Summary
この記事の全体的な目標は、分離と性質、大人マウス心臓から心臓の幹細胞 (CSCs) の分化のためのプロトコルを標準化することです。ここでは、マウス CSCs を分離する密度勾配遠心法と心筋細胞への分化、増殖、文化 CSC の精緻な方法について述べる。
Abstract
心筋梗塞 (MI) は、罹患率と世界中の死亡の主要な原因です。再生医療の主な目的は、MI 後死んだ心筋を補充するためにです。いくつかの戦略は、心筋を再生する使用されている幹細胞療法まま俺の心死んだ心筋を補充するために主要なアプローチになります。成人の心臓と心筋再生に内分泌やパラクリン効果で居住者心臓幹細胞 (CSCs) の存在を示唆証拠の蓄積します。しかし、CSC 分離特性と特に心筋心筋細胞へ分化技術的課題が残っています。本研究では分離と性質、CSCs の成体マウスの心から差別化の簡単な方法を提供します。ここでは、CSCs、0.2% コラゲナーゼ II ソリューションによって心を消化する場所の隔離のための濃度勾配法について述べる。分離 CSCs を特徴付ける、CSCs/心臓マーカー Sca 1、NKX2-5、および、GATA4 および多能性/未分化マーカー OCT4、SOX2, Nanog の発現を評価しました。シャーレで培養増殖マーカー Ki 67 の式を評価することにより分離 CSCs の拡散可能性も決定。CSCs の微分の潜在性を評価するため、我々 は 7 に 10 日間培養 CSCs を選択しました。我々 は心筋細胞分化培地と新しいプレートにそれらを転送します。彼らは 12 日細胞文化のインキュベーターで培養分化培地は 3 日ごとに変更中。差別化された CSCs エクスプレス心筋細胞特異的マーカー: アクチニンとトロポニン私。したがって、このプロトコルで分離された CSCs ある未分化と心臓マーカー、増殖や心筋細胞系列へ分化する可能性があります。
Introduction
虚血性心臓病、心筋梗塞 (MI) などは世界の1のまわりの死の主要な原因です。死んだ心筋を再生のための幹細胞療法のまま、MI の心2,の3,4、5の心機能を改善するために主要なアプローチです。異なったタイプの幹細胞は、死んだ心筋を補充するために、俺の心の心機能を改善するために使用されています。胚性幹細胞6と成人幹細胞に大きく分類することができます。大人の幹細胞の骨髄由来単核細胞7、8骨髄9,10,脂肪組織由来間葉系幹細胞などさまざまな種類の幹細胞を使用しているされて11,12、および臍帯13、CSCs14,15。幹細胞は、内分泌やパラクリン アクション16,17,18,19,20による心筋再生を昇格できます。しかし、幹細胞療法の主要な制限が増殖したり、特定の心臓系統21,22の方向へ分化する幹細胞の十分な数を取得します。自家および同種幹細胞移植は幹細胞療法9で重要な課題です。CSCs は、中心部から派生しているため、彼らすることができますより簡単に区別する心臓系統に非心臓幹細胞よりも心臓再生のためのより良いアプローチにかもしれない。したがって、奇形のリスクが軽減されます。また、エクソソームなど、CSCs から派生した Mirna CSCs の内分泌とパラクリンの効果は幹細胞の他のタイプよりも効果的かもしれません。従って、CSCs 残る心臓再生23,24のためのより良いオプションです。
CSCs は心臓起源のため MI 心心筋再生に適して、CSCs の主要な制限は効率的な分離方法の不足のため以下の収量。別の制限は、心筋細胞系列2,25,26,27に向かって CSCs の障害者差別化で可能性があります。これらの制限を回避するために CSC の分離、特性評価、心臓系統への分化に効率的なプロトコルを開発することが重要です。CSCs の単一の許容可能なマーカーがない、CSCs の特定細胞表面マーカーに基づく分離が少ない CSCs を得られます。ここでは、費用対効果は、CSCs の増加収量結果マウス心臓から CSCs を分離するための単純な勾配遠心法アプローチを標準化します。これらの孤立した CSCs は、蛍光活性化細胞を短絡すること特定の細胞表面マーカーの選択できます。CSCs の分離に加えて CSC 文化、特性評価、心筋細胞系列への分化にプロトコルを提供します。したがって、分離し、文化を特徴付ける成体マウスの心 (図 5) から CSCs を区別するエレガントな方法を提案する.
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Protocol
住宅、麻酔科とマウスの犠牲をネブラスカ大学医療センターの承認された IACUC プロトコルに従って行った。
1. 材料
- オスの鼠の動物機関 CSCs。 CSCs を分離するために社内保管することができますも使用 10-12 週齢 c57bl/6 j ブラックは非妊娠したメスマウスから分離されます。
- オートクレーブに入れることによって外科はさみ、微細手術用はさみ、湾曲したシャンク鉗子、外科ブレードを含む必要なの手術器械を滅菌するマウスの安楽死させる前に。
- 滅菌状態で CSC 分離バッファーを準備し、氷の上の 4 ° C で保存します。これらのバッファーは、polysucrose、diatrizoate のナトリウム溶液 1.077 グラム/mL の濃度に調整、不完全なダルベッコ改変イーグル培地、1 x ハムの平衡塩溶液 (HBSS) と細胞培養グレード 1 をリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x。1% コラゲナーゼ II 在庫ソリューション (フィルター、滅菌) と HBSS で 0.2% 実用的なソリューションを準備します。
- 内閣は、10 mm のペトリ皿、6 ウェル プレート、24 ウェル プレート、T-25 と T-75 培養フラスコ、15 mL と 50 mL の円錐管、40 μ m と 100 使い捨て血清ピペットを含む、バイオ セーフティにおける滅菌状態で培養材料を保つ-μ m セル ストレーナー 0.22 μ m フィルターを使用します。
- 10 μ L、200 μ L、オートクレーブによって 1,000 μ L ピペット チップを消毒します。
- パウダー フリーのニトリル手袋と 70% エタノールを実験を通じて無菌状態を維持するために使用します。
- 消毒剤として 10% の漂白剤を使用します。
- それぞれ、文化や CSCs の分化の市販 CSC 培地と心筋細胞分化培地を使用しています。
2. 分離心筋幹細胞法
- 4 ~ 5 成人男性 (または非妊娠中の女性) を安楽死させる CO2チャンバーを用いたマウス。ピンや粘着テープで別郭清の段ボールにそれぞれのマウスの腕を固定します。
- 外の細菌を取り除くし、心の収穫時に滅菌状態を維持するマウスの 70% エタノールをスプレーします。腹部の真ん中、ハサミで切開をして直線で胸部までの腹部から皮膚をカットします。皮膚と毛の腹部領域をオフに中間カットの両側から皮膚を削除します。はさみやピンセットを使用して、胸郭の下の横隔膜をカットします。
- フード内側胸部を切断することによってマウスの胸腔を開きます。心を公開し、中心部の血液を削除します。中心部近傍の血を取り除く氷冷 PBS の心臓の周辺を洗います。
- 外科はさみとピンセットを使用して心臓を解剖します。10 mL の氷冷 PBS を含む 100 mm のペトリ皿に中心を配置します。
- 湾曲したシャンク鉗子を用いた心です、心の中の残血を取り外します。
- CSCs の隔離のための全体の中心を使用します。
- すべての 4 つまたは 5 つの全心を冷たい HBSS 10 ml、50 mL の円錐管に転送します。さらに処理まで氷の上の管を保ちます。
- バイオセイフティ内外キャビネット滅菌環境を作成する 70% エタノールを拭きます。心を含む管と 70% のエタノールとその他の必要な材料を殺菌します。さらに処理のキャビネット、バイオ セーフティに心臓を含む管を配置します。
- 心の中を冷たい HBSS の 10 mL を含む 100 mm のペトリ皿に転送します。心の中の任意の残留血液を削除する触診で再度心を洗います。血液の完全な除去を確保するため各洗浄後 HBSS ソリューションを変更します。
- HBSS ソリューションの 5-7 mL を含む 100 mm のペトリ皿に微細外科はさみまたは外科ブレードを使用して細かく心をカットします。鉗子のペアでそれぞれの心を押し、2-4 mm の部分に心をカットする手術の細かいはさみまたは外科ブレードのペアを使用します。頻繁に確認して血無料 HBSS HBSS ソリューションを変更します。HBSS ソリューションで心をミンチします。
- 500 x gで 5 分破棄のための 4 ° C でみじん切りにした組織培養上清を遠心し、ペレットを維持します。
- 0.2% コラゲナーゼ II ソリューション 50 mL の円錐管に 5-6 mL にペレットを再懸濁します。コラゲナーゼ溶液の量をほぼ 1.5 〜 2 倍にペレットのボリュームとはずです。
注: の組織、私と 2.5 U/mL dispase ソリューションは、0.2% コラゲナーゼ II を置き換えることができます 0.2% コラゲナーゼの消化力。当期、コラゲナーゼの解決策のほぼ等しい量を使用して私のソリューションです。 - 37 ° C で 45-60 分の間 (75 x) gシェーカーでチューブを揺動、チューブの攪拌によりペレットを 0.2% コラゲナーゼ II ソリューションで徹底的にミックスします。換散を強化するすべての 20-30 分後チューブを手で積極的に振る。
- 5 mL の血清ピペット、1 mL のピペット チップを使用して単一細胞懸濁液に組織塊を分離する分離組織ミックス カップ刻んだ。
注: CSCs の最大回復を得るには、少なくとも 5 分間溶解ミックスをカップ刻んだ。ティッシュの固まりが比較的大きく、ハサミ、外科ブレード 1 mL ピペット チップの先端をカットし、製粉のために使用します。 - 市販 CSC 培地を追加することによって、組織の酵素の溶解を停止します。2.14 の手順で分離組織のボリュームとしてほぼ 2-3 x ほど培地を追加します。
- 任意の未消化のティッシュの部分を削除する 100 μ m セル ストレーナーを消化細胞懸濁液を通過します。
- 2.16 40 μ m セル ストレーナーを使用して手順を繰り返します。
- 密度勾配遠心分離によって細胞を分離します。細胞の分離、polysucrose、ナトリウムの diatrizoate ソリューションに濾液の等量を優しくオーバーレイします。たとえば、最初に、50 mL の円錐管に polysucrose、ナトリウムの diatrizoate 溶液 20 mL を追加し、polysucrose、ナトリウム diatrizoate ソリューション ステップ 2.17 からろ液 20 mL を追加します。
注: Prewarm、polysucrose、前に 37 ° C でナトリウム diatrizoate ソリューションを使用セル。非常に慎重に、ゆっくりと polysucrose、ナトリウム diatrizoate ソリューションまたぎ 2.17 から濾液を追加 2 つのソリューションの任意の混合を避けるために。これは重要なステップと見なされます。 - 500 x gスイング バケツの遠心分離機を使用して室温で 20 分間で両方のソリューションを含むチューブを遠心します。2 つのソリューションの混合を避けるために加速と減速速度を低くし、CSCs の適切な分離の遠心分離機を設定します。これは、CSC の分離の重要なステップです。遠心分離機内にせずに非常にゆっくりとグラデーションの混合物を含んでいる管を入れ、遠心分離に設定。
- 15 mL 滅菌チューブに 1 mL ピペットまたはプラスチック パスツール ピペットを使用して上位層から余分なソリューションとともにバフィー コートを取り出します。このバフィー層、CSCs が含まれます。
注: は、CSCs に有毒であるので、polysucrose、ナトリウム diatrizoate ソリューション層を取らないバフィー コートのピペッティング時に余分な予防措置を取る。 - ステップ 2.20 から細胞懸濁液に CSC メンテナンス中の等量を追加し、存在する場合正しく残留 polysucrose、ナトリウム diatrizoate 溶液を中和するために混ぜます。
- 4 ° C で 5 分間 500 x gで上記細胞懸濁液を遠心分離します。上清を捨てます。
- 不完全な DMEM 培地の 7-10 mL にペレットを再懸濁し、残留 polysucrose、ナトリウム diatrizoate ソリューションを取り除くために 4 ° C で 5 分間 500 × gで遠心分離します。
- 精製 CSCs を含んだペレットを収集します。
- CSC 培地 1 mL にペレットを再懸濁します、CSC 数をカウントし、文化のペレットを使用します。CSC 数を数える、トリパン ブルー染色、診断を使用します。4 つの雄マウス心 CSCs の収量は ~1.8 百万です。
- シード 6 ウェル培養プレートの CSCs は、0.02% ゼラチン溶液 0.5% フィブロネクチンが塗られます。播種の完全な維持培地 2 mL を使用します。5% CO2と 37 ° C でインキュベーターで培養プレートを孵化させなさい。
- 3 日目まで毎日完全な CSC 培地で文化 CSCs の媒体を置き換えます。その後、別の日に媒体を変更します。
- 顕微鏡下で観察することにより、CSCs の成長を決定します。
3. 文化や心臓の幹細胞の通路のメンテナンス
- 文化、市販培地で分離 CSCs。一日おきに新鮮な培地で培養液を置き換えます。CSC 文化が confluency に達したら、2.26 の手順で述べたように、新しい板ゼラチンとフィブロネクチン、コーティング、CSCs を転送します。酵素の細胞解離バッファーによって培養 CSCs をデタッチします。培養プレートから細胞解離の標準的なプロトコルに従ってください。この段階で、CSCs は 0 (P0) ステージ通路と考え。
- 新しいゼラチンで文化 P0 CSCs と 37 ° c 5% CO2インキュベーターでの培養維持完全な CSC フィブロネクチン コーティング プレート、合流できるように手順 3.1 液体窒素で通路 1 (P1) CSCs。 ストア P1 CSCs を取得または実験のために使用するにはメンツ。
- 6 ウェル プレートで 50 万セルまたは 100 万 T-25 初期段階で CSC 文化を維持するために細胞を播きます。
- 85%-90% の合流になるとき、CSCs を通路します。CSCs は、4 〜 6 週間までメンテナンス培地中で培養することができます。
注意: CSCs の比較的高い (40%-50%) の初期播種密度、CSCs が平らで細長いにその形態を変更する播種密度が低いので。
4. 心臓幹細胞のキャラクタリゼーション
- 培養 CSCs を特徴付ける、バクテリオファージ コントラストまたは明るいフィールド顕微鏡の下で観察します。蛍光顕微鏡の目的に CSC を含むプレートを配置します。セルを集中する倍率かなり低い (10 X) を設定します。位相コントラストの絞りを使用して、セルを調べます。20 X 対物レンズを変更することによって拡大や CSCs。 増加 40 X に目的の画像や、CSCs をイメージします。2 日間で、CSCs 表示時間と 7 日間で細胞増加のサイズ、形状、ほぼ円形、CSCs はほぼ円筒形 (図 1 a ・ 1 C) で表示されます。
- 多能性/未分化 (OCT4、SOX2、または Nanog) 増殖 (キ-67) (図 2 a - 2 D)、および (Sca 1、NKX2 5、または GATA4) 心臓起源/前駆細胞のマーカー、CSCs の染色を行う (図 3 a - 3 C)。
- CSCs の是非、24 ウェル培養プレートで 10,000 CSCs をシードします。
- (18-24 h) 後、翌日は 10 分 4% パラホルムアルデヒドの 300 μ L で、CSCs を修正します。
- 氷冷 PBS の 500 μ L で CSCs を洗って 5 分間隔で 3 倍。
- 10 分の PBS で希釈したトリトン X-100 0.2% の 300 μ L で CSCs を permeabilize します。
- 氷冷 PBS の 500 μ L で CSCs を洗って 5 分間隔で 3 倍。
- PBST で希釈し 1 %bsa の 300 μ L で、CSCs のブロックを実行 (PBS + 0.1% Tween 20) または 10% 通常の鶏血清希釈 pbst; で 1 h 300 μ L。
- 4 ° C で一晩ソリューションをブロックで希釈した一次抗体を 200 μ l 添加の CSCs を孵化させなさい一次抗体を希釈するに従って標準化または抗体のデータシートで推奨されています。
- 氷冷 PBS の 500 μ L で CSCs を洗って 5 分間隔で 3 倍。
- ソリューションをブロックで希釈した二次抗体を 200 μ l 添加の CSCs を孵化させなさい (手順 4.2.6 参照) 室温で 1 時間。二次抗体を希釈するに従って標準化または抗体のデータシートで推奨されています。
- 氷冷 PBS の 500 μ L で CSCs を洗って 5 分間隔で 3 倍。
- DAPI の 200 μ L で CSCs を counterstain (1 μ g/mL) が 5 分 PBS で希釈しました。
- CSCs 1 を洗って氷冷 PBS の 500 μ L と x。各ウェルに、氷冷 PBS の 300 μ L を追加します。
- 蛍光顕微鏡を用いたイメージングを実行します。蛍光イメージング プレートに直接光を避けるなどの指示に従います。顕微鏡下で培養プレートを維持します。異なる倍率でセルをフォーカスします。位相コントラストおよび/または異なる励起フィルターの下のセルを観察し、画像を保存します。
- プレートは 4 ° C で暗闇の中で保管して
5. 心臓幹細胞の心筋への分化
- CSCs の鑑別、prewarm (37 ° C) 市販 CSC 培地 2 mL で 6 ウェル プレートで 500,000 CSCs をシードします。
- 37 ° C で CO2インキュベーターで CSCs を含むプレートを孵化させなさい添付し、サブ合流成長まで増殖する CSCs を許可します。培地は黄色、新鮮な培地と培養液を交換してください。
- 85%-90% の confluency に置き換える維持培地 2 mL prewarm (37 ° C) 心筋細胞分化培地。2-3 週間までの 37 ° C で CO2インキュベーターでプレートを孵化させなさい。
- すべて 2-3 d. 観察良い培養条件を確保するため変更媒体中にたびに顕微鏡下で CSCs の形態分化培地を変更します。
- 分化培地で CSC 文化の 12 d の後画像次の標準的な免疫染色分化マーカーの CSCs プロトコル (手順 4.2.1 - 4.2.14 参照) をします。心筋マーカー (図 4 a ・ 4 b) の表現のための蛍光画像を保存します。
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Representative Results
本研究では 10-12 週齢の c57bl/6 j マウス雄心から CSCs を分離しました。ここでは、簡易 CSC 分離と多能性マーカーを用いた評価法を提案しました。また、CSC 分化のエレガントな方法と心筋細胞系統に分化した CSCs の評価を発表しました。(図 1 aと1 b) 位相差顕微鏡下で 2 に 3-日-培養 CSCs の紡錘形形態を観察した.幹細胞になる時間の間にメンテナンス中に、文化 7 日 CSCs の形態の変更は延長 (図 1) がわかった。我々 の多能性のマーカーの CSCs を特徴し、彼らは OCT4、SOX2, Nanog (図 2 a ・ 2 C) を表現を発見します。また、CSCs が培地の増殖、増殖マーカー Ki 67 (2 D 図) を表現を発見します。CSCs の心臓由来を特徴付ける、Sca 1、NKX2-5、および CSCs の GATA4 心臓マーカーの発現を決定されます。培養 CSCs (図 3 a - 3 C) で心臓マーカーの表現を見つけました。CSCs の心筋細胞系列への分化を決定するには、CSCs の培養心筋細胞分化培地での 12 日間。12 日後心筋マーカー アクチニンとトロポニンの分化 CSCs イメージを描き私。心筋マーカーが分化 CSCs (図 4 a ・ 4 b) で表現されたことを観察した.全体的にみて、これらの結果は、我々 は正常にマウスの心臓から CSCs を分離とこれら CSCs が増殖でき、心筋細胞系列の方向へ分化を示します。
図 1: 培養 CSCs の形態。これらのパネル表示培養 CSCs、すなわち代表 CSCs (A1) 20 X でメンテナンス中、40 X (A2) 目標、(で培地で培養 3 日後代表 CSCs で養殖した 2 日後の位相コントラスト イメージングB1)20 X、40 X (B2) 目的と代表 CSCs (C1) 20 X でメンテナンス中、40 X (C2) 目的で培養 7 日後です。スケール バーは、40 X 倍率の 100 μ m、200 μ m 20 X 倍率のです。
図 2: CSCs 多能性マーカーの特性。これらのパネルは、培養 CSCs (OCT4、SOX2, Nanog) は多能性と増殖 (キ-67) のマーカーのための代表的な蛍光を示します。パネルAは、20 X (A1) で CSCs の (A2) 40 X 倍率 (青) (緑) OCT4、DAPI の式を示します。パネルBは、20 X (B1) で CSCs、40 X (B2) 倍率 (青) (緑) SOX2 の DAPI 式を示します。パネルCは、CSCs (C1) 20 X と 40 X (C2) 倍率 (青) (緑) Nanog 及び DAPI の式を示します。パネルDは、20 X (D1) で CSCs、40 X (D2) 倍率 (青) ki-67 (赤) および DAPI の式を示します。スケール バーは、40 X 倍率の 100 μ m、200 μ m 20 X 倍率のです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 心臓マーカーの CSCs のキャラクタリゼーション。これらのパネルは、心臓疾患マーカーの培養 CSCs の代表的な蛍光イメージングを表示します。パネルAは、20 X (A1) で CSCs の (A2) 40 X 倍率 Sca 1 (赤)、DAPI (青) の式を示します。パネルBは、20 X (B1) で CSCs、40 X (B2) 倍率 (青) NKX2 5 (緑)、DAPI の式を示します。パネルCは、CSCs (C1) 20 X と 40 X (C2) 倍率 (青) (赤) GATA4 および DAPI の式を示します。スケール バーは、40 X 倍率の 100 μ m、200 μ m 20 X 倍率のです。
図 4: 心筋細胞系列へ分化を CSC のキャラクタリゼーション。これらのパネルは、代表を示す位相差顕微鏡および蛍光イメージング (A) 12 日区別 CSCs のこのパネルは、心筋マーカー アクチニンの式 (a) との差別化された CSCs フェーズ契約イメージ (b) (染色核) DAPI の蛍光画像、アクチニン (緑)、(c) 蛍光イメージ、パネル、 - cの (d) マージ イメージ。倍率は 40 倍です。このパネル (B) で区別 (、) フェーズ契約画像, (b)、蛍光画像の DAPI (染色核)、(c) 蛍光像の CSCs 心筋マーカーのトロポニンの式を示しています。トロポニン私 (緑)、および (d) パネル、 - cのマージされた画像。倍率は 40 倍です。スケール バーは、40 X 倍率の 100 μ m、200 μ m 20 X 倍率のです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: CSC 分離・文化・差別化の別の手順の概略図。CSCs の分離の 4 から 5 つの成体に切除心を使いました。CSC の分離、カルチャ、および心筋細胞系列へ分化の段階的プロセスが掲載されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
この CSC の隔離のプロトコルの重要な手順は次のとおりです。1) 滅菌条件は、マウスから心の抽出のために維持されなければなりません。心抽出中に汚染が CSCs。 2 の品質を危険にさらす) ミンチ入りの HBSS ソリューション全体の心と心のいくつかの洗浄によって行われる心の前に血を完全に削除する必要があります。3) 心の部分は、コラゲナーゼの解決と単一細胞懸濁液に完全に分離する必要があります。4) polysucrose、ナトリウム diatrizoate グラデーションのためのソリューション、細胞の分離を prewarmed する必要があります。5) CSC 文化のための媒体を prewarmed する必要があります。6) シード培養皿の中に CSCs の合流点は、低密度、CSCs はその形態を変更する可能性高くなります。7) CSC の数は、心の底から、培養皿にメッキ前に、の分離後得点する必要があります。CSCs の数は、心の底からの分離の効率を示します。CSCs のカウントは、培養プレートの CSCs の播種のため重要です。
CSCs は、齧歯動物モデル23,28の他の研究者によって使用されているを分離する成体マウスを使いました。CSCs は、新生児の齧歯動物心29,30と31の人間の心の生検から分離することができます。以前に報告した CSC の隔離のプロトコル以下の収量、複雑な分離のプロシージャ、分化、心筋細胞分化潜在的な32,33,が少なく長い期間など制限があります。34。 ここに提示、CSC の隔離のプロトコルは簡単です: より少ない時間がかかると、コスト効率の高い、CSC 収量の効率。さらに、分離の CSCs は、Sca 1+ ve (マウス CSCs の広く受け入れられたマーカー) (数字 1A1 - 3 2)。CSCs の差別化、他のプロトコルには、3 〜 4 週間35,36が必要があります。しかし、このプロトコルでは、12 日 (図 4 a ・ 4 b) が必要です。ここに示す勾配遠心分離に基づく CSC 分離は、4 つの雄マウスの心から ~1.8 百万 CSCs を得られます。
CSCs の収量が高いが、このプロトコルの制限は、均一性と分離 CSCs の純度です。CSCs の単一の許容可能なマーカーがないために、単一セル表面のマーカーを使用して、CSCs を選択する困難です。しかし、このプロトコルによって分離 CSCs を使用して、特定のマーカーまたは CSCs、蛍光活性化細胞ソーティングを使用してのいくつかのマーカーに基づく CSCs の均一人口を取得できます。したがって、CSC 分離のこの方法は高い歩留まりとコスト効果の高い、特定の細胞表面マーカーに基づく均一 CSC 人口を取得するオプション。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作業は、パーツでサポート、HL 113281 とパラス ・ クマール ・ ミシュラに HL116205 国立衛生研究所の助成金によって。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson laboratory, USA | Stock no. 000664 | |
| Antibodies: | |||
| OCT4- | Abcam | ab18976 (rabbit polyclonal) | OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| SOX2 | Abcam | ab97959 (rabbit polyclonal) | SOX2-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Nanog | Abcam | ab80892 (rabbit polyclonal) | Nanog-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Ki67 | Abcam | ab16667 (rabbit polyclonal) | Ki67-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Sca I | Millipore | AB4336 (rabbit polyclonal) | Sca I Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| NKX2-5 | Santa Cruz | sc-8697 (goat polyclonal) | NKX2-5-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| GATA4 | Abcam | ab84593 (rabbit polyclonal) | GATA4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| MEF2C | Santa Cruz | sc-13268 (goat polyclonal) | MEF2C-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Troponin I | Millipore | MAB1691 (mouse monoclonal) | Troponin I-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Actinin | Millipore | MAB1682 (mouse monoclonal) | Actinin-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| ANP | Millipore | AB5490 (mouse polyclonal) | ANP-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Alex Fluor-488 checken anti-rabbit | Life technology | Ref no. A21441 | |
| Alex Fluor-594 goat anti-rabbit | Life technology | Ref no. A11012 | |
| Alex Fluor-594 rabbit anti-goat | Life technology | Ref no. A11078 | |
| Alex Fluor-488 checken anti-mouse | Life technology | Ref no. A21200 | |
| Alex Fluor-594 checken anti-goat | Life technology | Ref no. A21468 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture medium: | |||
| CSC maintenance medium | Millipore | SCM101 | Note: For CSC culture, PBS or incomplete DMEM medium was used for washing the cells |
| cardiomyocytes differentiation medium | Millipore | SCM102 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Isolation buffer: | |||
| polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077) | Sigma | 10771 | |
| HBSS | Gibco | 2018-03 | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Dispase solution | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| PBS | LONZA | S1226 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermoscientific | A1110501 | |
| Other reagents: | |||
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Normal checken serum | Vector laboratory | S3000 | |
| DAPI solution | Applichem | A100,0010 | Dapi, working concentration-1 µg/mL |
| Trypan blue | Biorad | 145-0013 | |
| Trypsin | Sigma | T4049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| Formaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | ACROS | Cas No. 900-293-1 | |
| Tween 20 | Fisher Sceintific | Lot No. 160170 | |
| Ethanol | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue culture materials: | |||
| 100 mm petri dish | Thermo Scientific | ||
| 6-well plate | Thermo Scientific | ||
| 24-well plate | Thermo Scientific | ||
| T-25 flask | Thermo Scientific | ||
| T-75 flask | Thermo Scientific | ||
| 15 ml conical tube | Thermo Scientific | ||
| 50 mL conical tube | Thermo Scientific | ||
| 40 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 100 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 10 mL syring | BD | Ref no. 309604 | |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette tips | Fisher Scientific | ||
| 5 mL, 10mL, 25 mL disposible plastic pipette | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Centrufuge machine | Thermo Scientific | LEGEND X1R centrifuge | |
| EVOS microscope | Life technology | ||
| Automated cell counter | Biorad | ||
| Cell counting slide | Biorad | 145-0011 | |
| Pippte aid | Thermo Scientific | S1 pipet filler | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments: | |||
| Surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Fine surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Curve shank forceps | Fine Scientific Tool | ||
| Surgical blade | Fine Scientific Tool |
References
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146 (2017).
- Nguyen, P. K., Rhee, J. W., Wu, J. C. Adult Stem Cell Therapy and Heart Failure, 2000 to 2016: A Systematic Review. The Journal of the American Medical Association Cardiology. 1, 831-841 (2000).
- Emmert, M. Y., et al. Safety and efficacy of cardiopoietic stem cells in the treatment of post-infarction left-ventricular dysfunction - From cardioprotection to functional repair in a translational pig infarction model. Biomaterials. 122, 48-62 (2017).
- Silvestre, J. S., Menasche, P. The Evolution of the Stem Cell Theory for Heart Failure. EBioMedicine. 2, 1871-1879 (2015).
- Terzic, A., Behfar, A. Stem cell therapy for heart failure: Ensuring regenerative proficiency. Trends in Cardiovascular Medicine. 26, 395-404 (2016).
- Yamada, S., et al. Embryonic stem cell therapy of heart failure in genetic cardiomyopathy. Stem Cells. 26, 2644-2653 (2008).
- Sadek, H. A., Martin, C. M., Latif, S. S., Garry, M. G., Garry, D. J. Bone-marrow-derived side population cells for myocardial regeneration. Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 173-181 (2009).
- Vrtovec, B., et al. Effects of intracoronary CD34+ stem cell transplantation in nonischemic dilated cardiomyopathy patients: 5-year follow-up. Circulation Research. 112, 165-173 (2013).
- Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. The Journal of American Medical Association. 308, 2369-2379 (2012).
- Guijarro, D., et al. Intramyocardial transplantation of mesenchymal stromal cells for chonic myocardial ischemia and impaired left ventricular function: Results of the MESAMI 1 pilot trial. International Journal of Cardiology. 209, 258-265 (2016).
- Bobi, J., et al. Intracoronary Administration of Allogeneic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells Improves Myocardial Perfusion But Not Left Ventricle Function, in a Translational Model of Acute Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 6, (2017).
- Suzuki, E., Fujita, D., Takahashi, M., Oba, S., Nishimatsu, H. Adipose tissue-derived stem cells as a therapeutic tool for cardiovascular disease. World Journal of Cardiology. 7, 454-465 (2015).
- Gao, L. R., et al. Intracoronary infusion of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells in acute myocardial infarction: double-blind, randomized controlled trial. BMC Medicine. 13, 162 (2015).
- Simpson, D. L., et al. A strong regenerative ability of cardiac stem cells derived from neonatal hearts. Circulation. , S46-S53 (2012).
- Kazakov, A., et al. C-kit(+) resident cardiac stem cells improve left ventricular fibrosis in pressure overload. Stem Cell Research. 15, 700-711 (2015).
- Ong, S. G., et al. Cross talk of combined gene and cell therapy in ischemic heart disease: role of exosomal microRNA transfer. Circulation. 130, S60-S69 (2014).
- Sahoo, S., Losordo, D. W. Exosomes and cardiac repair after myocardial infarction. Circulation Research. 114, 333-344 (2014).
- Zhang, Z., et al. Pretreatment of Cardiac Stem Cells With Exosomes Derived From Mesenchymal Stem Cells Enhances Myocardial Repair. Journal of the American Heart Association. 5, (2016).
- Ibrahim, A. G., Cheng, K., Marban, E. Exosomes as critical agents of cardiac regeneration triggered by cell therapy. Stem Cell Reports. 2, 606-619 (2014).
- Emanueli, C., Shearn, A. I., Angelini, G. D., Sahoo, S. Exosomes and exosomal miRNAs in cardiovascular protection and repair. Vascular Pharmacology. 71, 24-30 (2015).
- Menasche, P. Cardiac cell therapy: lessons from clinical trials. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, 258-265 (2011).
- Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell Stem Cell. 17, 11-22 (2015).
- Takamiya, M., Haider, K. H., Ashaf, M. Identification and characterization of a novel multipotent sub-population of Sca-1(+) cardiac progenitor cells for myocardial regeneration. PLoS One. 6, e25265 (2011).
- Cambria, E., et al. Translational cardiac stem cell therapy: advancing from first-generation to next-generation cell types. NPJ Regenerative Medicine. 2, 17 (2017).
- Bruyneel, A. A., Sehgal, A., Malandraki-Miller, S., Carr, C. Stem Cell Therapy for the Heart: Blind Alley or Magic Bullet? Journal of Cardiovascular Translational Research. 9, 405-418 (2016).
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12, 689-698 (2013).
- Oh, H., Ito, H., Sano, S. Challenges to success in heart failure: Cardiac cell therapies in patients with heart diseases. Journal of Cardiology. 68, 361-367 (2016).
- Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9, 1662-1681 (2014).
- Rutering, J., et al. Improved Method for Isolation of Neonatal Rat Cardiomyocytes with Increased Yield of C-Kit+ Cardiac Progenitor Cells. Journal of Stem Cell Research and Therapy. 5, 1-8 (2015).
- Saravanakumar, M., Devaraj, H. Distribution and homing pattern of c-kit+ Sca-1+ CXCR4+ resident cardiac stem cells in neonatal, postnatal, and adult mouse heart. Cardiovascular Pathology. 22, 257-263 (2013).
- Monsanto, M. M., et al. Concurrent Isolation of 3 Distinct Cardiac Stem Cell Populations From a Single Human Heart Biopsy. Circulation Research. 121, 113-124 (2017).
- Vidyasekar, P., Shyamsunder, P., Santhakumar, R., Arun, R., Verma, R. S. A simplified protocol for the isolation and culture of cardiomyocytes and progenitor cells from neonatal mouse ventricles. European Journal of Cell Biology. 94, 444-452 (2015).
- Dergilev, K. V., et al. Comparison of cardiac stem cell sheets detached by Versene solution and from thermoresponsive dishes reveals similar properties of constructs. Tissue Cell. 49, 64-71 (2017).
- Zaruba, M. M., Soonpaa, M., Reuter, S., Field, L. J. Cardiomyogenic potential of C-kit(+)-expressing cells derived from neonatal and adult mouse hearts. Circulation. 121, 1992-2000 (1992).
- Wang, H., et al. Isolation and characterization of a Sca-1+/CD31- progenitor cell lineage derived from mouse heart tissue. BMC Biotechnology. 14, 75 (2014).
- Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4, 232-243 (2009).
