O objetivo geral deste artigo é a padronização do protocolo para o isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco cardíacas (CSCs) do fundo do coração de rato adulto. Aqui, descrevemos um método de centrifugação gradiente de densidade para isolar murino CSCs e métodos elaborados para CSC cultura, proliferação e diferenciação em cardiomyocytes.
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Artigo de método
Isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco cardíacas do coração de rato adulto
Neste artigo
Resumo
Resumo
Infarto do miocárdio (MI) é das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Dos principais objetivos da medicina regenerativa é reabastecer o miocárdio morto depois de MI. Embora várias estratégias têm sido usadas para regenerar o miocárdio, terapia de células-tronco permanece uma grande abordagem para reabastecer o miocárdio morto de um coração de MI. Acumular evidências sugere a presença de células-tronco cardíacas (CSCs) residentes no coração adulto e seus efeitos endócrinas e/ou parácrina sobre regeneração cardíaca. No entanto, o isolamento do CSC e sua caracterização e diferenciação para células do miocárdio, especialmente cardiomyocytes, permanece um desafio técnico. No presente estudo, nós fornecemos um método simples para o isolamento, caracterização e diferenciação do CSCs do coração de rato adulto. Aqui, descrevemos um método de gradiente de densidade para a isolação do CSCs, onde o coração é digerido por uma solução II de colagenase de 0,2%. Para caracterizar os CSCs isolados, avaliamos a expressão de marcadores de CSCs/cardíaco Sca-1, NKX2-5 e GATA4 e marcadores de pluripotência/stemness OCT4, SOX2 e Nanog. Nós também determinou o potencial de proliferação de CSCs isolados cultivo-os em um prato de Petri e avaliando a expressão do marcador de proliferação Ki-67. Para avaliar o potencial de diferenciação de CSCs, selecionamos sete a dez dias cultivada CSCs. Estamos transferindo-os para uma nova placa com meio de diferenciação de casos. Eles são incubados em um incubador de cultura celular durante 12 dias, enquanto meio de diferenciação é trocado a cada três dias. Os CSCs diferenciados expressam marcadores de casos específicos: actinin e troponina eu. Assim, CSCs isolados com este protocolo tem stemness e marcadores cardíacos, e eles têm um potencial de proliferação e diferenciação em direção a linhagem de casos.
Introdução
Doença isquêmica do coração, incluindo infarto do miocárdio (MI), é das principais causas de morte em torno do mundo1. Terapia de células-tronco para regenerar o miocárdio morto continua a ser uma grande abordagem para melhorar a função cardíaca de um MI coração2,3,4,5. Diferentes tipos de células-tronco utilizaram para reabastecer o miocárdio morto e para melhorar a função cardíaca de um coração de MI. Eles podem ser amplamente classificados em células-tronco células-tronco embrionárias6 e adu....
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Protocolo
A habitação, anestesia e sacrifício de ratos foram realizados seguindo o protocolo aprovado IACUC do centro médico da Universidade de Nebraska.
1. materiais
- Uso 10 a 12-semanas C57BL/6J preto camundongos machos, mantidos internamente à instalação de animais institucional, para o isolamento de CSCs. CSCs podem também ser isolado de ratos fêmeas não-grávidas.
- Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos necessários, incluindo tesouras cirúrgicas, bem tesoura cirúrgica, pinça de haste curvada e uma lâmina cirúrgica, por autoclavagem-los antes da eutanásia do mouse.
- Preparar os buffers de isolamento CSC em uma cond....
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Resultados
No presente estudo, isolamos CSCs de corações de ratos machos C57BL/6J 10 a 12 semanas de idade. Aqui, apresentamos um método simples para CSC isolamento e caracterização utilizando marcadores de pluripotência. Também apresentamos um método elegante para diferenciação do CSC e a caracterização dos CSCs diferenciadas em direção a linhagem cardiomyocytes. Observamos uma morfologia de forma do eixo do CSCs 2 - a 3-dias-cultivadas sob um microscópio de contraste de fase (.......
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Discussão
Os passos críticos do presente protocolo de isolamento do CSC são como segue. 1) uma condição esterilizada deve ser mantida para extração de corações de ratos. Qualquer contaminação durante a extração do coração pode comprometer a qualidade do CSCs. 2) o sangue deve ser completamente removido antes de a picar o coração, que é feito por várias lavagens de todo o coração e o coração peças com solução HBSS. 3) os pedaços do coração devem ser completamente lysed em uma suspensão de célula única com solução de colagenase. 4) .......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho é apoiado, em partes, por subvenções a National Institutes of Health, HL-113281 e HL116205 para Paras Kumar Mishra.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Camundongos | The Jackson laboratory, EUA | Estoque nº 000664 | |
| Anticorpos: | |||
| OCT4-Abcam | ab18976 (policlonal de coelho) | OCT4-Anticorpo primário- diluição 1:100, anticorpo secundário- diluição 1:200, em solução de bloqueio | |
| SOX2 | Abcam | ab97959 (policlonal de coelho) | SOX2-Anticorpo primário - diluição 1:100, anticorpo secundário - diluição 1:200, em solução de bloqueio |
| Nanog | Abcam | ab80892 (policlonal de coelho) | Anticorpo Nanog-primário - diluição 1:100, anticorpo secundário - diluição 1:200, em solução de bloqueio |
| Ki67 | Abcam | ab16667 (policlonal de coelho) | Ki67-Anticorpo primário - diluição 1:100, anticorpo secundário - diluição 1:200, em solução de bloqueio |
| Sca I | Millipore | AB4336 (policlonal de coelho) | Sca I Anticorpo primário - diluição 1:100, anticorpo secundário - diluição 1:200, em solução de bloqueio |
| NKX2-5 | Santa Cruz | sc-8697 (policlonal de cabra) | NKX2-5-Anticorpo primário - diluição 1:50, anticorpo secundário - diluição 1:200, em solução de bloqueio |
| GATA4 | Abcam | ab84593 (policlonal de coelho) | GATA4-Anticorpo primário - diluição 1:100, anticorpo secundário - diluição 1:200, em solução de bloqueio |
| MEF2C | Santa Cruz | sc-13268 (policlonal de cabra) | MEF2C-anticorpo primário - diluição 1:50, anticorpo secundário - diluição 1:200, em solução de bloqueio |
| Troponina I | Millipore | MAB1691 (monoclonal de camundongo) | Troponina I-anticorpo primário - diluição 1:100, anticorpo secundário - diluição 1:200, em solução |
| de bloqueioActinina | Millipore | MAB1682 (monoclonal de camundongo) | Actinina-Anticorpo primário - diluição 1:100, anticorpo secundário - diluição 1:200, em solução de bloqueio |
| ANP | Millipore | AB5490 (policlonal de camundongo) | ANP-anticorpo primário - diluição 1:100, anticorpo secundário - diluição 1:200, em solução de bloqueio |
| Alex Fluor-488 checken anti-coelho | Tecnologia de vida | Ref no. A21441 | |
| Alex Fluor-594 cabra anti-coelho | Life technology | Ref nº A11012 | |
| Alex Fluor-594 coelho anti-cabra | Life technology | Ref nº A11078 | |
| Alex Fluor-488 checken anti-mouse | Life technology | Ref nº A21200 | |
| Alex Fluor-594 checken anti-cabra | Life technology | Ref nº A21468 | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Meio de cultura: | |||
| CSC meio de manutenção | Millipore | SCM101 | Nota: Para cultura CSC, PBS ou meio DMEM incompleto foi usado para lavar as células |
| cardiomiócitos meio de diferenciação | Millipore | SCM102 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo< | strong>Comentários |
| Cell Isolation buffer:solução de | |||
| polissacarose e diatrizoato de sódio (Histopaque1077) | Sigma | 10771 | |
| HBSS | Gibco | 2018-03 | |
| Colagenase I | Sigma | C0130 | |
| Solução de dispase | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| PBS | LONZA | S1226 | |
| Reagente de dissociação celular StemPro Accutase | Thermoscientific | A1110501 | |
| Outros reagentes: | |||
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Normal checken serum | Vector laboratory | S3000 | |
| DAPI solution | Applichem | A100,0010 | Dapi, concentração de trabalho-1 µ g / mL |
| Trypan azul | Biorad | 145-0013 | |
| Tripsina | Sigma | T4049 | |
| StemPro Accutase Reagente de Dissociação Celular | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| Formaldeído | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | ACROS | Cas No. 900-293-1 | |
| Tween 20 | Fisher Sceintific | Lote nº 160170 | |
| Etanol | Thermo Scientific | ||
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Materiais de cultura de tecidos: | |||
| 100 mm placa de Petri | Thermo Scientific | ||
| Placa de 6 poços | Thermo Scientific | ||
| Placa de 24 poços | Thermo Scientific | ||
| Balão T-25 | Thermo Scientific | ||
| Balão T-75 | Thermo Scientific | ||
| Tubo cônico de 15 ml | Thermo Scientific | ||
| Tubo cônico de 50 mL | Thermo Scientific | ||
| 40 µ corante de células m | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 100 µ corante de células m | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 0.22 µ Filtro m | Fisher Scientific | 09-719C | |
| Seringa de 10 mL | BD | Ref no. 309604 | |
| 10 µ L, 200 µ L, 1000 µ Ponteiras de pipeta L | Fisher Scientific | ||
| 5 mL, 10mL, 25 mL pipeta de plástico descartável | Thermo Scientific | ||
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Instrumentos | |||
| Máquina centrufugada | Thermo Scientific | LEGEND X1R centrífuga | |
| EVOS microscópio Tecnologia | da vida | ||
| Contador de células automatizado | Biorad | ||
| Lâmina de contagem de células | Biorad | 145-0011 | |
| Auxiliar de pippte | Thermo Scientific | S1 pipeta filler | |
| Nome | < strong>Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Instrumentos cirúrgicos: | |||
| Tesoura cirúrgica | Ferramenta | ||
| fina Tesoura cirúrgica fina | Ferramenta | ||
| Pinça de haste curva | Ferramenta científica fina | ||
| Lâmina cirúrgica | Fine Scientific Tool |
Referências
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146(2017).
- Nguyen, P. K., Rhee, J. W., Wu, J. C. A....
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Reimpressões e permissões
