여기, 우리는 높은 처리량 프로토콜 화면 extracellular 단백질 microarrays 소설 수용 체 ligand 상호 작용의 식별을 제시. 우리는 또한 단백질 microbead 복합물을 사용 하 여 일시적인 단백질-단백질 상호 작용의 탐지를 강화 하는 방법을 설명 합니다.
분 비 요인, 곁에 막 수용 체 그리고 그들의 상호 작용 협동자 셀룰러 통신의 주요 레 귤 레이 터 및 항상성 및 질병, 폭포를 신호의 시작 이며 같은 대표 주요 치료 대상. 이러한 상호 작용 네트워크 그들의 관련성에도 불구 하 고 현재 데이터베이스;에서 크게 이루어지지 남아 따라서, 세포 외 단백질 가장 문서화 바인딩 파트너가 있다. 이 불일치는 주로 기능 단백질, 고 약한, 낮은 선호도, 단백질 상호 작용 세포 표면 수용 체 간에 자주 설정의 식을 포함 하 여 세포 외 단백질의 연구와 관련 된 문제 때문입니다. 이 방법의 목적은 세포 외 단백질 단백질 단백질 상호 작용의 심사에 대 한 microarray 형식 라이브러리의 설명 이다. 약한 상호 작용의 탐지를 사용 하려면 쿼리 단백질 연구의 multimerization에 따라 메서드를 설명 합니다. 증가 multivalency이 multimerization microbead 기반 접근을 결합, 단백질 microarray 높은 처리량 과도 단백질-단백질 상호 작용의 강력한 검색을 수 있습니다. 이 메서드는 신속 하 고 낮은 샘플 사용-접근 어떤 세포 외 단백질에 적용 가능한 새로운 상호 작용의 식별을 위해 제공합니다. 단백질 microarray 인쇄 및 심사 프로토콜을 설명 합니다. 이 기술은 세포 외 공간 상호 작용 단백질의 발견에 대 한 강력한 방법을 추구 하는 수 사관을 위해 유용할 것 이다.
여기에 검토 하는 방법은 세포 외 단백질 microarray 형식,이 라이브러리에 대 한 관심의 대상의 심사에 대 한 방법으로 다음의 컬렉션의 인쇄를 설명 합니다. 우리는 낮은 바인딩 선호도 특징 상호 작용 검출을 위한 중요 한 단계로 단백질 multimerization를 확인 했습니다. 이러한 상호 작용의 탐지를 향상 시키기 위해, 우리 microbeads를 사용 하 여 관심사의 쿼리 단백질의 multimerization에 따라 프로토콜을 설명 합니다.
분 비 되며 세포 표면 표현 단백질 (총칭 하 여 세포 외 단백질에 게 불리는) 그들의 상호 작용 협동자 함께 셀룰러 통신, 신호 및는 microenvironment와의 상호 작용의 주요 레 귤 레이 터. 그들은, 따라서, 많은 생리와 병리학 과정 조절에 필수적인입니다. 인간 게놈 (≈5, 000 단백질)의 4 분의 1 약 extracellular 단백질에 대 한 인코딩, 체계적으로 전달 된 약물에 게 그들의 의미 및 접근성, 대표 약물 개발1에 대 한 주요 대상. 따라서, 세포 외 단백질 단백질 목표 시장, “druggable proteome”로 알려진에 승인 된 약물에 대 한 알려진 약리 작업의 70% 이상 대표. 그들의 중요성 및 풍부에도 불구 하 고 세포 외 단백질-단백질 상호 작용 (ePPI) 네트워크 현저 하 게 underrepresented 사용 가능한 데이터베이스에 남아 있습니다. 이것은 근본적으로 대부분의 사용 가능한 기술2를 사용 하 여 그들의 특성화 하는 걸로 extracellular 단백질의 복잡 한 생 화 확 적인 성격 때문 이다. 첫째, 막 단백질은 어려운 solubilize, 종종 거친 세척 조건 및 세제;를 포함 하는 프로세스 둘째, 세포 외 단백질 종종 부족 관련 포스트 번역 상 수정 때이 단백질은 표현에 일반적으로 결 석 있다 glycosylation 분리 시스템을 사용 합니다. 마지막으로, 같은 공동 수용 체 면역 세포에 수용 체 사이 상호 작용은 종종 과도 하 고 특징이 매우 낮은 선호도 (하 ~ 1 μ M에서 KD > 100 μ M 범위). 모두,이 단백질과 그들의 바인딩 파트너 가장 널리 렌더링의 자연 친 화력 정화/질량 분석 (AP/MS) 또는 효 모-2-하이브리드, 세포 외 공간에서 상호 작용의 탐지에 대 한 부적 절 한 같은 기술을 활용 2 , 3.
이러한 기술적 과제를 극복 하 고 extracellular 단백질에 대 한 새로운 상호 작용의 발견을 촉진 하기 위해, 우리는 높은 범위 extracellular 단백질 microarray4,5를 개발 했습니다. Microarrays 소량 샘플, 고밀도 표면 생성의 이점을 제공 하 고 높은 처리량 연구를 일반적으로 받을. 주로 특정 단백질 가족6,7, 또는 cytosolic 상호 작용에 초점을 맞추고 이기는 하지만 단백질 microarray 기반 연구 이전 여러 모델에 대 한 유기 체를 위한 단백질 상호 작용에 관련 된 통찰력 제공 8. 반면, 제한 된 작업은이 기술을 사용 하 여 세포 외 단백질 상호 작용을 조사 하기 위해 수행 되었습니다. 우리 정화 분 비 단백질의 포괄적이 고 매우 다양 한 라이브러리를 구축 하 여 ePPIs의 연구를 활성화 하는 단백질 microarray 방법을 개발 하 고 하나의 막 횡단 (STM) 수용 체 표현으로 재조합 세포 외 도메인 (ECD)에 융합 친 화력 정화4공통 태그 단백질 microarray 스크린의 성공 고품질 단백질 라이브러리의 설립에 크게 의존합니다. 라이브러리 및 쿼리 단백질의 표현을 위한 포유류 세포 또는 곤충 세포 우선적으로 선택 되었다 분리 식 시스템, 포스트 번역 상 수정 glycosylation 또는 이황화 채권 등의 적절 한 추가 되도록. SDS 페이지, 크기 배제 크로마토그래피 및 멀티 앵글 레이저 광 산란 일반적으로 재조합 단백질 품질을 평가 하기 위해 활용 하는 기술이 있습니다. 단백질 라이브러리는 다음 epoxysilane 슬라이드에 발견 하 고 장기간 사용-20 ° C에 저장. 0.4 mg/mL의 위 단백질 농도 프로토콜 아래에 설명 된 권장 됩니다. 따라서, 낮은 표현 단백질 농도 단계 샘플 인쇄 및 저장 하기 전에 필요할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고,이 기술의 주요 장점은 작은 양의 필요한 단백질 (단백질의 50 μ g은 수행 하기에 충분 한 > 2000 화면), 최소 쿼리 단백질 소비 (중복 화면 당 20-25 μ g)와 함께. 프로토콜 및 장비를 사용 하 여 설명, 그리고 제공 하는 라이브러리를 사용할 수 있는 개별 쿼리 단백질에 대 한 결과 1 작업 일 안에 생성 될 수 있습니다.
Extracellular 환경에 있는 단백질 상호 작용을 감지 하는 주요 과제는 가장 일반적으로 사용 되는 방법론에 의해 식별을 방해 그들의 특질 상 약하거나 과도 자연에서 발생 합니다. 바인딩 갈망을 크게 증가 약한 단백질 상호 작용9,,1011의 검출 감도 향상 시킵니다. 우리 multimerize 하는 방법을 개발 하는이 원칙에 따라 (Fc 융합으로 표현) 쿼리 단백질 단백질 A 코팅 구슬4,5를 사용 하 여. 무작위 라벨 쿼리 단백질의 어떤 잠재적인 비활성화를 방지, 우리 대신는 무관 한 인간 면역 글로불린 G와 Cy5 라벨을 추가 쿼리 단백질 함께 단백질 A 구슬에 따라서의 직접 활용으로 인해 모든 아티팩트를 제거는 관심사의 단백질에 염료. 여러 공동 수용 체 쌍의 micromolar 선호도 감안할 때, multivalent 단지 크게 신호 대 잡음 비, Fc-퓨전 쿼리 단백질 용 해 단백질4상영에 비해 향상 시킬.
요약 하자면,이 프로토콜의 목표 microarray 슬라이드 포함 하는 수용 체 ligand 상호 작용의 식별을 위해 기존의 세포 외 단백질 라이브러리의 준비를 설명 하는입니다. 우리는 슬라이드 인쇄, extracellular 단백질 라이브러리에 대 한 관심사의 단백질의 심사에 대 한 프로토콜에 대 한 단계를 검토 합니다. 또한, 우리는 연구에서 단백질의 증가 된 갈망을 달성 하기 위해 microbeads에 따라 ePPIs의 향상 된 검색 하는 방법을 설명 합니다. 여기에 설명 된 세포 외 단백질 microarray 기술 심사 및 낮은 허위 양성 비율와 소설 ePPI 감지만 그램 양의 아래 쿼리 단백질을 이용 하 여 빠르고, 강력 하 고 효과적인 접근 방식을 나타냅니다. 조사입니다. 이 기술 수용 체12,13,14, 바이러스 성 immunoregulators 포함 하 여 다양 한을 위한 이전에 알려지지 않은 세포 기능 및 신호 경로에 관련 된 통찰력을 제공 하는 여러 연구를 자극 했다 그리고 드 orphanize 관심사의 어떤 세포 외 단백질을 이용 될 수 있다.
고아 수용 체의 상당수는 인간 게놈에 남아 고 소설 상호 작용 파트너 이전 특징이 ligands과 세포 외 단백질에 대 한 등장을 계속 합니다. 항상성, 뿐만 아니라 질병, 이어지는 dysregulation 셀룰러 통신을 지정 하는 메커니즘을 이해 하 고 따라서 새로운 또는 향상 된 알려 필수적 이다 모형 유기 체 및 인간 상호 작용 수용 체 ligand 정의 치료 옵션입니다. 그럼에도 불구 하 고, 널리 사용 되는 기술에 의…
The authors have nothing to disclose.
우리 감사 Philamer Calses와 고베 yuen의 비판적 원고를 읽고. 우리는 우수한 기술 조언을 랜디 엔 감사입니다.
Ultra Pure MB Grade glycerol | USB Corporation | 56-81-5 | Protein storage |
SeptoMark blocking buffer | Zeptosens | BB1, 90-40 | Blocking buffer microarray slides |
Bovine serum albumin | Roche | 03-117-957-001 | Slide control for mask fitting (optional) |
Polypropylene multiwell plates | Greiner Bio One | 82050-678 | Protein storage |
Polypropylene multiwell plates | Arrayit | MMP384 | Slide printing |
NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Arrayit | NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Slide printing |
Micro spotting pins | Arrayit | Micro spotting pins | Slide printing |
ZeptoFOG blocking station | Zeptosens | ZeptoFOG blocking station, 1210 | Block slides after printing |
Skim milk powder | Thermo Fisher | LP0031 | Blocking solution |
Epoxysilane-coated glass slide | Nextrion Slide E | 1064016 | Microarray slides |
Glass holder and slide rack set | Wheaton | 900303 | Slide storage |
Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA23031 | Albumin labeling |
Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | Human IgG labeling |
Pro-spin desalting column | Princeton Separations | CS-800 | Remove free dye |
Adhesive aluminum foil seal | AlumaSeal | F-384-100 | Seal stock plates |
Polypropylene cryogenic vials | Corning | 430658 | Master vials for protein library storage |
Protein A microbeads | Miltenyi | 120-000-396 | Query protein multimerization |
Human IgG | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Irrelevant IgG for labeling |
Protein A | Sigma | P7837 | Microarray slide blocking |
Hybridization station, a-Hyb or similar | Miltenyi | Hybridization station, a-Hyb or similar | Automated microarray processing (optional) |
GenePix 4000B scanner or similar | Molecular Devices | GenePix 4000B scanner or similar | Slide scanning |
GenePix Pro or equivalent data extraction software | Molecular Devices | GenePix Pro or equivalent data extraction software | Data processing |
Signal P4.1 | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites |
TMHMM 2.0 server | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction of transmembrane helices in proteins |
Phobius | Stockholm Bioinformatics Center | online software | A combined transmembrane topology and signal peptide predictor |
TOPCONS | Stockholm University | online software | Prediction of membrane topology and signal peptides |