens cardíacas do que as células-tronco não cardíaca. Assim, reduz o risco de teratoma. Além disso, os efeitos de glândula endócrina e parácrina da CSCs, tais como exosomes e miRNAs derivados os CSCs, poderiam ser mais eficazes do que outros tipos de células-tronco. Assim, CSCs continua a ser uma opção melhor para regeneração cardíaca23,24.
Embora CSCs são um candidato melhor para regeneração cardíaca em um coração MI devido a sua origem cardíaca, uma limitação principal com CSCs é menos rendimento devido à falta de um método eficiente de isolamento. Uma outra limitação pode ser a diferenciação prejudicada dos CSCs em direção cardiomyocytes lineage2,25,26,27. Para contornar essas limitações, é importante desenvolver um protocolo eficiente para CSC isolamento, caracterização e diferenciação no sentido de linhagem cardíaca. Não há nenhum marcador único aceitável para CSCs e um específico da pilha-superfície marcador de isolamento de CSCs produz menos CSCs. Aqui, podemos padronizar uma abordagem simples centrifugação gradiente para isolar CSCs partir o coração de rato que é cost-effective e resulta em um maior rendimento do CSCs. Estes CSCs isolados podem ser selecionados para marcadores de superfície celular específicos por fluorescência-ativado da pilha curto-circuito. Além do isolamento de CSCs, nós fornecemos um protocolo para CSC cultura, caracterização e diferenciação no sentido de linhagem de casos. Assim, apresentamos um método elegante para isolar, caracterizar, cultura e diferenciar CSCs de corações de rato adulto (Figura 5).
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Protocol
A habitação, anestesia e sacrifício de ratos foram realizados seguindo o protocolo aprovado IACUC do centro médico da Universidade de Nebraska.
1. materiais
- Uso 10 a 12-semanas C57BL/6J preto camundongos machos, mantidos internamente à instalação de animais institucional, para o isolamento de CSCs. CSCs podem também ser isolado de ratos fêmeas não-grávidas.
- Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos necessários, incluindo tesouras cirúrgicas, bem tesoura cirúrgica, pinça de haste curvada e uma lâmina cirúrgica, por autoclavagem-los antes da eutanásia do mouse.
- Preparar os buffers de isolamento CSC em uma condição esterilizada e armazená-los em 4 ° C no gelo. Esses buffers incluem polysucrose e uma solução de diatrizoate de sódio ajustada para uma densidade de 1,077 g/mL, Dulbecco incompleta modificado médio da águia, do 1 x presunto balanceamento de solução salina (HBSS) e cultura-grau 1 x tampão fosfato salino (PBS) da pilha. Prepare uma solução 1% colagenase II estoque (filtrada e esterilizada) e uma solução de trabalho de 0,2% em HBSS.
- Mantenha os materiais de cultura de tecidos na condição esterilizada na biossegurança do gabinete, incluindo um prato de Petri de 10 mm, uma placa 6, uma placa 24, T-25 e T-75 frascos de cultura, tubos cônicos de 15 mL e 50 mL e pipetas descartáveis com 40 µm e 100 -filtros de célula µm com filtros de 0,22 µm.
- Esterilize a 10 µ l, 200 µ l e pontas de pipetas 1.000 µ l por autoclave.
- Utilize luvas de nitrilo sem pó e etanol a 70% para manter uma condição estéril durante todo o experimento.
- Use água sanitária 10% como um desinfetante.
- Use comercialmente disponível meio de manutenção do CSC e cardiomyocytes meio de diferenciação para a cultura e a diferenciação de CSCs, respectivamente.
2. método isolamento de células-tronco cardíacas
- Eutanásia em quatro ou cinco adulto do sexo masculino (ou feminino não grávidas) ratos utilizando uma câmara de2 CO. Consertar armas do cada rato em um cartão separado dissecação com pinos ou fitas adesivas.
- Pulverize o etanol a 70% sobre o mouse para se livrar dos germes externos e manter a condição esterilizada durante a colheita do coração. Fazer uma incisão com uma tesoura no meio do abdômen e cortar a pele do abdômen até o tórax em linha reta. Retire a pele de ambos os lados do corte médio para limpar a área abdominal de pele e pelos. Usando uma tesoura e pinça, corte o diafragma abaixo da caixa torácica.
- Abra a cavidade torácica do mouse pelo corte da caixa torácica dentro do capô. Expor o coração e remover o sangue perto do coração. Lave a área circundante do coração com PBS gelado para se livrar de qualquer sangue nas proximidades do coração.
- Disse o coração usando uma pinça e tesoura cirúrgica. Coloque o coração em um prato de Petri de 100mm contendo 10 mL de PBS gelado.
- Palpitar o coração usando pinça haste curvada e remover o sangue residual dentro do coração.
- Use o coração inteiro para o isolamento do CSCs.
- Transferi todos os quatro ou cinco corações todo para um tubo cónico de 50 mL contendo 10 mL de HBSS gelada. Mantenha o tubo no gelo até o processamento adicional.
- Limpe dentro e fora da Biossegurança armário com etanol a 70% para criar um ambiente esterilizado. Esterilize o tubo que contém o coração e outros materiais necessários com etanol a 70%. Coloca o tubo que contém o coração a biossegurança do armário para processamento adicional.
- Transferi os corações para um prato de Petri-100mm contendo 10 mL de HBSS gelada. Lave novamente os corações por palpar para remover qualquer sangue residual dentro do coração. Altere a solução HBSS depois de cada lavagem para garantir a remoção completa do sangue.
- Corte os corações em pedaços pequenos, usando uma tesoura cirúrgica fina ou uma lâmina cirúrgica em um prato de Petri-100mm contendo 5-7 mL de solução HBSS. Segure cada coração com um par de pinças e usar um par de tesouras cirúrgicas de bem ou uma lâmina de cortar o coração em pedaços de 2 a 4 mm. Altere a solução HBSS com frequência para garantir HBSS livre de sangue. Picar os corações na solução HBSS.
- Centrifugue o tecido picado em 500 x g a 4 ° C por 5 min. descartar o sobrenadante e manter a pelota.
- Resuspenda o pellet em 5-6 mL de solução II de colagenase de 0,2% em um tubo cónico de 50 mL. O volume de solução de colagenase deve tornar a ser quase 1.5 - a 2 vezes o volume da pelota.
Nota: para a digestão do tecido, colagenase 0,2% eu e 2,5 U/mL de solução de dispase pode substituir colagenase 0,2% II. Use um volume quase igual de solução de dispase para a colagenase solução. - Misture bem a pelota com solução a 0,2% colagenase II, agitando o tubo ou agite o tubo num agitador a 75 x g durante 45-60 min a 37 ° C. Agite o tubo vigorosamente à mão após cada 20-30 min para realçar a Lise.
- Triture a mistura de tecidos lisados utilizando uma pipeta sorológica 5ml e uma ponta da pipeta de 1 mL para dissociar o pedaço de tecido para a suspensão de célula única.
Nota: Para obter a máxima recuperação dos CSCs, Triture a mistura de Lise pelo menos 5 min. Se os pedaços de tecido são relativamente grandes, corte a ponta de uma ponta da pipeta de 1 mL com tesoura ou lâmina cirúrgica e usá-lo para trituração. - Pare a Lise enzimática do tecido adicionando comercialmente disponível meio de manutenção do CSC. Adicione quase 2-3x tanto meio de manutenção como o volume dos tecidos lisados na etapa 2.14.
- Passe a suspensão de eritrócitos digerido através de um filtro de célula de 100 µm para remover quaisquer pedaços de tecido não digerido.
- Repita a etapa 2.16 usando um coador de célula de 40 µm.
- Separe as células através de centrifugação gradiente de densidade. Para a separação de células, suavemente sobreposição igual volume do filtrado com solução de diatrizoate de polysucrose e de sódio. Por exemplo, em primeiro lugar, adicionar 20 mL de solução de diatrizoate de polysucrose e de sódio em um tubo cónico de 50 mL e em seguida, adicionar 20 mL do filtrado da etapa 2.17 sobre a solução de diatrizoate de polysucrose e de sódio.
Nota: Durante a polysucrose e solução de diatrizoate de sódio a 37 ° C antes de usam com as células. Adicionar ao filtrado da etapa 2.17 sobre a solução de diatrizoate de polysucrose e de sódio muito lentamente e com cuidado para evitar qualquer mistura das duas soluções. Isto é considerado um passo crucial. - Centrifugar o tubo contendo ambas as soluções a 500 x g por 20 min à temperatura ambiente utilizando uma centrífuga de balde de balanço. Defina o centrifugador a uma velocidade inferior de aceleração e desaceleração, para evitar misturar as duas soluções e para a separação adequada dos CSCs. Este é um passo importante no isolamento de CSC. Colocar o tubo contendo a mistura gradiente muito lentamente sem perturbação dentro da centrifuga e configurá-lo para centrifugação.
- Tire o casaco buffy junto com solução extra da camada superior usando uma pipeta de 1 mL ou uma pipeta Pasteur plástica em um tubo esterilizado 15 mL. Esta camada de buffy conterá os CSCs.
Nota: Tomar precauções extras durante a pipetagem do buffy coat para não tirar a camada de solução de diatrizoate de polysucrose e de sódio, porque é tóxico para CSCs. - Adicione igual volume de meio de manutenção do CSC para a suspensão de células da etapa 2,20 e misturá-lo corretamente para neutralizar o polysucrose residual e a solução de diatrizoate de sódio, se estiver presente.
- Centrifugar a suspensão celular acima de 500 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
- Resuspenda o pellet em 7-10 mL de meio DMEM incompleto e centrifuga-lo a 500 x g por 5 min a 4 ° C, para se livrar de qualquer polysucrose residual e a solução de diatrizoate de sódio.
- Colete o sedimento, que contém os CSCs purificadas.
- Resuspenda o pellet em 1 mL de meio de manutenção do CSC, contar o número de CSC e usar o pellet de cultura. Para contar o número de CSC, use coloração azul Trypan e um hemocytometer. Com quatro corações de ratos masculinos, o rendimento do CSCs é ~1.8 milhões.
- Semente do CSCs em uma placa de cultura de 6-Poços revestidos com uma solução de 0,02% gelatina contendo 0,5% de fibronectina. Uso 2 mL do meio de manutenção completa para propagação. Incube a placa de cultura numa incubadora a 37 ° C com 5% de CO2.
- Substitua o meio de cultura CSCs meio de manutenção do CSC completo todos os dias até o terceiro dia. Depois disso, altere o meio em dias alternados.
- Determine o crescimento dos CSCs, observá-los sob um microscópio.
3. cultura de manutenção e passagem de células-tronco cardíacas
- Cultura do CSCs isoladas em meio de manutenção disponível comercialmente. Substitua o meio de cultura com meio de manutenção fresco em dias alternados. Quando a cultura de CSC alcançou a confluência, transferi os CSCs para uma nova placa revestida com gelatina e fibronectina, como mencionado na etapa 2.26. Desanexe os CSCs cultivadas pelo buffer de dissociação enzimática da célula. Siga o protocolo padrão de dissociação celular da placa de cultura. Nesta fase, CSCs são considerados na passagem 0 palco (P0).
- Cultura P0 CSCs em uma gelatina nova placa revestida de fibronectina em meio de manutenção completo do CSC a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 , permitir que eles sejam confluente e então siga passo 3.1 para obter passagem 1 (P1) CSCs. loja P1 CSCs em nitrogênio líquido ou usá-los para tranforme em mentos.
- Sementes de 0,5 milhões de células em uma placa de 6 ou 1 milhão em T-25 para manter a cultura de CSC em seu estágio inicial.
- Os CSCs quando tornam-se 85% - 90% de confluencia de passagem. CSCs podem ser cultivadas em meio de manutenção até quatro a seis semanas.
Nota: Manter a densidade de semeadura inicial dos CSCs relativamente elevadas (40% - 50%) porque, em uma menor densidade de semeadura, os CSCs podem mudar sua morfologia plana e alongada.
4. caracterização de células-tronco cardíacas
- Para caracterizar os CSCs culturas, observá-los sob um fago-contraste ou um microscópio de campo claro. Coloque a placa CSC-contendo no objectivo de um microscópio fluorescente. Defina a ampliação bastante baixa (10 X) para concentrar as células. Use o contraste de fase abertura para observar as células. Aumentar a ampliação de 20 X alterando a lente objetiva e o CSCs. aumento o objetivo de 40 X de imagem e imagem do CSCs. Em dois dias, os CSCs aparecem quase redondos em forma, mas o tamanho da célula aumenta com o tempo e em sete dias, os CSCs aparecem quase cilíndricos em forma (Fig. 1A - 1C).
- Executar imunocoloração dos CSCs com marcadores de pluripotência/stemness (OCT4, SOX2 ou Nanog), proliferação (Ki-67) (Fig. 2A - 2D) e células de origem cardíaca/progenitoras (Sca-1, NKX2-5 ou GATA4) (Figura 3A - 3C).
- Para a imunocoloração dos CSCs, sementes 10.000 CSCs em uma placa de cultura de 24-bem.
- No dia seguinte (após 18-24 h), corrigi os CSCs em 300 µ l de paraformaldeído 4% por 10 min.
- Lave os CSCs com 500 µ l de PBS gelado, 3x com intervalos de 5 min.
- Permeabilize os CSCs com 300 µ l de 0,2% Triton X-100 diluído em PBS por 10 min.
- Lave os CSCs com 500 µ l de PBS gelado, 3x com intervalos de 5 min.
- Realizar o bloqueio dos CSCs com 300 µ l de BSA 1% diluído em PBST (PBS + 0.1% Tween 20) ou 300 µ l de soro normal frango 10% diluído em PBST por 1h.
- Incubar os CSCs em 200 µ l de anticorpo primário diluído no bloqueio de solução durante a noite a 4 ° C. Dilua o anticorpo primário, como recomendado pela folha de dados de anticorpos ou conforme padronização.
- Lave os CSCs com 500 µ l de PBS gelado, 3x com intervalos de 5 min.
- Incubar os CSCs em 200 µ l de anticorpo secundário diluído em solução de bloqueio (ver passo 4.2.6) por 1h à temperatura ambiente. Dilua o anticorpo secundário, como recomendado pela folha de dados de anticorpos ou conforme padronização.
- Lave os CSCs com 500 µ l de PBS gelado, 3x com intervalos de 5 min.
- Counterstain os CSCs com 200 µ l de DAPI (1 µ g/mL) diluído em PBS por 5 min.
- Lave os CSCs 1 x com 500 µ l de PBS gelado. Em seguida, adicione 300 µ l de PBS gelado em cada poço.
- Execute a imagem usando um microscópio de fluorescência. Siga as instruções de fluorescente de imagem, tais como evitar a luz direta na placa. Manter a placa de cultura sob o microscópio. Concentre-se as células em diferentes ampliações. Observar as células sob contraste de fase e/ou filtros de excitação diferentes e salvar as imagens.
- Armazenar a placa no escuro a 4 ° C.
5. diferenciação de células-tronco cardíacas em casos
- A diferenciação de CSCs, sementes 500.000 CSCs em uma placa de 6 com 2 mL de meio de manutenção de CSC comercialmente disponível durante (37 ° C).
- Incubar a placa contendo os CSCs numa incubadora de CO2 a 37 ° C. Permitir que o CSCs anexar e proliferar até crescimento secundário confluente. Se o meio fica amarelo, substitua o meio de cultura com meio de manutenção fresco.
- Na confluência de 85-90%, substituir o meio de manutenção com 2 mL de cardiomyocytes durante (37 ° C) meio de diferenciação. Incube a placa numa incubadora de CO2 a 37 ° C por até 2-3 semanas.
- Altere o meio de diferenciação cada 2-3 m. observar a morfologia do CSCs sob um microscópio cada vez durante o médio mudar para garantir as condições de boa cultura.
- Depois d 12 da cultura CSC num meio de diferenciação, imagem os CSCs para marcadores de diferenciação, seguindo um padrão immunostaining protocolo (consulte as etapas 4.2.1 - 4.2.14). Salve as imagens fluorescentes para a expressão de marcadores cardiomyocytes (Figura 4A - 4B).
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Representative Results
No presente estudo, isolamos CSCs de corações de ratos machos C57BL/6J 10 a 12 semanas de idade. Aqui, apresentamos um método simples para CSC isolamento e caracterização utilizando marcadores de pluripotência. Também apresentamos um método elegante para diferenciação do CSC e a caracterização dos CSCs diferenciadas em direção a linhagem cardiomyocytes. Observamos uma morfologia de forma do eixo do CSCs 2 - a 3-dias-cultivadas sob um microscópio de contraste de fase (figura 1A e 1B). Encontramos uma mudança na morfologia de CSCs em 7 dias de cultura em meio de manutenção, durante os quais as células-tronco tornam-se alongados (Figura 1). Nós caracterizado CSCs para marcadores de pluripotência e encontrado que expressam OCT4, SOX2 e Nanog, (Figura 2A - 2C). Também descobrimos que o CSCs proliferam em meio de cultura e expressam o marcador de proliferação Ki-67 (Figura 2D). Para caracterizar a origem cardíaca do CSCs, determinamos a expressão dos marcadores cardíacos Sca-1, NKX2-5 e GATA4 em CSCs. Encontramos uma expressão de marcadores cardíacos nos CSCs cultivadas (Figura 3A - 3C). Para determinar a diferenciação dos CSCs em direção a linhagem de casos, nós cultivadas CSCs num meio de diferenciação de casos por 12 dias. Depois de 12 dias, fotografaram os CSCs diferenciados para os casos marcadores actinin e troponina eu. Observamos que os marcadores de casos foram expressos em CSCs diferenciados (Figura 4A - 4B). Em geral, estes resultados demonstram que isolamos com êxito CSCs de coração de rato, e que estes CSCs podem proliferar e diferenciar-se em direção a linhagem cardiomyocytes.
Figura 1: morfologia do CSCs culturas. Estes painéis mostram imagens de contraste de fase de CSCs culturas, ou seja, representante CSCs depois de 2 dias de cultivo em meio de manutenção em (A1), 20 X e (A2), 40 X objetivos, representante CSCs após 3 dias de cultivo em meio de manutenção no ( B1) 20 X e objectivos (B2), 40 X e representante CSCs após 7 dias de cultivo em meio de manutenção em (C1), 20 X e objectivos (C2), 40 X. As barras de escala são 100 µm para as 40 ampliações X e 200 µm para as 20 ampliações de X.
Figura 2: caracterização de CSCs para marcadores de pluripotência. Estes painéis mostram a imagem representativa da fluorescência do CSCs cultivadas para marcadores de pluripotência (OCT4, SOX2 e Nanog) e proliferação (Ki-67). Painéis A mostram expressões de OCT4 (verde) e DAPI (azul) no CSCs em (A1), 20 X e (A2), 40 X ampliações. Os painéis B mostram expressões de SOX2 (verde) e DAPI (azul) no CSCs em (B1), 20 X e ampliações (B2), 40 X. Painéis C mostrar expressões de Nanog (verde) e DAPI (azul) no CSCs em (C1), 20 X e ampliações (C2), 40 X. Painéis D mostrar expressões de Ki-67 (vermelho) e DAPI (azul) no CSCs em (D1), 20 X e ampliações (D2), 40 X. As barras de escala são 100 µm para as 40 ampliações X e 200 µm para as 20 ampliações de X. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: caracterização dos CSCs para marcadores cardíacos. Estes painéis mostram a imagem representativa da fluorescência do CSCs cultivadas para marcadores cardíacos. Painéis A mostram expressões de Sca-1 (vermelho) e DAPI (azul) no CSCs em (A1), 20 X e (A2), 40 X ampliações. Painéis B mostrar expressões de NKX2-5 (verde) e DAPI (azul) no CSCs em (B1), 20 X e (B2), 40 X ampliações. Painéis C mostram expressões de GATA4 (vermelho) e DAPI (azul) no CSCs em (C1), 20 X e ampliações (C2), 40 X. As barras de escala são 100 µm para as 40 ampliações X e 200 µm para as 20 ampliações de X.
Figura 4: caracterização da diferenciação de CSC em direção a linhagem casos. Estes painéis mostram representante de contraste de fase e a imagem latente de fluorescência de 12 dias diferenciados CSCs. (A) este painel mostra a expressão de casos actinin de marcador em CSCs diferenciadas, com o (a) uma imagem de fase-contrato, (b ) uma imagem de fluorescência de DAPI (núcleo de coloração), (c) uma fluorescência imagem de actinin (verde) e (d) um mesclado de painéis um - c. As ampliações são 40 X. (B), este painel mostra a expressão de troponina de marcador de casos I em diferenciadas CSCs, com (um) uma imagem de fase-contrato, (b) uma fluorescência imagem de DAPI (núcleo de coloração), imagem (c) uma fluorescência de Troponina I (verde) e (d) uma imagem mesclada de painéis um - c. As ampliações são 40 X. As barras de escala são 100 µm para as 40 ampliações X e 200 µm para as 20 ampliações de X. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: representação esquemática das diferentes etapas da CSC isolamento, cultura e diferenciação. Usamos cirurgicamente removidas corações de quatro a cinco ratos adultos para a isolação do CSCs. O processo gradual de CSC isolamento, cultura e diferenciação em direção cardiomyocytes linhagens são apresentados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os passos críticos do presente protocolo de isolamento do CSC são como segue. 1) uma condição esterilizada deve ser mantida para extração de corações de ratos. Qualquer contaminação durante a extração do coração pode comprometer a qualidade do CSCs. 2) o sangue deve ser completamente removido antes de a picar o coração, que é feito por várias lavagens de todo o coração e o coração peças com solução HBSS. 3) os pedaços do coração devem ser completamente lysed em uma suspensão de célula única com solução de colagenase. 4) a solução-gradiente diatrizoate, polysucrose e sódio, para a separação das células deve ser pré-aquecido. 5) o meio para a cultura de CSC deve ser pré-aquecido. 6) a confluência dos CSCs durante a semeadura em um prato de cultura deve ser alta porque, na confluência de baixa, CSCs podem alterar sua morfologia. 7) o número de CSC deveria ser marcado após o isolamento do coração e antes o chapeamento em um prato de cultura. O número de CSCs indica a eficiência do isolamento do fundo do coração. A contagem dos CSCs é importante para a semeadura dos CSCs na placa de cultura.
Costumávamos ratos adultos para isolar CSCs, que tem sido utilizado por outros pesquisadores em modelos de roedores23,28. CSCs podem ser isolados de corações roedores neonatal29,30 e até mesmo da biópsia de um coração humano31. Os protocolos de isolamento CSC relatados anteriormente tem algumas limitações, tais como menor rendimento, um procedimento de isolamento complexo, uma longa duração para a diferenciação e menos casos diferenciação potencial32,33, 34. o CSC isolamento protocolo apresentado aqui é simples: ele leva menos tempo e é rentável e mais eficiente no rendimento do CSC. Além disso, os CSCs isoladas são Sca-1+ ve (um marcador bem aceitado para rato CSCs) (figuras 1A1 - 2 de 3). A diferenciação de CSCs, outros protocolos precisam de três a quatro semanas35,36. No entanto, este protocolo requer 12 dias (figuras 4A - 4B). O gradiente de centrifugação isolamento CSC apresentado aqui produz ~1.8 milhões CSCs de corações de ratos masculinos quatro.
Embora o rendimento do CSCs é alto, uma limitação do presente protocolo é a uniformidade e pureza dos CSCs isolados. Porque não há nenhum marcador único aceitável para CSCs, é difícil usar um marcador único-pilha-superfície para selecionar CSCs. No entanto, CSCs isolados pelo presente protocolo podem ser usados para obter uma população uniforme de CSCs baseado em um marcador específico ou vários marcadores de CSCs, usando a classificação de fluorescência-ativado da pilha. Assim, este método de isolamento do CSC é cost-effective com um alto rendimento e tem a opção de obter uma população de CSC uniforme baseada em específico da pilha-superfície marker(s).
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado, em partes, por subvenções a National Institutes of Health, HL-113281 e HL116205 para Paras Kumar Mishra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson laboratory, USA | Stock no. 000664 | |
| Antibodies: | |||
| OCT4- | Abcam | ab18976 (rabbit polyclonal) | OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| SOX2 | Abcam | ab97959 (rabbit polyclonal) | SOX2-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Nanog | Abcam | ab80892 (rabbit polyclonal) | Nanog-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Ki67 | Abcam | ab16667 (rabbit polyclonal) | Ki67-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Sca I | Millipore | AB4336 (rabbit polyclonal) | Sca I Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| NKX2-5 | Santa Cruz | sc-8697 (goat polyclonal) | NKX2-5-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| GATA4 | Abcam | ab84593 (rabbit polyclonal) | GATA4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| MEF2C | Santa Cruz | sc-13268 (goat polyclonal) | MEF2C-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Troponin I | Millipore | MAB1691 (mouse monoclonal) | Troponin I-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Actinin | Millipore | MAB1682 (mouse monoclonal) | Actinin-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| ANP | Millipore | AB5490 (mouse polyclonal) | ANP-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Alex Fluor-488 checken anti-rabbit | Life technology | Ref no. A21441 | |
| Alex Fluor-594 goat anti-rabbit | Life technology | Ref no. A11012 | |
| Alex Fluor-594 rabbit anti-goat | Life technology | Ref no. A11078 | |
| Alex Fluor-488 checken anti-mouse | Life technology | Ref no. A21200 | |
| Alex Fluor-594 checken anti-goat | Life technology | Ref no. A21468 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture medium: | |||
| CSC maintenance medium | Millipore | SCM101 | Note: For CSC culture, PBS or incomplete DMEM medium was used for washing the cells |
| cardiomyocytes differentiation medium | Millipore | SCM102 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Isolation buffer: | |||
| polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077) | Sigma | 10771 | |
| HBSS | Gibco | 2018-03 | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Dispase solution | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| PBS | LONZA | S1226 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermoscientific | A1110501 | |
| Other reagents: | |||
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Normal checken serum | Vector laboratory | S3000 | |
| DAPI solution | Applichem | A100,0010 | Dapi, working concentration-1 µg/mL |
| Trypan blue | Biorad | 145-0013 | |
| Trypsin | Sigma | T4049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| Formaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | ACROS | Cas No. 900-293-1 | |
| Tween 20 | Fisher Sceintific | Lot No. 160170 | |
| Ethanol | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue culture materials: | |||
| 100 mm petri dish | Thermo Scientific | ||
| 6-well plate | Thermo Scientific | ||
| 24-well plate | Thermo Scientific | ||
| T-25 flask | Thermo Scientific | ||
| T-75 flask | Thermo Scientific | ||
| 15 ml conical tube | Thermo Scientific | ||
| 50 mL conical tube | Thermo Scientific | ||
| 40 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 100 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 10 mL syring | BD | Ref no. 309604 | |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette tips | Fisher Scientific | ||
| 5 mL, 10mL, 25 mL disposible plastic pipette | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Centrufuge machine | Thermo Scientific | LEGEND X1R centrifuge | |
| EVOS microscope | Life technology | ||
| Automated cell counter | Biorad | ||
| Cell counting slide | Biorad | 145-0011 | |
| Pippte aid | Thermo Scientific | S1 pipet filler | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments: | |||
| Surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Fine surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Curve shank forceps | Fine Scientific Tool | ||
| Surgical blade | Fine Scientific Tool |
References
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