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Biology

अलगाव, लक्षण वर्णन, और वयस्क माउस दिल से हृदय स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58448
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Cellular and Integrative Physiology, University of Nebraska Medical Center, 2Department of Anesthesiology, University of Nebraska Medical Center

Summary

इस अनुच्छेद के समग्र लक्ष्य के लिए अलगाव, लक्षण वर्णन, और कार्डियक स्टेम सेल (सीएससीएस) के वयस्क माउस दिल से भेदभाव के लिए प्रोटोकॉल का मानकीकरण है । यहां, हम एक घनत्व ढाल केंद्रापसारक विधि का वर्णन करने के लिए murine सीएससीएस और सीएससी संस्कृति, प्रसार, और cardiomyocytes में भेदभाव के लिए सविस्तार तरीकों को अलग ।

Abstract

रोधगलन (एमआई) दुनिया भर में रुग्णता और मृत्यु का एक प्रमुख कारण है । पुनर्जन्म चिकित्सा का एक प्रमुख लक्ष्य एमआई के बाद मृत मायोकार्डियम की भरपाई करना है. हालांकि कई रणनीतियों को पुनर्जीवित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है मायोकार्डियम, स्टेम सेल थेरेपी एक प्रमुख दृष्टिकोण के लिए एक एमआई दिल के मृत मायोकार्डियम भरपाई रहता है । सबूत जमा वयस्क दिल में निवासी कार्डियक स्टेम सेल (सीएससीएस) की उपस्थिति और हृदय पुनर्जनन पर उनके अंत में स्रावी और/या paracrine प्रभाव पता चलता है । हालांकि, सीएससी अलगाव और उनके लक्षण वर्णन और रोधगलन की ओर भेदभाव, विशेष रूप से cardiomyocytes, एक तकनीकी चुनौती बनी हुई है । वर्तमान अध्ययन में, हम अलगाव, लक्षण वर्णन, और वयस्क माउस दिल से सीएससीएस के भेदभाव के लिए एक सरल तरीका प्रदान की है । यहां, हम सीएससीएस, जहां दिल एक ०.२% collagenase द्वितीय समाधान से पचा रहा है के अलगाव के लिए एक घनत्व ढाल विधि का वर्णन । पृथक सीएससीएस की विशेषता के लिए, हम सीएससीएस/कार्डियक मार्करों Sca-1, NKX2-5, और GATA4, और pluripotency/तनों मार्करों OCT4, SOX2, और Nanog की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन किया है । हम भी उंहें एक पेट्री डिश में संवर्धन और प्रसार मार्कर Ki-६७ की अभिव्यक्ति का आकलन द्वारा पृथक सीएससीएस की प्रसार क्षमता निर्धारित किया है । सीएससीएस की विभेदक क्षमता के मूल्यांकन के लिए हमने सात-दस दिनों तक कल्चरल सीएससीएस का चयन किया. हम उंहें एक cardiomyocyte भेदभाव मध्यम के साथ एक नई थाली में स्थानांतरित कर दिया । वे 12 दिनों के लिए एक सेल संस्कृति मशीन में मशीन हैं, जबकि भेदभाव मध्यम हर तीन दिनों में बदल जाता है । विभेदित सीएससीएस व्यक्त cardiomyocyte-विशिष्ट मार्कर: actinin और ट्रोपोनिन I. इस प्रकार, सीएससीएस इस प्रोटोकॉल के साथ अलग उपजी और हृदय मार्करों है, और वे cardiomyocyte वंश की ओर प्रसार और भेदभाव के लिए एक संभावित है ।

Introduction

कोरोनरी हृदय रोग, रोधगलन (एमआई) सहित,1दुनिया भर में मौत का एक प्रमुख कारण है । मृत मायोकार्डियम पैदा करने के लिए स्टेम सेल थेरेपी एक मील दिल2,3,4,5के कार्डियक समारोह में सुधार करने के लिए एक प्रमुख दृष्टिकोण रहता है । स्टेम कोशिकाओं के विभिंन प्रकार के मृत मायोकार्डियम भरपाई और एक मील दिल के कार्डियक समारोह में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । वे मोटे तौर पर भ्रूण स्टेम कोशिकाओं6 और वयस्क स्टेम कोशिकाओं में वर्गीकृत किया जा सकता है । वयस्क स्टेम कोशिकाओं में, स्टेम सेल के विभिंन प्रकार के अस्थि मज्जा-व्युत्पंन mononuclear कोशिकाओं7,8, mesenchymal स्टेम कोशिकाओं अस्थि मज्जा9,10, वसा ऊतक से व्युत्पंन के रूप में इस्तेमाल किया गया है, 11,12, और नाल कॉर्ड13, और सीएससीएस14,15। स्टेम सेल अंत में स्रावी और/paracrine क्रियाओं के माध्यम से कार्डियक पुनर्जनन को बढ़ावा16, 17,18,19,20कर सकते हैं । हालांकि, स्टेम सेल थेरेपी की एक प्रमुख सीमा स्टेम कोशिकाओं है कि पैदा करना और/या एक विशिष्ट हृदय वंश21,22की ओर अंतर कर सकते है की एक पर्याप्त संख्या प्राप्त है । स्टेम सेल के ऑटोलॉगस और allogenic प्रत्यारोपण स्टेम कोशिका थेरेपी9में एक महत्वपूर्ण चुनौती है । सीएससीएस हृदय पुनर्जनन के लिए एक बेहतर दृष्टिकोण हो सकता है क्योंकि वे दिल से प्राप्त कर रहे है और वे और अधिक आसानी से गैर कार्डियक स्टेम कोशिकाओं से हृदय वंश में विभेदित किया जा सकता है । इस प्रकार, यह teratoma के जोखिम को कम करता है । इसके अलावा, अंत में स्रावी और paracrine प्रभाव सीएससीएस, जैसे exosomes और miRNAs से व्युत्पंन सीएससीएस, स्टेम कोशिकाओं के अन्य प्रकार की तुलना में अधिक प्रभावी हो सकता है । इस प्रकार, सीएससीएस कार्डियक पुनर्जनन23,24के लिए एक बेहतर विकल्प रहता है ।

हालांकि सीएससीएस एक एमआई दिल में हृदय पुनर्जनन के लिए एक बेहतर उंमीदवार है उनके हृदय की उत्पत्ति के कारण, सीएससीएस के साथ एक प्रमुख सीमा कम एक कुशल अलगाव विधि की कमी के कारण उपज है । एक और सीमा cardiomyocytes वंश2,25,26,27की ओर सीएससीएस के बिगड़ा भेदभाव हो सकता है । इन सीमाओं को दरकिनार, सीएससी अलगाव, लक्षण वर्णन, और हृदय वंश के प्रति भेदभाव के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है । सीएससीएस के लिए कोई एकल स्वीकार्य मार्कर और सीएससीएस पैदावार कम सीएससीएस के एक विशिष्ट कोशिका-सतह मार्कर आधारित अलगाव है । यहां, हम एक सरल ढाल केंद्रापसारक दृष्टिकोण मानकीकरण के लिए माउस दिल से सीएससीएस अलग है कि लागत प्रभावी और सीएससीएस की वृद्धि हुई उपज में परिणाम है । इन पृथक सीएससीएस प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल shorting द्वारा विशिष्ट सेल-सतह मार्कर के लिए चुना जा सकता है । सीएससीएस अलगाव के अलावा, हम सीएससी संस्कृति, लक्षण वर्णन, और cardiomyocyte वंश के प्रति भेदभाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान की है । इस प्रकार, हम एक सुरुचिपूर्ण विधि को अलग करने के लिए वर्तमान, विशेषताएं, संस्कृति, और वयस्क माउस दिल से सीएससीएस अंतर (चित्रा 5) ।

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Protocol

आवास, संज्ञाहरण, और चूहों के बलिदान नेब्रास्का चिकित्सा केंद्र के विश्वविद्यालय के अनुमोदित IACUC प्रोटोकॉल के बाद प्रदर्शन किया गया ।

1. सामग्री

  1. सीएससीएस. सीएससीएस के अलगाव के लिए 10-से 12 सप्ताह पुराने C57BL/6J काले पुरुष चूहों, संस्थागत पशु सुविधा पर घर में रखा का प्रयोग करें भी गैर गर्भवती महिला चूहों से अलग किया जा सकता है ।
  2. शल्य कैंची, ठीक शल्य कैंची, घुमावदार टांग संदंश, और एक शल्य ब्लेड सहित सभी आवश्यक शल्य चिकित्सा उपकरणों, उन्हें माउस की इच्छामृत्यु से पहले autoclaving द्वारा निष्फल ।
  3. एक निष्फल स्थिति में सीएससी आइसोलेशन बफ़र्स तैयार करें और उन्हें बर्फ पर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । इन बफ़र्स polysucrose और एक सोडियम diatrizoate समाधान १.०७७ g/एमएल, अपूर्ण है Dulbecco संशोधित ईगल के माध्यम, 1x है हैम संतुलित नमक समाधान (HBSS), और सेल संस्कृति ग्रेड 1x फॉस्फेट-खारा (पंजाब) के घनत्व को समायोजित शामिल हैं । एक 1% collagenase द्वितीय शेयर समाधान तैयार (फ़िल्टर और निष्फल) और एक ०.२% HBSS में काम कर समाधान ।
  4. स्किन-किन संरक्षा मंत्रिमंडल में निष्फल स्थिति में टिशू कल्चर सामग्री रखें, जिसमें एक 10 एमएम की पेट्री डिश, एक 6 वेल प्लेट, एक 24 वेल प्लेट, टी-25 और टी-७५ कल्चरल कुप्पी, 15-एमएल और ५०-एमएल शंकु ट्यूब और ४०-µm और १०० के साथ डिस्पोजेबल सीरम वैज्ञानिक पिपेट -०.२२-µm फिल्टर के साथ µm सेल उपभेदों ।
  5. बंध्याकरण 10-µ l, २००-µ l, और १,०००-µ l पिपेट नुस्खे आटोक्लेव कर.
  6. प्रयोग में एक बाँझ हालत बनाए रखने के लिए पाउडर मुक्त nitrile दस्ताने और ७०% इथेनॉल का उपयोग करें ।
  7. एक विसंक्रमित के रूप में 10% ब्लीच का प्रयोग करें ।
  8. क्रमशः सीएससीएस की संस्कृति और विभेद के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सीएससी अनुरक्षण माध्यम और cardiomyocytes विभेदक माध्यम का उपयोग करें ।

2. कार्डियक स्टेम सेल का आइसोलेशन तरीका

  1. Euthanize चार से पांच वयस्क पुरुष (या गैर गर्भवती महिला) एक सह2 चैंबर का उपयोग चूहों । पिन या चिपचिपा टेप के साथ एक अलग विच्छेदन गत्ता पर प्रत्येक माउस के हथियारों को ठीक करें ।
  2. बाहर के कीटाणुओं से छुटकारा पाने और हृदय की कटाई के दौरान निष्फल स्थिति बनाए रखने के लिए माउस पर ७०% इथेनॉल का छिड़काव करें । पेट के बीच में कैंची के साथ एक चीरा बनाओ और एक सीधी रेखा में छाती के लिए पेट से त्वचा को काट । त्वचा और बालों के उदर क्षेत्र को साफ करने के लिए मध्यम कट के दोनों किनारों से त्वचा को हटा दें । कैंची और चिमटी का उपयोग कर, ribcage के नीचे डायाफ्राम काट ।
  3. डाकू के अंदर ribcage काटने से माउस के वक्ष गुहा खोलो । दिल को बेनकाब और दिल के पास खून निकालें । दिल के आसपास के इलाके में किसी भी खून से छुटकारा पाने के लिए बर्फ के ठंडे पंजाबियों के साथ दिल के आस-पास के क्षेत्र को धोएं ।
  4. सर्जिकल कैंची और चिमटी का उपयोग दिल काटना । १००-mm पेट्री डिश में दिल को लगाएं 10 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा पंजाबियों से युक्त ।
  5. घुमावदार टांग संदंश का उपयोग कर दिल Palpitate और हृदय के अंदर अवशिष्ट रक्त निकालें ।
  6. सीएससीएस के अलगाव के लिए पूरे दिल का इस्तेमाल करें ।
  7. सभी चार या पांच पूरे दिलों को एक ५०-एमएल शंकु ट्यूब बर्फ शीत HBSS के 10 मिलीलीटर युक्त स्थानांतरण । आगे की प्रोसेसिंग तक बर्फ पर ट्यूब रखें ।
  8. एक निष्फल वातावरण बनाने के लिए ७०% इथेनॉल के साथ एक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर और बाहर पोंछें । ७०% इथेनॉल के साथ दिल से युक्त ट्यूब और अन्य आवश्यक सामग्री निष्फल । आगे की प्रोसेसिंग के लिए दिल से युक्त ट्यूब को एंटी सेफ्टी कैबिनेट में लगाएं ।
  9. दिलों को एक १००-mm पेट्री डिश में ट्रांसफर करें जिसमें 10 मिलीलीटर बर्फ-ठंडी HBSS । दिल के अंदर किसी भी अवशिष्ट रक्त को हटाने के लिए टटोलने द्वारा फिर से दिलों को धोएं । प्रत्येक धोने के बाद रक्त का पूरा हटाने सुनिश्चित करने के लिए HBSS समाधान बदलें ।
  10. HBSS समाधान के 5-7 मिलीलीटर युक्त एक १०० मिमी पेट्री डिश में ठीक शल्य कैंची या एक शल्य ब्लेड का उपयोग कर छोटे टुकड़ों में दिलों को काट. संदंश की एक जोड़ी के साथ प्रत्येक दिल पकड़ो और शल्य चिकित्सा ठीक कैंची या एक शल्य ब्लेड की एक जोड़ी का उपयोग करने के लिए 2 में दिल काट-4-mm टुकड़े । HBSS समाधान अक्सर रक्त मुक्त HBSS सुनिश्चित करने के लिए परिवर्तित करें । HBSS समाधान में दिलों कीमा ।
  11. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ५०० x g में कीमा बनाया हुआ ऊतक केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें और गोली रखें ।
  12. एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में ०.२% collagenase द्वितीय समाधान के 5-6 मिलीलीटर में गोली resuspend । collagenase समाधान की मात्रा लगभग १.५-करने के लिए 2 गोली की मात्रा को गुना होना चाहिए ।
    नोट: ऊतक के पाचन के लिए, ०.२% collagenase मैं और २.५ U/एमएल dispase समाधान ०.२% collagenase द्वितीय की जगह ले सकते हैं । collagenase मैं समाधान के लिए dispase समाधान के लगभग बराबर मात्रा का उपयोग करें ।
  13. अच्छी तरह से ट्यूब आंदोलन से ०.२% collagenase द्वितीय समाधान के साथ गोली मिश्रण या ४५ के लिए ७५ एक्स जी में एक शेखर पर ट्यूब कमाल से-६० मिनट में ३७ डिग्री सेल्सियस । lysis को बढ़ाने के लिए हर 20-30 मिनट के बाद हाथ से ट्यूब जोरदार शेक ।
  14. Triturate लीजड ड ऊतक मिश्रण एक 5 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट और एक 1-एमएल पिपेट टिप का उपयोग कर एकल सेल निलंबन में ऊतक गांठ अलग कर देना करने के लिए ।
    नोट: सीएससीएस की अधिकतम वसूली प्राप्त करने के लिए, triturate lysis मिश्रण को कम से 5 मिनट के लिए । यदि ऊतक गांठ अपेक्षाकृत बड़े हैं, कैंची या एक शल्य ब्लेड के साथ एक 1 मिलीलीटर पिपेट टिप की नोक काट और trituration के लिए इसका इस्तेमाल करते हैं ।
  15. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सीएससी रखरखाव माध्यम को जोड़कर ऊतक के एंजाइमी lysis को बंद कर दें । २.१४ चरण में लीजड ड ऊतक की मात्रा के रूप में ज्यादा रखरखाव माध्यम के रूप में लगभग 2-3x जोड़ें ।
  16. किसी भी अपच ऊतक टुकड़े को दूर करने के लिए एक १००-µm सेल छलनी के माध्यम से पचा सेल निलंबन दर्रा ।
  17. दोहराएँ चरण २.१६ एक ४०-µm सेल छलनी का उपयोग कर ।
  18. घनत्व ढाल केंद्रापसारक के माध्यम से कोशिकाओं को अलग । कोशिकाओं के अलगाव के लिए, धीरे polysucrose और सोडियम diatrizoate समाधान पर छानने का एक बराबर मात्रा ओवरले । उदाहरण के लिए, पहले, एक ५०-एमएल शंकु ट्यूब में polysucrose और सोडियम diatrizoate समाधान के 20 मिलीलीटर जोड़ें और फिर, polysucrose और सोडियम diatrizoate समाधान पर कदम २.१७ से निस्पंदन के 20 मिलीलीटर जोड़ें ।
    नोट: polysucrose और सोडियम diatrizoate समाधान ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं के साथ प्रयोग करने से पहले गर्म । polysucrose और सोडियम diatrizoate समाधान पर कदम २.१७ से निस्पंदन जोड़ें बहुत ध्यान से और धीरे से किसी भी दो समाधान के मिश्रण से बचने के लिए । यह एक महत्वपूर्ण कदम माना जाता है ।
  19. एक स्विंग बाल्टी का उपयोग कर कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए ५०० x g पर दोनों समाधान युक्त ट्यूब केंद्रापसारक । दो समाधान मिश्रण से बचने के लिए और सीएससीएस की उचित जुदाई के लिए एक कम त्वरण और मंदी गति पर केंद्रापसारक सेट करें । सीएससी अलगाव में यह एक महत्वपूर्ण कदम है । ग्रैडिएंट मिश्रण के अंदर अशांति के बिना बहुत धीरे से युक्त ट्यूब रखो और यह केंद्रापसारक के लिए सेट ।
  20. एक 15 मिलीलीटर निष्फल ट्यूब में एक 1 मिलीलीटर पिपेट या एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर ऊपरी परत से अतिरिक्त समाधान के साथ साथ बाहर buffy कोट ले लो । इस buffy लेयर में सीएससीएस शामिल होंगे ।
    नोट: buffy कोट के pipetting के दौरान अतिरिक्त एहतियात रखना नहीं polysucrose और सोडियम diatrizoate समाधान परत बाहर ले क्योंकि यह सीएससीएस के लिए विषाक्त है ।
  21. सीएससी रखरखाव माध्यम के एक समान मात्रा चरण २.२० से सेल निलंबन करने के लिए जोड़ें और इसे ठीक से अवशिष्ट polysucrose और सोडियम diatrizoate समाधान बेअसर करने के लिए मिश्रण, यदि वर्तमान ।
  22. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ५०० x g पर ऊपर सेल निलंबन केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें ।
  23. अपूर्ण DMEM मध्यम के 7-10 मिलीलीटर में गोली resuspend और यह ५०० एक्स जी पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस से कम करने के लिए किसी भी अवशिष्ट polysucrose और सोडियम diatrizoate समाधान से छुटकारा पाने के लिए ।
  24. गोली, जो शुद्ध सीएससीएस शामिल लीजिए ।
  25. सीएससी रखरखाव माध्यम के 1 मिलीलीटर में गोली resuspend, csc संख्या गिनती, और संस्कृति के लिए गोली का उपयोग करें । CSC संख्या की गणना करने के लिए, Trypan नीला दाग और एक hemocytometer का उपयोग करें । चार पुरुष चूहों दिल के साथ, सीएससीएस की उपज ~ १,८००,००० है ।
  26. एक 6 में सीएससीएस बीज-अच्छी तरह से संस्कृति ०.५% fibronectin युक्त एक ०.०२% जिलेटिन समाधान के साथ लेपित थाली । सीडिंग के लिए पूरा रखरखाव माध्यम के 2 मिलीलीटर का उपयोग करें । 5% CO2के साथ ३७ ° c में एक मशीन में संस्कृति थाली मशीन ।
  27. संस्कृति सीएससीएस के माध्यम को पूरा सीएससी रखरखाव माध्यम से हर दिन तीसरे दिन तक बदलें । उसके बाद, वैकल्पिक दिनों पर माध्यम बदल जाते हैं ।
  28. उंहें एक खुर्दबीन के नीचे देख कर सीएससीएस के विकास का निर्धारण ।

3. संस्कृति रखरखाव और हृदय स्टेम सेल के पारित होने

  1. संस्कृति एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रखरखाव माध्यम में अलग सीएससीएस । वैकल्पिक दिनों पर ताजा रखरखाव माध्यम के साथ संस्कृति माध्यम बदलें । जब सीएससी संस्कृति के प्रवाह तक पहुंच गया है, एक नई प्लेट जिलेटिन और fibronectin के साथ लेपित के लिए सीएससीएस हस्तांतरण, के रूप में २.२६ कदम में उल्लेख किया । एंजाइमी कक्ष पृथक्करण बफ़र द्वारा cultureed सीएससीएस अलग । कल्चर प्लेट से सेल पृथक्करण के मानक प्रोटोकॉल का पालन करें । इस स्तर पर, सीएससीएस 0 (P0) चरण में माना जाता है ।
  2. संस्कृति P0 सीएससीएस में एक नया जिलेटिन और fibronectin-लेपित प्लेट में एक 5% सह2 मशीन में ३७ ° c पर पूरा सीएससी रखरखाव माध्यम में, उन्हें धाराप्रवाह होने की अनुमति दें, और फिर चरण ३.१ का पालन करें 1 (P1) सीएससीएस. Store p1 सीएससीएस तरल नाइट्रोजन में या experi के लिए इनका उपयोग करें हकए.
  3. अपने आरंभिक चरण में CSC कल्चर को बनाए रखने के लिए टी-25 में 6-वेल प्लेट या १,०००,००० कोशिकाओं में बीज ५००,००० कोशिकाएं ।
  4. सीएससीएस पारित जब वे ८५%-९०% धाराप्रवाह बन जाते हैं । सीएससीएस को चार से छह सप्ताह तक रखरखाव माध्यम में कल्चरित किया जा सकता है ।
    नोट: सीएससीएस के आरंभिक सीडिंग घनत्व को अपेक्षाकृत उच्च रखें (४०%-५०%) क्योंकि, कम सीडिंग घनत्व पर, सीएससीएस अपनी आकृति विज्ञान को समतल और लम्बा करने के लिए बदल सकते हैं ।

4. हृदय स्टेम कोशिकाओं का लक्षण वर्णन

  1. के लिए संस्कृतिपूर्ण सीएससीएस की विशेषताएं, उंहें एक फेज-कंट्रास्ट या एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण । एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के उद्देश्य पर सीएससी युक्त प्लेट लगाएं । आवर्धन काफी कम (10x) कोशिकाओं को ध्यान केंद्रित करने के लिए सेट करें । कोशिकाओं का निरीक्षण करने के लिए चरण कंट्रास्ट एपर्चर का उपयोग करें । उद्देश्य लेंस को बदलकर 20X के लिए आवर्धन बढ़ाएँ और छवि सीएससीएस. 40X और छवि सीएससीएस करने के लिए उद्देश्य बढ़ाएँ । दो दिनों में सीएससीएस के आकार में लगभग गोल दिखाई देते हैं, लेकिन समय के साथ कोशिका का आकार बढ़ जाता है, और सात दिनों में सीएससीएस लगभग बेलनाकार आकार में दिखाई देती है (फिगर 1a - 1C).
  2. pluripotency/तना (OCT4, SOX2, या Nanog), प्रसार (Ki-६७) (चित्रा 2a - 2d), और कार्डिएक मूल/जनक कोशिकाओं (Sca-1, NKX2-5, या GATA4) (चित्रा 3 सी 3) के मार्कर के साथ सीएससीएस के immunostaining प्रदर्शन ।
    1. सीएससीएस के immunostaining के लिए, बीज १०,००० सीएससीएस एक 24 में अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट ।
    2. अगले दिन (18-24 ज के बाद), सीएससीएस को ठीक करें ३०० µ l के 4% paraformaldehyde 10 मिनट के लिए ।
    3. सीएससीएस को ५०० µ l के साथ धो लें-ठंडी पंजाबियों, 5-ंयूनतम अंतराल के साथ 3x ।
    4. Permeabilize 10 मिनट के लिए पंजाब में पतला ०.२% ट्राइटन एक्स-१०० के ३०० µ एल के साथ सीएससीएस ।
    5. सीएससीएस को ५०० µ l के साथ धो लें-ठंडी पंजाबियों, 5-ंयूनतम अंतराल के साथ 3x ।
    6. ३०० µ एल के साथ सीएससीएस के अवरुद्ध प्रदर्शन 1% PBST में पतला BSA (पंजाबियों + ०.१% के बीच 20) या ३०० µ एल के 10% सामांय चिकन 1 ज के लिए PBST में पतला सीरम ।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात समाधान अवरुद्ध में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के २०० µ एल में सीएससीएस की मशीन । एंटीबॉडी के डेटापत्रक या मानकीकरण के अनुसार की सिफारिश के रूप में प्राथमिक एंटीबॉडी पतला ।
    8. सीएससीएस को ५०० µ l के साथ धो लें-ठंडी पंजाबियों, 5-ंयूनतम अंतराल के साथ 3x ।
    9. माध्यमिक एंटीबॉडी के २०० µ एल में सीएससीएस मशीन समाधान अवरुद्ध में पतला (चरण 4.2.6 देखें) 1 के लिए कमरे के तापमान पर एच । एंटीबॉडी के डेटापत्रक या मानकीकरण के अनुसार की सिफारिश के रूप में माध्यमिक एंटीबॉडी पतला ।
    10. सीएससीएस को ५०० µ l के साथ धो लें-ठंडी पंजाबियों, 5-ंयूनतम अंतराल के साथ 3x ।
    11. Counterstain 5 मिनट के लिए पंजाब में पतला DAPI (1 µ g/एमएल) के २०० µ एल के साथ सीएससीएस
    12. सीएससीएस 1x को आइस-कोल्ड पंजाबस के ५०० µ l से धोएं । फिर, प्रत्येक कुआं में बर्फ-ठंडे पंजाबियों के ३०० µ l को जोड़ें ।
    13. इमेजिंग एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्रदर्शन । इस तरह के रूप में प्लेट पर प्रत्यक्ष प्रकाश से बचने के लिए फ्लोरोसेंट इमेजिंग, के निर्देशों का पालन करें । माइक्रोस्कोप के नीचे कल्चर प्लेट रखें । कक्षों को विभिंन आवर्धन पर फ़ोकस करें । चरण-कंट्रास्ट और/या विभिंन उत्तेजना फ़िल्टर के अंतर्गत कक्षों का निरीक्षण करें और छवियां सहेजें ।
    14. 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में थाली की दुकान ।

5. Cardiomyocyte में कार्डियक स्टेम कोशिकाओं का भेदभाव

  1. सीएससीएस के भेदभाव के लिए, बीज ५००,००० सीएससीएस एक 6-अच्छी तरह से थाली में 2 मिलीलीटर के साथ गरम (३७ ° c) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध CSC रखरखाव माध्यम ।
  2. ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक सह2 मशीन में सीएससीएस युक्त थाली मशीन । उप-धाराप्रवाह वृद्धि होने तक सीएससीएस को अनुलग्न और पैदा करना करने की अनुमति दें । यदि मध्यम पीले रंग का हो जाता है, तो संस्कृति माध्यम को ताजे रखरखाव माध्यम से प्रतिस्थापित करें ।
  3. ८५% से कम-९०% प्रवाह, रखरखाव मध्यम गर्म (३७ डिग्री सेल्सियस) cardiomyocytes विभेदक के 2 मिलीलीटर के साथ बदलें । ३७ ° c पर 2-3 सप्ताह के लिए एक सह2 मशीन में थाली मशीन ।
  4. भिंनता मध्यम हर 2-3 d. एक खुर्दबीन के नीचे मध्यम परिवर्तन के दौरान हर बार अच्छी संस्कृति की स्थिति सुनिश्चित करने के लिए ' सीएससीएस आकृति विज्ञान निरीक्षण ।
  5. अंतर माध्यम में सीएससी संस्कृति के 12 डी के बाद, छवि एक मानक immunostaining प्रोटोकॉल के बाद भेदभाव मार्करों के लिए सीएससीएस (कदम 4.2.1-4.2.14 देखें) । cardiomyocytes मार्करों की अभिव्यक्ति के लिए फ्लोरोसेंट छवियों को बचाने (चित्रा 4a - 4B) ।

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Representative Results

वर्तमान अध्ययन में, हम सीएससीएस से पृथक 10-से 12-सप्ताह पुराने C57BL/6J पुरुष चूहों दिल । यहां, हम सीएससी अलगाव और लक्षण वर्णन pluripotency के मार्कर का उपयोग कर के लिए एक सरल तरीका प्रस्तुत किया है । हम भी सीएससी भेदभाव और सीएससीएस के लक्षण वर्णन है कि cardiomyocytes वंश की ओर विभेदित के लिए एक सुरुचिपूर्ण विधि प्रस्तुत किया । हम एक चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप के तहत 2-से 3 दिनों के कल्चरल सीएससीएस के एक धुरी आकृति विज्ञान (आंकड़ा 1a और 1b) मनाया । हम रखरखाव माध्यम में संस्कृति के 7 दिनों में सीएससीएस की आकृति विज्ञान में परिवर्तन पाया, जो समय के दौरान स्टेम सेल लम्बी हो (चित्रा 1C). हम pluripotency के मार्कर के लिए सीएससीएस विशेषता है और पाया कि वे OCT4 व्यक्त, SOX2, और Nanog (चित्रा 2a - 2c) । हमने यह भी पाया कि सीएससीएस पैदा करना संस्कृति माध्यम में और प्रसार मार्कर Ki-६७ (चित्रा 2d) व्यक्त करते हैं । सीएससीएस के कार्डियक मूल विशेषताएं करने के लिए, हम हृदय मार्करों की अभिव्यक्ति Sca-1, NKX2-5, और GATA4 सीएससीएस में निर्धारित किया है । हम संस्कृतिपूर्ण सीएससीएस (3 सी- 3सी) में कार्डियक मार्करों की अभिव्यक्ति पाया । cardiomyocyte वंश की ओर सीएससीएस के भेदभाव का निर्धारण करने के लिए, हम cardiomyocyte भेदभाव मध्यम में 12 दिनों के लिए सीएससीएस कल्चरल । 12 दिनों के बाद, हम cardiomyocyte मार्करों actinin और ट्रोपोनिन मैं के लिए विभेदित सीएससीएस छवि । हमने देखा है कि cardiomyocyte मार्करों विभेदित सीएससीएस (चित्रा 4a - 4B) में व्यक्त किया गया । कुल मिलाकर, इन परिणामों का प्रदर्शन है कि हम सफलतापूर्वक माउस दिल से सीएससीएस अलग और है कि इन सीएससीएस पैदा करना और cardiomyocytes वंश की ओर अंतर कर सकते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: कल्चरल सीएससीएस की आकृति विज्ञान । इन पैनलों में रखरखाव माध्यम में संवर्धन के 2 दिनों के बाद (A1) 20X और (A2) 40X उद्देश्यों पर, प्रतिनिधि सीएससीएस पर रखरखाव माध्यम में संवर्धन के 3 दिनों के बाद, सीएससीएस, अर्थात् प्रतिनिधि सीएससीएस के चरण-कंट्रास्ट इमेजिंग दिखाएं ( B1) 20X और (B2) 40X उद्देश्य, और प्रतिनिधि सीएससीएस रखरखाव माध्यम में संवर्धन के 7 दिनों के बाद (c1) 20X और (c2) 40X उद्देश्यों पर. पैमाने सलाखों के 40X आवर्धन और २०० µm के लिए 20X आवर्धन के लिए १०० µm हैं ।

Figure 2
चित्रा 2: pluripotency मार्करों के लिए सीएससीएस के लक्षण वर्णन । इन पैनलों pluripotency (OCT4, SOX2, और Nanog) और प्रसार (Ki-६७) के मार्करों के लिए कल्चरल सीएससीएस के प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति इमेजिंग दिखाओ । पैनलों (A1) 20X और (A2) 40X आवर्धन पर सीएससीएस में OCT4 (हरा) और DAPI (नीला) का एक शो भाव । पैनलों बी दिखाने के SOX2 के भाव (हरा) और DAPI (नीला) सीएससीएस में (B1) 20X और (B2) 40X आवर्धन । पैनलों सी शो के भाव Nanog (हरा) और DAPI (नीला) सीएससीएस में (c1) 20X और (c2) 40X आवर्धन । पैनलों डी शो की अभिव्यक्तियां Ki-६७ (red) और DAPI (नीला) सीएससीएस में (D1) 20X और (D2) 40X आवर्धन । पैमाने सलाखों के 40X आवर्धन और २०० µm के लिए 20X आवर्धन के लिए १०० µm हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: कार्डिएक मार्कर के लिए सीएससीएस के लक्षण वर्णन । ये पैनल कार्डियक मार्कर के लिए कल्चरल सीएससीएस के प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति इमेजिंग दिखाते हैं. पैनलों Sca के एक शो के भाव-1 (लाल) और DAPI (नीला) सीएससीएस में (A1) 20X और (A2) 40X आवर्धन पर । पैनलों बी शो के भाव NKX2-5 (हरा) और DAPI (नीला) सीएससीएस में (B1) 20X और (B2) 40X आवर्धन । पैनलों सी शो के भाव GATA4 (लाल) और DAPI (नीला) सीएससीएस में (c1) 20X और (c2) 40X आवर्धन हैं । पैमाने सलाखों के 40X आवर्धन और २०० µm के लिए 20X आवर्धन के लिए १०० µm हैं ।

Figure 4
चित्रा 4: cardiomyocyte वंश की ओर सीएससी भेदभाव के लक्षण वर्णन । इन पैनलों प्रतिनिधि चरण-कंट्रास्ट और प्रतिदीप्ति इमेजिंग 12-दिन विभेदित सीएससीएस के शो । (क) यह पैनल विभेदित सीएससीएस में cardiomyocyte मार्कर actinin की अभिव्यक्ति दिखाता है, (क) एक चरण अनुबंध छवि के साथ, (ख ) DAPI की एक प्रतिदीप्ति छवि (धुंधला नाभिक), (ग) actinin की एक प्रतिदीप्ति छवि (हरा), और (घ) पैनलों की एक छवि का विलय - सी। आवर्धन 40X हैं । (ख) इस पैनल cardiomyocyte मार्कर ट्रोपोनिन मैं विभेदित सीएससीएस में की अभिव्यक्ति से पता चलता है, (क) एक चरण अनुबंध छवि के साथ, (ख) DAPI की एक प्रतिदीप्ति छवि (धुंधला नाभिक), (ग) के एक प्रतिदीप्ति छवि ट्रोपोनिन मैं (हरा), और (घ) पैनलों की एक छवि का विलय- सी। आवर्धन 40X हैं । पैमाने सलाखों के 40X आवर्धन और २०० µm के लिए 20X आवर्धन के लिए १०० µm हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: सीएससी अलगाव, संस्कृति, और भेदभाव के विभिंन चरणों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । हम सीएससीएस के अलगाव के लिए चार से पांच वयस्क चूहों से शल्य चिकित्सा दिल हटा दिया करते थे । सीएससी अलगाव, संस्कृति, और cardiomyocytes वंश की ओर भेदभाव की stepwise प्रक्रिया प्रस्तुत कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस सीएससी आइसोलेशन प्रोटोकॉल के अहम स्टेप्स इस प्रकार हैं । 1) एक निष्फल हालत चूहों से दिलों की निकासी के लिए बनाए रखा जाना चाहिए । दिल निष्कर्षण के दौरान किसी भी संदूषण सीएससीएस की गुणवत्ता से समझौता हो सकता है । 2) हृदय को नख़रेबाज़ से पहले रक्त को पूरी तरह से हटा लेना चाहिए, जो पूरे दिल के कई धुल और HBSS समाधान के साथ दिल के टुकड़ों द्वारा किया जाता है । 3) दिल के टुकड़े collagenase समाधान के साथ एक एकल सेल निलंबन में पूरी तरह से लीजड ड होना चाहिए । 4) कोशिकाओं के विभाजन के लिए polysucrose और सोडियम diatrizoate ढाल समाधान गरम किया जाना चाहिए । 5) सीएससी कल्चर के लिए मीडियम को गरम करना होगा । 6) एक संस्कृति डिश में बोने के दौरान सीएससीएस का संगम उच्च होना चाहिए, क्योंकि कम प्रवाह में, सीएससीएस अपनी आकृति विज्ञान बदल सकते हैं । 7) सीएससी नंबर को दिल से अलगाव के बाद और किसी कल्चरल डिश में चढ़ाना से पहले बनाए रखना चाहिए । सीएससीएस की संख्या हृदय से अलगाव की कुशलता को इंगित करती है. सीएससीएस की गिनती कल्चरल प्लेट में सीएससीएस के सीडिंग के लिए जरूरी है ।

हम सीएससीएस अलग करने के लिए वयस्क चूहों का इस्तेमाल किया, जो कुतर मॉडल में अन्य जांचकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया गया है23,28. सीएससीएस नवजात कुतर दिल29,30 से अलग किया जा सकता है और यहां तक कि एक मानव दिल31की बायोप्सी से । पहले रिपोर्ट किए गए CSC आइसोलेशन प्रोटोकॉल में कुछ सीमाएं हैं, जैसे कम उपज, एक जटिल आइसोलेशन प्रक्रिया, विभेद के लिए एक लंबी अवधि, और कम cardiomyocyte विभेद संभावित३२,३३, ३४. सीएससी आइसोलेशन प्रोटोकॉल यहाँ प्रस्तुत किया गया सरल है: इसमें कम समय लगता है और सीएससी उपज में लागत प्रभावी और अधिक कुशल है । इसके अलावा, अलग सीएससीएस Sca है-1+ ve (माउस सीएससीएस के लिए एक अच्छी तरह से स्वीकार किए जाते मार्कर) (आंकड़े 1A1 - 3C2) । सीएससीएस के भेदभाव के लिए, अंय प्रोटोकॉल तीन से चार सप्ताह३५,३६की जरूरत है । हालांकि, इस प्रोटोकॉल 12 दिन (आंकड़े 4a - 4B) की आवश्यकता है । ढाल केंद्रापसारक आधारित CSC अलगाव यहां प्रस्तुत पैदावार ~ १,८००,००० चार पुरुष चूहों दिल से सीएससीएस ।

हालांकि सीएससीएस की उपज अधिक है, इस प्रोटोकॉल की एक सीमा एकरूपता और अलग सीएससीएस की पवित्रता है । चूंकि सीएससीएस के लिए कोई एकल स्वीकार्य मार्कर नहीं है, इसलिए सीएससीएस का चयन करने के लिए एकल-कक्ष-सरफ़ेस मार्कर का उपयोग करना कठिन है । हालांकि, इस प्रोटोकॉल द्वारा अलग सीएससीएस एक विशिष्ट मार्कर या सीएससीएस के कई मार्करों के आधार पर सीएससीएस की एक समान आबादी प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छंटाई का उपयोग कर । इस प्रकार, csc अलगाव की यह विधि एक उच्च उपज के साथ लागत प्रभावी है और विशिष्ट कोशिका-सतह मार्कर (ओं) के आधार पर एक समान सीएससी जनसंख्या प्राप्त करने का विकल्प है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम, भागों में, स्वास्थ्य अनुदान के राष्ट्रीय संस्थानों के द्वारा समर्थित है एचएल-११३२८१ और HL116205 पारस कुमार मिश्र को ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mice The Jackson laboratory, USA Stock no. 000664
Antibodies:
OCT4- Abcam ab18976 (rabbit polyclonal) OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
SOX2 Abcam ab97959 (rabbit polyclonal) SOX2-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Nanog Abcam ab80892 (rabbit polyclonal) Nanog-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Ki67 Abcam ab16667 (rabbit polyclonal) Ki67-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Sca I Millipore AB4336 (rabbit polyclonal) Sca I Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
NKX2-5 Santa Cruz sc-8697 (goat polyclonal) NKX2-5-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
GATA4 Abcam ab84593 (rabbit polyclonal) GATA4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
MEF2C Santa Cruz sc-13268 (goat polyclonal) MEF2C-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Troponin I Millipore MAB1691 (mouse monoclonal) Troponin I-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Actinin Millipore MAB1682 (mouse monoclonal) Actinin-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
ANP Millipore AB5490 (mouse polyclonal) ANP-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Alex Fluor-488 checken anti-rabbit Life technology Ref no. A21441
Alex Fluor-594 goat anti-rabbit Life technology Ref no. A11012
Alex Fluor-594 rabbit anti-goat Life technology Ref no. A11078
Alex Fluor-488 checken anti-mouse Life technology Ref no. A21200
Alex Fluor-594 checken anti-goat Life technology Ref no. A21468
Name Company Catalog Number Comments
Culture medium:
CSC maintenance medium Millipore SCM101 Note: For CSC culture, PBS or incomplete DMEM medium was used for washing the cells
cardiomyocytes differentiation medium Millipore SCM102
DMEM Sigma-Aldrich D5546
Name Company Catalog Number Comments
Cell Isolation buffer:
polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077) Sigma 10771
HBSS Gibco 2018-03
Collagenase I Sigma C0130
Dispase solution STEMCELL Technologies 7913
PBS LONZA S1226
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Thermoscientific A1110501
Other reagents:
BSA Sigma A7030
Normal checken serum Vector laboratory S3000
DAPI solution Applichem A100,0010 Dapi, working concentration-1 µg/mL
Trypan blue Biorad 145-0013
Trypsin Sigma T4049
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Thermo Fisher Scientific A1110501
Formaldehyde Sigma 158127
Triton X-100 ACROS Cas No. 900-293-1
Tween 20 Fisher Sceintific Lot No. 160170
Ethanol Thermo Scientific
Name Company Catalog Number Comments
Tissue culture materials:
100 mm petri dish Thermo Scientific
6-well plate Thermo Scientific
24-well plate Thermo Scientific
T-25 flask Thermo Scientific
T-75 flask Thermo Scientific
15 ml conical tube Thermo Scientific
50 mL conical tube Thermo Scientific
40 µm cell stainer Fisher Scientific 22363547
100 µm cell stainer Fisher Scientific 22363549
0.22 µm filter Fisher Scientific 09-719C
10 mL syring BD Ref no. 309604
10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette tips Fisher Scientific
5 mL, 10mL, 25 mL disposible plastic pipette Thermo Scientific
Name Company Catalog Number Comments
Instruments
Centrufuge machine Thermo Scientific LEGEND X1R centrifuge
EVOS microscope Life technology
Automated cell counter Biorad
Cell counting slide Biorad 145-0011
Pippte aid Thermo Scientific S1 pipet filler
Name Company Catalog Number Comments
Surgical Instruments:
Surgical scissors Fine Scientific Tool
Fine surgical scissors Fine Scientific Tool
Curve shank forceps Fine Scientific Tool
Surgical blade Fine Scientific Tool

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References

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जीव विज्ञान अंक १४३ Sca-1 OCT4 Nanog Ki-६७ NKX2-5 GATA4 actinin ट्रोपोनिन I
अलगाव, लक्षण वर्णन, और वयस्क माउस दिल से हृदय स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव
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Yadav, S. K., Mishra, P. K.… More

Yadav, S. K., Mishra, P. K. Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart. J. Vis. Exp. (143), e58448, doi:10.3791/58448 (2019).

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