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Immunology and Infection

Isolement des cellules mononucléaires Lamina Propria du colon murine à l'aide de la collagène E

Published: September 26, 2019 doi: 10.3791/59821
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4,5
1Department of Pediatrics, Division of Hematology / Oncology and Bone Marrow Transplantation, University of Miami Miller School of Medicine, 2Batchelor Children's Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 3Department of Microbiology & Immunology, University of Miami Miller School of Medicine, 4Sylvester Comprehensive Cancer Center, University of Miami Miller School of Medicine, 5Holtz Children's Hospital, University of Miami Miller School of Medicine

Summary

Le but de ce protocole est d'isoler les cellules mononucléaires qui résident dans la lamina propria du côlon par digestion enzymatique du tissu à l'aide de collagène. Ce protocole permet l'isolement efficace des cellules mononucléaires résultant en une suspension de cellules simples qui à son tour peut être utilisé pour l'immunophénotypage robuste.

Abstract

L'intestin est la maison au plus grand nombre de cellules immunitaires dans le corps. Les petits et grands systèmes immunitaires intestinaux police l'exposition aux antigènes exogènes et modulent les réponses à de puissants stimuli immunitaires microbiens dérivés. Pour cette raison, l'intestin est un site cible principal de la dysrégulation immunitaire et de l'inflammation dans beaucoup de maladies comprenant mais, non limité aux maladies inflammatoires d'entrailles telles que la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse, la maladie de greffe-contre-hôte (GVHD) après os greffe de moelle (BMT), et de nombreuses conditions allergiques et infectieuses. Les modèles murines de l'inflammation gastro-intestinale et de la colite sont fortement employés pour étudier des complications de GI et pour optimiser précliniquement des stratégies pour la prévention et le traitement. Les données glanées à partir de ces modèles par l'intermédiaire de l'isolement et de l'analyse phénotypique des cellules immunitaires de l'intestin sont essentielles à une compréhension immunitaire plus poussée qui peut être appliquée pour améliorer les troubles gastro-intestinaux et inflammatoires systémiques. Ce rapport décrit un protocole très efficace pour l'isolement des cellules mononucléaires (MNC) du côlon utilisant une interface mélangée de gradient de densité de silice-basée. Cette méthode isole reproductiblement un nombre significatif de leucocytes viables tout en minimisant les débris contaminants, permettant le phénotypage immunitaire ultérieur par cytométrie d'écoulement ou d'autres méthodes.

Introduction

Bien que le tractus gastro-intestinal (GI) soit principalement dédié au traitement et à la réabsorption des nutriments des aliments, le tractus gastro-intestinal maintient également des rôles centraux dans l'intégrité des systèmes vasculaires, lymphatiques et nerveux et de nombreux autres organes par son système immunitaire muqueux et submucosal1. Le système immunitaire gastro-intestinal et systémique a un rôle influent en raison de son exposition constante à des antigènes étrangers provenant d'aliments, de bactéries commensales ou d'agents pathogènes envahissants1,2. Ainsi, le système immunitaire GASTRO doit maintenir un équilibre délicat dans lequel il tolère les antigènes non pathogènes tout en répondant de manière appropriée aux antigènes pathogènes1,2. Lorsque l'équilibre de la tolérance et de la défense est perturbé, la dysrégulation immunitaire localisée ou systémique et l'inflammation peuvent se produire résultant en une myriade de maladies1,2,3.

L'intestin abrite au moins 70% de toutes les cellules lymphoïdes dans le corps4. La plupart des interactions immunologiques primaires impliquent au moins une des trois stations immunitaires dans l'intestin : 1) Patchs de Peyer, 2) lymphocytes intraépithélial (IEL) et 3) lymphocytes lamina propria (LPL). Chacun d'eux est composé d'un réseau complexe interconnecté de cellules immunitaires qui répondent rapidement aux défis immunitaires normaux dans l'intestin5. Limité au stroma au-dessus de la muqueuse musculaire, la propria lamina vaguement structurée est le tissu conjonctif de la muqueuse intestinale et comprend l'échafaudage pour le villus, la vascularisation, le drainage lymphatique, et le système nerveux muqueux, ainsi que de nombreux innés et les sous-ensembles immunitaires adaptatifs6,7,8,9. LPL sont composés de CD4et CD8- lymphocytes T dans un rapport approximatif de 2:1, les cellules plasmatiques et les cellules de lignée myéloïde, y compris, les cellules dendritiques, les mastocytes, les éosinophiles et les macrophages6.

Il y a un intérêt croissant dans la compréhension de la dysrégulation immunisée et de l'inflammation de l'intestin en ce qui concerne divers états de la maladie. Des conditions telles que la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse se manifestent toutes de différents niveaux d'inflammation du côlon10,11,12. En outre, les patients présentant des troubles malins ou non malins de la moelle ou du système immunitaire qui subissent une transplantation allogénique de moelle (allo-BMT) peuvent développer diverses formes de colite comprenant 1) toxicité directe des régimes de conditionnement avant BMT, 2) infections provoquées par immunosuppression après BMT et 3 la maladie de greffe-contre-hôte (GVHD) conduite par les cellules T de distributeur-type réagissant aux allo-antigènes de distributeur dans les tissus après BMT13,14,15. Toutes ces complications post-BMT entraînent des altérations significatives dans le milieu immunitaire des intestins16,17,18. La méthode proposée permet une évaluation fiable de l'accumulation des cellules immunitaires dans le côlon de la souris et, lorsqu'elle est appliquée aux receveurs de murine après bMT, facilite un test efficace des cellules immunitaires des donneurs et des receveurs impliqués dans la tolérance à la greffe19 ,20. D'autres causes de l'inflammation intestinale incluent des malignités, des allergies alimentaires, ou une perturbation du microbiome intestinal. Ce protocole permet l'accès des cellules mononucléaires intestinales du côlon et, avec des modifications, aux leucocytes de l'intestin grêle dans l'un de ces modèles précliniques de murine.

Une recherche PubMed utilisant les termes de recherche "intestin ET cellule immunitaire ET isolement" révèle plus de 200 publications décrivant les méthodes de digestion de l'intestin grêle pour extraire les cellules immunitaires. Cependant, une recherche semblable de littérature pour le côlon ne donne aucun protocole bien délimité spécifiant l'isolement des cellules immunitaires du côlon. C'est peut-être parce que le côlon a plus de couches musculaires et interstitielles, ce qui le rend plus difficile à digérer complètement que l'intestin grêle. Contrairement aux protocoles existants, ce protocole utilise spécifiquement la collagène E de Clostridium histolyticum sans autres collagènes bactériens (Collagenase D/ Collagenase I). Nous démontrons que, utilisant ce protocole, la digestion du tissu colonique peut être réalisée tout en préservant la qualité des cellules immunitaires mononucléaires d'intestin d'isolement (MNC) sans l'addition des réactifs anti-clumping tels que le versenate de sodium (EDTA), Dispase II, et deoxyribonuclease I (DNAse I)21,22,23. Ce protocole est optimisé pour permettre l'extraction robuste reproductible de MNC viable du côlon murine pour d'autres études dirigées et devrait se prêter à l'étude de l'immunologie du côlon ou (avec des modifications) l'intestin grêle24, 25.

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Protocol

Toutes les études ont été menées dans le cadre de protocoles de recherche sur les rongeurs examinés et approuvés par l'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l'Université de Miami Miller School of Medicine, qui répond aux normes vétérinaires établies par l'American Association pour les sciences animales de laboratoire (AALAS).

1. Préparation de solutions

  1. Comme décrit dans le tableau 1, préparez le tampon de colon, les médias de séparation de densité basés sur la silice 100%, les médias de séparation de densité basés sur la silice 66%, les médias de séparation de densité basés sur la silice 44%, le tampon de digestion de collagène E, et le tampon FACS.
    1. Préparer Le tampon Colon la veille de l'intervention et conserver la nuit à 4 oC.
    2. Préparer 100% Silica-Based Density Separation Media la veille de l'intervention et stocké pendant la nuit à 4 oC, en plaçant à température ambiante le matin de la procédure pour décongeler.
    3. Préparer 66% et 44% Silica-Based Separation Media le matin de l'isolement, en utilisant la température ambiante 100% Silica-Based Density Separation Media et Colon Buffer.
    4. Mesurer la quantité appropriée de Clostridium histolyticum-dérivé de collagène E et stocker à -20 oC pendant la nuit avant la procédure. Le lendemain matin, dissoudre dans le volume approprié de Colon Buffer pour dériver Collagenase Digestion Buffer. Pour toutes les incubations avec Collagenase Digestion Buffer le jour de la procédure, préchauffez les solutions à 37 oC.
  2. Pour l'ensemble des étapes du protocole, garder une centrifugeuse à 20 oC et la vitesse de rotation de 859 x g,avec des freins inactivés (0 décélération) pour la centrifugation de gradient. Définir un autre à 4 oC et une vitesse de rotation de 859 x g, avec la décélération standard, pour les étapes de lavage.

2. Récolte du Colon

  1. Euthanasiez la souris par asphyxie co2 suivie d'une méthode de confirmation approuvée par l'AALAC.
  2. Placez la souris en position de supine et vaporisez la fourrure avec 70 % d'éthanol. À l'aide de gros ciseaux de tissu, faire une incision verticale de la ligne médiane et exposer le péritoine intact.
  3. À l'aide de ciseaux fins de dissection, ouvrir le péritoine. Utilisez des forceps pour déplacer les petites entrailles d'un côté et exposer le côlon descendant. Tirez légèrement vers le haut sur le côlon descendant pour exposer au maximum la partie rectale du côlon. Couper le rectum distal profondément dans le bassin et disséquer et enlever le côlon entier comme une unité, du rectum distal au capuchon de cecal.
  4. Transférer le côlon dans un tampon de colon réfrigéré de 20 ml dans un tube de polypropylène de 50 ml.

3. Nettoyage du colon

  1. Placez le côlon sur une serviette en papier humidifiée et extrayez les selles solides en appliquant une légère pression sur la paroi intestinale avec l'extrémité émoussée des ciseaux ou des forceps.
  2. Placer le côlon dans un plat Petri et rincer l'intestin avec 10 ml de tampon de colon réfrigéré à l'aide d'une seringue de 10 ml avec une aiguille de remplissage émoussée de 18 G.
  3. Transférer le côlon dans un tampon De papier absorbant Colon et enlever la mésenterie et la graisse avec l'extrémité pointue des ciseaux.
  4. Placer le côlon dans un plat Petri rempli de 5-10 ml refroidi Colon Buffer agitant manuellement pour laver le reste du contenu du côlon. Répéter 2-3 fois.
  5. Couper le côlon longitudinalement de son extrémité rectale plus musclée au côlon proximal (générant une seule pièce rectangulaire ouverte du côlon) dans un plat Petri rempli de tampon de colon frais réfrigéré. Jetez les supports existants et remplissez-le avec un tampon Colon propre et réfrigéré.
  6. Laver l'intestin 3 fois en le tourbillonnant vigoureusement dans le plat Petri et en remplaçant les 5-10 ml de tampon de colon réfrigéré après à chaque lavage.
  7. Placez le tissu rectangulaire du côlon sur une serviette en papier humidifiée avec le tampon de colon et coupez-le en le coupant horizontalement puis en petits fragments (3 mm x 3 millimètres sections).
  8. Recueillir soigneusement les fragments de deux points à l'aide de forceps fins dans 20 ml de tampon de colon réfrigéré dans un tube conique en polypropylène de 50ml.
  9. Laver les fragments de deux points 3 fois, chaque lavage dans 20 ml De tampon de colon, en faisant tourbillonner vigoureusement le tube pendant 30 s. Entre chaque agitation, laissez les fragments de tissu se déposer au fond du tube. Décant ou aspirateur aspirer le supernatant tout en empêchant la perte de fragment de tissu dans le processus d'aspiration entre chaque lavage.
    REMARQUE: Il n'est pas nécessaire de changer le tube après chaque lavage.

4. Digestion de collagène 1

  1. Ajouter 20 ml du tampon de digestion de Collagène aux fragments lavés de deux points dans le tube conique de polypropylène de 50 ml.
  2. Placer le tube fermé de 50 ml à 37 oC dans un shaker orbital incubé avec un taux de rotation fixé à 2 x g pendant 60 min. Assurez-vous que les fragments de tissu sont en mouvement constant pendant l'agitation; si nécessaire, augmentez le taux de rotation progressivement pour s'assurer qu'aucun fragment de tissu ne s'installe au fond du tube.

5. Préparer des gradients de médias de séparation basés sur la silice

  1. Préparer 66 % et 44 % de cellules à base de silice, en utilisant un support de séparation de densité à base de silice à 100 % à 20 oC (température ambiante) et un tampon De colon.
  2. Verser 5 ml de 66 % de silice à base de densité de séparation Dans chacun des 3 tubes de polypropylène séparés de 15 ml. Préparer 3 tubes par côlon. Cela forme la base de densité plus élevée de la procédure d'isolement de gradient, sur laquelle les supports de séparation de densité inférieure seront superposés pour créer le gradient de séparation.
  3. Conserver à 20 oC jusqu'à utilisation.

6. Collection de Supernatant de Digestion 1

  1. Recueillir seulement le supernatant à l'aide d'une pipette sérologique de 25 ml et filtrer le supernatant à travers une passoire à cellules de filtration de 40 porres placée dans un tube conique en polypropylène propre de 50 ml, après que la Digestion Decollagène 1 soit terminée. Veillez à ne pas aspirer les fragments de tissu existants.
    REMARQUE: Conservez les fragments de tissu visibles restants dans le tube. Ceux-ci subiront la digestion de deuxième collagène (étape 8).

7. Tampon de digestion de collagène de Collagène quenching

  1. Remplir complètement le tube de polypropylène de 50 ml de tampon de colon réfrigéré.
    REMARQUE: La collagène est active à 37 oC; tampon refroidi inactive donc cette enzyme.
  2. Centrifuger le tube à 4 oC à 800 x g pendant 5 min.
    1. Jeter le supernatant par aspiration sous vide. Laver les cellules avec 25 ml de tampon de colon frais et centrifugeuse à 800 x g pendant 5 min.
    2. Resuspendre la pastille en moins de 1 ml de tampon de colon frais réfrigéré.
    3. Placer le tube conique en polypropylène de 50 ml sur la glace.

8. Digestion de collagène 2

  1. Répétez l'étape 4 (Digestion 1) avec les fragments de tissu restants retenus de l'étape 6.1.

9. Désaggrément des tissus après digestion 2

  1. Rincer vigoureusement les fragments de tissu entre le tube et une seringue de 10 ml à travers une aiguille émoussée de 18 G.
  2. Répétez cette chasse d'eau pour un minimum de 7-8 passages complets, en continuant jusqu'à ce qu'aucun fragment de tissu brut ou des débris ne soient visibles.

10. Cellules filtrantes

  1. Passez la suspension de désaggrément des tissus à travers une passoire à cellules de filtration de 40 porres dans un tube de polypropylène propre de 50 ml.
  2. Laver la passoire à cellules de tissu de filtration avec 10 ml de tampon de colon réfrigéré pour récupérer toutes les cellules emprisonnées dans le filtre.

11. Digestion de collagène étanchéité

  1. Remplir le tube conique en polypropylène de 50 ml jusqu'à la jante avec un tampon de colon réfrigéré.
    REMARQUE: La température de Colon Buffer est essentielle pour assurer l'étanchéité de l'activité de collagène.
  2. Faire tourner à 4 oC et 800 x g pendant 5 min.
  3. Jeter le supernatant par aspiration sous vide.
  4. Laver en reconfinant en 25 ml de tampon de colon frais etréfrigéré, suivi d'une centrifugation à 4 oC, 800 x g pendant 5 min.
  5. Jeter le supernatant par aspiration sous vide.
  6. Regroupez le granule resuspendu de La Digestion De Collagène 1 (étape 7) à son tube correspondant à partir de l'étape 11.4.
  7. Répéter l'étape 11.4 (lavage et centrifugation).

12. Séparation de la densité basée sur la silice Gradient Demlaï

REMARQUE: Effectuer les étapes 12-18 aussi rapidement que possible, afin d'assurer un étanchéité rapide de l'activité de collagène.

  1. Après l'étape 11.7, resuspendre chaque granule dans 24 mL total de 44% Silica-based Density Separation Media par colon.
  2. Couche lentement 8 ml du support à partir de l'étape 12.1 sur chacun des trois tubes préparés à l'étape 5.2 (contenant 66% de silice à base de densité de séparation Des médias), à l'aide d'une pipette sérologique de 10 ml. Maintenir un flux régulier et lent du support de séparation de densité de 44 % tout en superposant le gradient afin d'éviter la perturbation de l'interface.
  3. Équilibrez soigneusement tous les tubes dans les seaux de centrifugeuse à l'aide d'une balance ou d'un équilibre.
  4. Faire tourner les tubes 20 min à 859 x g dans une centrifugeuse sans frein à 20 oC. Permettre aux rotors de s'immobiliser avant d'enlever les tubes, en prenant soin de ne pas perturber les cellules à l'interface de gradient.

13. Recueillir des cellules mononucléaires à partir de l'interface Gradient

  1. Visualisez l'interface de gradient (près de la marque de 5 ml), où une bande blanche de 1 à 2 mm d'épaisseur (contenant mNC) est présente.
    REMARQUE: On peut ou ne peut pas voir une bande blanche. Cependant, MNC sera à cette interface et devrait obscurcir la clarté de l'interface de gradient.
  2. Aspirez et videz les 7 ml supérieurs du gradient supérieur pour faciliter l'accès à l'interface.
  3. À l'aide d'une aspiration manuelle continue et d'un mouvement régulier du poignet, recueillir la couche d'interface des cellules dans un tube conique en polypropylène propre de 50 ml. Recueillir jusqu'à ce que l'interface entre les 2 gradients est clair et réfractaire (clair des cellules).
  4. Remplissez le tube de collecte de 50 ml de tampon FACS réfrigéré. Faire tourner à 4 oC, 800 x g pendant 5 min.
  5. Aspirez le supernatant par aspiration sous vide et suspendez la pastille dans 1 mL de FACS Buffer.
  6. Compter les cellules sur un hémocytomètre à une dilution 1:2 en utilisant des méthodes appropriées d'exclusion des cellules mortes.
  7. Procédez à la coloration FACS ou à d'autres essais avec le MNC colonique fraîchement isolé.

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Representative Results

En travaillant avec des modèles de maladie du côlon maurine, il est utile d'être en mesure de quantifier et d'évaluer qualitativement, parmi le MNC du côlon, plusieurs sous-ensembles de cellules immunitaires impliqués dans le processus inflammatoire. La suspension unicellulaire de MNC obtenue par l'application de ce protocole facilite une telle caractérisation phénotypique d'une manière robuste et reproductible. Comme preuve de principe pour l'application de cette méthode d'isolement dans divers contextes expérimentaux, nous avons récupéré le MNC du côlon en utilisant cette méthode et effectué la cytométrie multi-paramètres de flux sur des cellules isolées de souris avec (Figure 1 et Figure 2 , Allogeneic BMT) et sans (Figure 2A, Syngeneic BMT) des lésions coloniques immunomédiques significatives après BMT.

La cytométrie de flux et les analyses de données ont été effectuées pour comparer les fractions des lymphocytes morts apoptotiques et nécrotiques lors de l'utilisation de la Collagène E ou D pour l'isolement, avec ou sans traitement DNase 1. La stratégie de gating utilisée pendant la cytométrie du débit est fournie à la figure 1A.  Après l'annexe V (marqueur d'apoptose) et la coloration fixe Live/Dead Blue (marqueur de nécrose) sur les suspensions unicellulaires suivant chaque isolement, La collagène E sans DNAse a montré un pourcentage significativement plus élevé d'annexine Vneg Cellules vivantes/bleu mortneg cellules vivantes (médiane 43,3%, gamme 26,5%-59,9% ,n - 3) après isolement par rapport à la Collagène D sans DNAse (médiane 8,7%, gamme 3,6%-10,2%, n - 3), même par rapport à Collagenase E - DNAse (médiane 8,18%, gamme 4,7%-20,4%, n Collagène D et DNAse (médiane 15,10 %, fourchette de 9,9 % à 21,4 %, n - 3). De plus, nous avons identifié les cellules nécrotiques De l'annexe VnegLive/Dead BlueMD à un pourcentage médian de 41,0 % dans le groupe Collagène E (gamme 37,1 % à 58,8 %, n - 3) contre 90,0 % dans le groupe Collagène D (gamme 69,7 % à 95,5 %, n - 3), 75,9 % dans le Groupe DeNAse groupe De Collagène D et DNAse, respectivement (gamme 65,7% à 79,5%, 54,9%-89,9%, n - 3). Les parcelles FACS représentatives de l'animal n '1 dans chaque groupe sont montrées Figure 1B).

Comme preuve supplémentaire de principe de la cohérence et du rendement de MNC viable utilisant cette procédure dans les souris malades, la cytométrie de flux multi-parametric a été appliquée au MNC isolé des souris bénéficiaires de CD45.2 BALB/c le jour 7 après réception de BMT de l'un ou l'autre allogeneic (CD45.1 C57BL/6 donneur) ou syngénéique (Donneur CD45.1 BALB/c) modèles BMT. À l'aide des nombres absolus de MNC multipliés par des sous-ensembles immunitaires à barrière de pourcentage obtenus par des analyses de cytométrie du débit, le nombre absolu de cellulesCD4 et CD8 des donneurs extraits du côlon du receveur de BMT pourrait être calculé et comparé (n - 4 par groupe, figure 2A). Puisqu'il peut être important d'identifier et/ou de quantifier les populations rares de cellules immunitaires dans de tels modèles de souris, nous avons évalué des sous-ensembles rares comprenant le donneur dérivé (CD45.1)les cellules de régulation de Foxp3et T (Treg) dans les modèles syngénéiques et allogéniques de BMT. La stratégie de gating pour atteindre les cellules Treg de donneur (CD4-CD25-FoxP3)de la suspension de cellule unique anticorps-tachée est montrée (séquencedes portes délimitées par une flèche rouge ; Figure 2B). À l'aide de cette méthode, même des sous-ensembles rares tels que le donneur dérivé du côlon Treg infiltrer le côlon de la souris receveur après BMT pourrait être analysé (Figure 2C, parcelle représentative; n - 1).

La figure 3 montre une application étendue de cette méthode dans les données historiques de notre groupe utilisant le protocole présenté pour comparer l'accumulation de cellules T dérivées du don DeCmD par rapport aux lymphocytes T dérivés de Don CD4MD dans le côlon des souris BALB/c protégées ou non protégées de GVHD par le traitement pré-BMT pré-BMT régime pré-bparatif (conditionnement)20. Les schémas préparatifs testés comprenaient 800 irradiations corporelles totales cGy/myéloablative (TBI800) ou TBI non myélobolatif (400TBI), ainsi que le conditionnement non myéloboablatif utilisant l'irradiation lymphoïde totale (TLI) dans laquelle l'irradiation a été délivrée à la lymphe noeuds, thymus et rate avec blindage du crâne, des poumons, des membres, du bassin et de la queue. Tout le conditionnement a été combiné avec le sérum d'anti-thymocyte (ATS), un agent immunomodulating. Dès le 6e jour après le BMT, ce protocole d'isolement du MNC colonique a donné lieu à des analyses cytométriques de débit robustes par rapport à des analyses identiques sur des organes cibles GVHD enrichis en lymphocytes tels que la rate et les ganglions lymphatiques mésentériques (MLN) (figure 3A)20 . L'isolement reproductible de la MNC du côlon chez les receveurs de BMT (n - 7-10 par groupe de traitement) a permis une comparaison statistique robuste du nombre absolu de cellules T cD8 des donneurset des lymphocytes T effecteurs entre différents groupes de traitement de conditionnement pré-transplantation ( Figure 3B), donnant des données importantes sur les phénotypes immunitaires qui ont mené à des études clés révélant les mécanismes immunitaires innés de la protection GVHD contre TLI par opposition au conditionnement pré-BMT de TBI. 20 Ans, états-unis

Figure 1
Figure 1 : Analyse cytométrique du flux MNC colonique au jour 7 après BMT dans les systèmes allogeneic de modèle de souris une fois isolé avec Le Collagène E et D avec et sans DNAse 1. Les souris de type sauvage (WT) (CD45.2) BALB/c (H2Kd)ont reçu le BMT de CD45 congéniques (CD45.1)C57BL/6 souris donneuses (Allogeneic BMT, n ' 3 par groupe). WT (CD45.2)LES souris bénéficiaires de BALB/c ont été administrées 800cGy TBI (BALB/c) 1 jour avant BMT. Au jour 7 après BMT, des suspensions unicellulaires du côlon receveur ont été préparées selon les méthodes de ce manuscrit avec l'utilisation de Collagenase E (100 U/mL), De Collagène E (100 U/mL) avec DNAse 1 (500 g/mL), Collagenase D (500 g/mL), ou Collagenase D (500g/mL) avec dNAse 1 (500g/mL) (n ' 3 par groupe). Les cellules étaient tachées d'anticorps Live/dead-UV450 (Live/Dead Blue), D'Annexin V-APC, H-2Kd-PE, CD45.1-BV605, CD3-FITC, CD4-BV711, CD8-APC-Cy7, FoxP3-Pacific Blue et CD11b-PE-Cy7. (A) Stratégie de gating pour les analyses FACS. Porte 0, diffusion vers l'avant (FSC-A) et diffusion latérale (SSC-A) sur la suspension unicellulaire de MNC utilisée pour identifier les leucocytes; Porte 1, exclusion des cellules non individuelles utilisant SSC-A; Porte 2, exclusion des cellules non individuelles utilisant FSC-A; Porte 3, identification de l'annexinvle V-positive (apoptotique) et de la teinture de viabilité réparable Live/Dead-UV450-Annexe V-négatif (nécrotique) sous-ensembles cellulaires. (B) Parcelles FACS représentatives de l'annexine V et de la coloration de colorant de viabilité réparable des leucocytes fermés parmi MNC pour les 4 groupes expérimentaux. N 1 souris représentative par groupe en groupes : Collagène E (100 U/mL), Collagène E (100 U/mL) - DNAse 1 (500 g/mL), Collagène D (500 g/mL), et Collagène D (500 g/mL) Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Caractérisation cytométrique de flux du MNC du côlon au jour 7 après BMT dans les systèmes de modèle de souris allogéniques et syngéniques. Les souris WT (CD45.2)C57BL/6 (H2Kd-neg) et BALB/c (H2Kd')ont reçu du BMT à partir de CD45-congéniques (CD45.1)C57BL/6 et DEGA/c(MD) (BMT syngénique ou allogénique, n ' 4 par groupe expérimental). Les souris bénéficiaires c57BL/6 et BALB/c ont reçu des schémas de conditionnement préparatifs de 950cGy (C57BL/6) et de 800cGy (BALB/c) myéloablative TBI, livrés un jour avant BMT. Au jour 7 après BMT, des suspensions unicellulaires du MNC colonique receveur ont été préparées suivant les méthodes de ce manuscrit. Les cellules ont été tachées avec Live-dead-BV510, H-2Kd-PE, CD45.1-BV605, CD4-FITC, CD8-APC-Cy7, CD25-PacificBlue, FoxP3-AF647, et CD11b-PE-Cy7 anticorps, N - 4 souris par groupe. (A) Nombre absolu moyen de SEM (log 10) CD45.1- H-2kd-neg ou CD45.1- H-2kdMD (type donneur, dans chaque cas) CD11bnegCD4 et CD8- cellules T isolées du côlon receveur au jour 7 après conditionnement et CD45.1 C57BL/6 (donateur) ' CD45.2 BALB/c (bénéficiaire) BMT. N 4 par groupe. (B) Stratégie de gating pour les analyses FACS. Porte 0, diffusion vers l'avant (FSC-A) et diffusion latérale (SSC-A) sur la suspension unicellulaire de MNC utilisée pour identifier les leucocytes; Porte 1, exclusion des cellules non individuelles utilisant SSC-A; Porte 2, exclusion des cellules non individuelles utilisant FSC-A; Porte 3, sélection des cellules vivantes Porte 4, séparation des cellules hématopoïétiques du donneur de BMT par rapport à l'origine du receveur de BMT; Porte 5, sélection des cellules de lignée non myéloïdes de donneur ; Porte 6, gating sélectif des cellules CD4et T; Porte 7, gating séparé des cellules de régulation CD4etCD25etFoxP3et T (Treg). La flèche rouge dénote la stratégie de filtillation de forage vers le bas. (C) Représentation des parcelles FACS de CD25 et FoxP3 coloration en utilisant la stratégie de gating dans (B) au jour 7 après le conditionnement et BMT dans le côlon d'un bénéficiaire BALB / c de BMT allogénique (C57BL / 6 BALB /c). Le pourcentage de cellules dans chaque porte est donné à l'intérieur de la porte. WT - type sauvage; TBI - irradiation totale du corps; BM 10 x 106 CD45.1- congénique C57BL/6 ou BALB/c cellules de moelle osseuse de donneur ; Teff et t effecteurs de cellules; Treg - Foxp3- T cellules réglementaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : TLI/ATS non myélobitrique, mais pas le conditionnement TBI/ATS, diminue l'accumulation de lymphocytes T du donneur TCRMDCD8. (A) Représentation des parcelles FACS de cD4 et CD8 de coloration h-2K b-TCRMD- cellules du donneur H-2Kb ' C57BL/6 souris en rate (rangée supérieure), ganglion lymphatique mésentérique (MLN) (rangée du milieu), et du côlon (rangée inférieure) des destinataires le jour 6 après conditionnement et transplantation. Le pourcentage de cellules dans chaque porte est donné au-dessus de la porte. (B) Nombre absolu moyen de SEM (log 10) H-2KbMDTCRMD-CD8- cellules en rate (panneau supérieur), MLN (panneau moyen) et colon (panneau inférieur) des destinataires au jour 6 après conditionnement et BMT. WT - type sauvage; TBI - irradiation totale du corps; TLI : irradiation lymphoïde totale ; ATS - sérum anti-thymocyte; BM 50 x 106 Cellules de la moelle osseuse des donneurs WT C57BL/6; SPL 60 x 106 Cellules de la rate des donneurs WT C57BL/6; TBI800, TBI400 - cGy doses de myéloablatif (TBI800) ou non-myélobitrique (TBI400) TBI. Ce chiffre a été modifié à partir de van der Merwe et coll.20. Droit d'auteur 2013. L'American Association of Immunologists, Inc. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

solution formule
Tampon De Colon 500 mL de RPMI à 10 mM HEPES et 10 % de FBS (inactivé à 56oC pendant 60 minutes, pH ajusté à 7,3)
Silica-Based Density Gradient Media 100% (par côlon) 22,5 mL de gradient de densité basé sur la silice - 2,5 mL de 10x PBS.
Silica-Based Density Gradient Media 66% (par côlon) 10,72 mL Silica-Based Density Gradient Media 100 % - 5,28 mL Colon Buffer
Gradient de densité basé sur la silice Media 44% (par côlon) 11 mL Silica-Based Density Gradient Media 100% - 14 mL Colon Buffer
Tampon de digestion de Collagène (par côlon) 100 U/mL de Collagène E de Clostridium histolyticum, dissous en 40 ml Colon Buffer
Tampon FACS 500 mL 1x PBS 5 g bSA 1 mm EDTA 0,2 g d'azide de sodium

Tableau 1 : Table de préparation des solutions.

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Discussion

Ce protocole visuel décrit des méthodes bien tolérées pour l'isolement des cellules mononucléaires du côlon, y compris les lymphocytes lamina propria (LPL). Étant donné que ce protocole a été optimisé dans l'évaluation des modèles graves de colite de souris post-transplantation où les cytokines inflammatoires et les lésions tissulaires se prêtent à une faible viabilité de la MNC récupérée, nous prévoyons que ces méthodes peuvent être traduites à d'autres applications nécessitant une analyse phénotypique du MNC du côlon. Ceux-ci incluent mais, ne se limitent pas à évaluer l'inflammation de deux points dans les modèles de souris de la maladie intestinale inflammatoire, des études des réponses immunitaires des traitements colite-ciblés, et la colite produite par des agents pathogènes infectieux. En outre, nos données utilisant des isolements chez des souris saines (Syngeneic BMT) indiquent que la procédure d'isolement ne nécessite pas d'infiltration inflammatoire significative pour permettre la détection des cellules immunitaires dans les isolats MNC. En effet, des données similaires ont été obtenues à l'aide de souris saines non traitées (non-BMT) (données non présentées).

Plusieurs étapes clés de ce protocole le différencient des autres méthodes publiées et contribuent à un rendement et à une viabilité élevés. Par exemple, l'optimisation de l'activité de collagène E dérivée de Clostridium histolyticum(100 U/mL niveau d'activité final) permet des calculs cohérents pour différents lots d'enzymes sur des expériences à longue portée26. Il y a 28 membres différents dans la famille de collagène, constituant ensemble presque 30% de toutes les protéines dans le corps de mammifères27. En outre, différents tissus ont des distributions distinctes de sous-types de collagène, chacun nécessitant des collagènes uniques pour la digestion28. La collagène de C. histolyticum comprend 6 protéines différentes classées en deux classes29,30. Le type spécifique de collagène utilisé peut modifier la viabilité et la qualité globale des cellules isolées du côlon31. Des études antérieures ont démontré que le collagène de type C-2139 (Collagenase E) permet un rendement élevé des lymphocytes chez les MNC isolés de l'intestin grêle25. Cependant, ces protocoles n'ont pas abordé la digestion du côlon, un organe beaucoup plus musculaire avec la composition sensiblement plus complexe de collagène que l'intestin grêle.

L'adéquation et la fiabilité de la dégradation des tissus enzymatiques est un facteur établi influençant le rendement et la viabilité des cellules globales en minimisant le besoin de perturbation mécanique récurrente (qui induit une augmentation des traumatismes mécaniques dans le tissu). En raison d'une digestion enzymatique adéquate du collagène interstitiel et muqueux à l'aide d'un protocole spécifique à la collagène E (par rapport aux protocoles de digestion par le collagène D-mediated dans l'utilisation standard), ce protocole minimise la quantité de manipulation mécanique de les fragments de tissu nécessaires pour perturber l'interstitium et libérer les sous-ensembles de cellules immunitaires en suspension. Cela améliore encore la viabilité de la MNC isolée pour les essais ultérieurs. Comme le montrent les données (figure 1B), cela élimine le besoin d'ADN et d'autres manœuvres chimiques ou mécaniques anti-agglutination au-delà de la filtration standard d'une suspension à une seule cellule à travers une passoire. D'autres rapports décrivant l'isolement des cellules lymphoïdes intestinales ont utilisé le dithiothreitol (TNT) et l'EDTA comme agents mucolytiques pour améliorer le rendement et la viabilité des leucocytes mononucléaires isolés24.

Un autre aspect unique de ce protocole qui améliore le rendement cellulaire est l'application d'un gradient de séparation de la densité à base de silice affiné. D'autres méthodes de digestion articles publiés à ce jour n'utilisent pas un tel gradient de séparation de densité21,31. Cependant, dans l'expérience des auteurs et ceux des collaborateurs utilisant ce protocole pour isoler les cellules lymphoïdes fonctionnellement actives, la purification de gradient de densité améliore la viabilité et la pureté de MNC récupérée après digestion19 , 20 Ans, états-unis , 32.

Bien que n'est pas un foyer de ce manuscrit, digne de mention pour ceux qui travaillent avec des modèles d'inflammation intestinale chez les souris, c'est que les méthodes de ce manuscrit peuvent être modifiés pour permettre l'isolement similaire de haute qualité de MNC viable de l'intestin grêle. La modification du protocole colonique primaire requis pour atteindre ceci est l'utilisation d'une digestion simple de 90 min (plutôt que deux digestions de 60 min), avec toutes les autres étapes (y compris le niveau d'activité enzymatique et les étapes d'étancher) identiques à ceux montrés. Cette modification donne généralement une gamme de 0,8-4 x 106 MNC par intestin grêle sans ou 1,5-2,5 x 106 MNC avec l'inclusion de l'iléo terminal, y compris le bouchon cecal riche en leucocytes. Par conséquent, une nouveauté de ce protocole est que l'application du protocole primaire au côlon et le protocole modifié à l'intestin grêle, on pourrait isoler MNC avec une forte reproductibilité et une bonne viabilité de l'intestin grêle et le côlon de l'individu animaux expérimentaux dans la même expérience.

En résumé, le protocole décrit permet l'isolement efficace et reproductible des cellules mononucléaires du côlon ou, avec des modifications, de l'intestin grêle. Avec 2 opérateurs compétents travaillant ensemble, jusqu'à 10 colons séparés peuvent être traités et analysés sur une seule journée, et les suspensions unicellulaires peuvent être prêtes pour l'analyse phénotypique et fonctionnelle ultérieure dans un délai de 6-8 h à partir de la récolte des tissus. L'application de ce protocole peut s'avérer utile pour d'autres objectifs de recherche nécessitant l'évaluation immunitaire de l'inflammation du côlon, permettant à d'autres chercheurs de caractériser le système immunitaire du côlon de la souris d'une manière rigoureuse et reproductible.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Acknowledgments

Ce travail a été appuyé par des subventions #1K08HL088260 et #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.), et la Batchelor Foundation for Pediatric Research (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). Les souris C57BL/6 et BALB/c utilisées dans cette étude ont été élevées dans notre établissement ou fournies par Jackson Labs ou Taconic.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60 mm Petri DIsh Thermo Scientific 150288
1x PBS Corning 21-040-CV
10x PBS Lonza BioWhittaker BW17-517Q
10 mL Disposable Serological Pipette Corning 4100
10 mL Syringe Becton Dickinson 302995
15 mL Non-Sterile Conical Tubes TruLine TR2002
18 G Blunt Needle Becton Dickinson 305180
25 mL Disposable Serological Pipette Corning 4250
40 μm pore size Cell Strainer Corning 352340
50 mL Falcon Tube Corning 21008-951
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A4503-1KG
Fixation Buffer Biolegend 420801
E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum Sigma C2139
EDTA, 0.5 M Sterile Solution Amresco E177-500ML
Fetal Bovine Serum Thermo /Fisher Scientific -HyCLone SV30014.03
HEPES GE Healthcare-HyClone SH30237.01
Percoll GE Healthcare-Life Sciences 1708901
RPMI Medium Corning 17-105-CV
Sodium Azide VWR Life Science Amresco 97064-646
Trypan Blue Lonza BioWhittaker 17-942E

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References

  1. Schneeman, B. Gastrointestinal physiology and functions. British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).
  2. Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract. Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).
  3. Blumberg, R. S. Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment. Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).
  4. Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut. Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).
  5. Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N. Isolation of T Cells from the Gut. T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Waisman, A., Becher, B. , Humana Press. New York, NY. 21-25 (2014).
  6. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional Specialization within the Intestinal Immune System. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
  7. Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).
  8. Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria. Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).
  9. Mowat, A. M., Viney, J. L. The anatomical basis of intestinal immunity. Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).
  10. Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J. Irritable Bowel Syndrome. The New England Journal of Medicine. 376 (26), 2566-2578 (2017).
  11. Harb, W. J. Crohn's Disease of the Colon, Rectum, and Anus. Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).
  12. Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F. Ulcerative Colitis. The Lancet. 389 (10080), 1756-1770 (2017).
  13. Mohty, B., Mohty, M. Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update. Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).
  14. Hatzimichael, E., Tuthill, M. Hematopoietic stem cell transplantation. Stem cells and cloning: advances and applications. 3, 105-117 (2010).
  15. Hernandez-Margo, P. M., et al. Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation. Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).
  16. Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).
  17. Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children. Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).
  18. Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management. Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).
  19. Shuyu, E., et al. Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine β-thalassemia. Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).
  20. van der Merwe, M., et al. Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation. Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).
  21. Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (111), e54114 (2016).
  22. Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
  23. Weigmann, B. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue. Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).
  24. Bull, D. M., Bookman, M. A. Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells. Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).
  25. Davies, M. D., Parrott, D. M. Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine. Gut. 22, 481-488 (1981).
  26. Carrasco, A., et al. Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa. Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
  27. Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).
  28. Harrington, D. J. Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease. Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).
  29. Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases - A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).
  30. Autengruber, A., et al. Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function. European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
  31. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
  32. van der Heijden, P. j, Stok, W. Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine. Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).

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Isolement des cellules mononucléaires Lamina Propria du colon murine à l'aide de la collagène E
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McManus, D., Novaira, H. J., Hamers, A. A. J., Pillai, A. B. Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E. J. Vis. Exp. (151), e59821, doi:10.3791/59821 (2019).

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