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Immunology and Infection

Murine Colon से Lamina Propria मोनोन्यूक्लियर सेल के अलगाव Collagenase ई का उपयोग

Published: September 26, 2019 doi: 10.3791/59821
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4,5
1Department of Pediatrics, Division of Hematology / Oncology and Bone Marrow Transplantation, University of Miami Miller School of Medicine, 2Batchelor Children's Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 3Department of Microbiology & Immunology, University of Miami Miller School of Medicine, 4Sylvester Comprehensive Cancer Center, University of Miami Miller School of Medicine, 5Holtz Children's Hospital, University of Miami Miller School of Medicine

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को अलग करना है जो कोलैजानेस का उपयोग करके ऊतक के एंजाइमी पाचन द्वारा बृहदान्त्र के पटल प्रोप्रिया में रहते हैं। इस प्रोटोकॉल मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के कुशल अलगाव के लिए अनुमति देता है जिसके परिणामस्वरूप एक एकल सेल निलंबन जो बदले में मजबूत इम्यूनोफेनोटाइपिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Abstract

आंत शरीर में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की सबसे बड़ी संख्या के लिए घर है. छोटे और बड़े आंतों की प्रतिरक्षा प्रणाली exogenous एंटीजन के लिए पुलिस जोखिम और शक्तिशाली माइक्रोबियल व्युत्पन्न प्रतिरक्षा उत्तेजनाओं के लिए प्रतिक्रियाओं को व्यवस्थित. इस कारण से, आंत प्रतिरक्षा डिस्रेग्युलेशन और सूजन का एक प्रमुख लक्ष्य साइट है जिसमें कई बीमारियों शामिल हैं, लेकिन हड्डी के बाद क्रोहन रोग और अल्सरेटिव कोलाइटिस, भ्रष्टाचार-वर्सस-होस्ट रोग (जीवएचडी) जैसे सूजन आंत्र रोगों तक सीमित नहीं है। मज्जा प्रत्यारोपण (BMT), और कई एलर्जी और संक्रामक स्थितियों. जठरांत्र सूजन और कोलाइटिस के Murine मॉडल भारी जीआई जटिलताओं का अध्ययन करने के लिए और पूर्व नैदानिक रोकथाम और उपचार के लिए रणनीतियों का अनुकूलन करने के लिए उपयोग किया जाता है। आंत से प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अलगाव और phenotypic विश्लेषण के माध्यम से इन मॉडलों से gleaned डेटा आगे प्रतिरक्षा समझ है कि जठरांत्र और प्रणालीगत सूजन विकारों को सुधारने के लिए लागू किया जा सकता करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह रिपोर्ट एक मिश्रित सिलिका आधारित घनत्व ढाल इंटरफेस का उपयोग कर बृहदान्त्र से मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (MNC) के अलगाव के लिए एक अत्यधिक प्रभावी प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। इस विधि reproducibly व्यवहार्य ल्यूकोसाइट्स की एक महत्वपूर्ण संख्या को अलग करते हुए मलबे को कम करने, प्रवाह साइटोमेट्री या अन्य तरीकों से बाद में प्रतिरक्षा phenotyping की अनुमति.

Introduction

हालांकि जठरांत्र (जीआई) पथ मुख्य रूप से भोजन से पोषक तत्वों के प्रसंस्करण और पुनः अवशोषण के लिए समर्पित है, जीआई पथ भी संवहनी, लसीका, और तंत्रिका तंत्र और कई अन्य अंगों के माध्यम से की अखंडता में केंद्रीय भूमिकाओं को बनाए रखता है इसका म्यूकोसल और सबम्यूकोसल प्रतिरक्षा प्रणाली1. जीआई प्रतिरक्षा प्रणाली दोनों जठरांत्र और प्रणालीगत स्वास्थ्य में एक प्रभावशाली भूमिका है भोजन से विदेशी प्रतिजनों के लिए अपने निरंतर जोखिम के कारण, commensal बैक्टीरिया, या रोगजनकों पर हमला1,2. इस प्रकार, जीआई प्रतिरक्षा प्रणाली को एक नाजुक संतुलन बनाए रखना चाहिए जिसमें यह रोगजनक एंटीजन1,2को उचित जवाब देते समय गैर-रोगजनक एंटीजन को सहन करता है। जब सहिष्णुता और रक्षा का संतुलन बाधित हो जाता है, स्थानीयकृत या प्रणालीगत प्रतिरक्षा अपविनियमन और सूजन हो सकती है जिसके परिणामस्वरूप असंख्य रोग1,2,3हो सकते हैं .

आंत शरीर में सभी लसीकाभ कोशिकाओं का कम से कम 70% हिस्सा है4. सबसे प्राथमिक इम्यूनोलॉजिक बातचीत में आंत में तीन प्रतिरक्षा स्टेशनों में से कम से कम एक शामिल है: 1) पीयर के पैच, 2) इंट्राएपिथेल लिम्फोसाइट (आईईएल) और 3) लेमिना प्रोपेरिया लिम्फोसाइट्स (एलपीएल)। इनमें से प्रत्येक में प्रतिरक्षा कोशिकाओं का एक जटिल परस्पर नेटवर्क होता है जो आंत5में सामान्य प्रतिरक्षा चुनौतियों का तेजी से जवाब देता है . पेशी mucosae ऊपर stroma करने के लिए प्रतिबंधित, ढीला संरचित पटल प्रोपरिया आंत mucosa के संयोजी ऊतक है और गांव के लिए मचान भी शामिल है, vasculature, लसीका जल निकासी, और mucosal तंत्रिका तंत्र, साथ ही कई सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा सबसेट6,7,8,9. एलपीएल में सीडी 4+ और सीडी 8+ टी कोशिकाओं को 2:1, प्लाज्मा कोशिकाओं और माइलॉयड वंश कोशिकाओं सहित, डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं, मस्तूल कोशिकाओं, eosinophils और मैक्रोफेज6के अनुमानित अनुपात में शामिल हैं।

प्रतिरक्षा विनियमन और आंत की सूजन को समझने में बढ़ती रुचि है क्योंकि यह विभिन्न रोग राज्यों से संबंधित है। क्रोहन रोग और अल्सरेटिव कोलाइटिस जैसी स्थितियां सभी कोलोनिक सूजन के विभिन्न स्तरों को प्रकट करती हैं10,11,12. इसके अतिरिक्त, मज्जा या प्रतिरक्षा प्रणाली के घातक या गैर घातक विकारों के साथ रोगियों को जो एक allogeneic अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण से गुजरना (एलो-बीएमटी) सहित कोलाइटिस के विभिन्न रूपों का विकास कर सकते हैं 1) कंडीशनिंग regimens से प्रत्यक्ष विषाक्तता बीएमटी से पहले, 2) बीएमटी के बाद इम्यूनोसुप्रेशन के कारण होने वाले संक्रमण और 3) कलम-वर्सस-होस्ट रोग (GVHD) दाता-प्रकार टी कोशिकाओं द्वारा संचालित बीएमटी13,14,15के बाद ऊतकों में दाता एलो-एंटिजन के लिए प्रतिक्रिया । इन सभी पोस्ट-बीएमटी जटिलताओं के परिणामस्वरूप आंतों के प्रतिरक्षा वातावरण में महत्वपूर्ण परिवर्तनहोताहै16 ,17,18. प्रस्तावित विधि माउस बृहदान्त्र में प्रतिरक्षा सेल संचय के एक भरोसेमंद मूल्यांकन की अनुमति देता है और, जब BMT के बाद murine प्राप्तकर्ताओं के लिए आवेदन किया, दोनों दाता और प्राप्तकर्ता प्रतिरक्षा प्रत्यारोपण सहिष्णुता में शामिल कोशिकाओं के एक कुशल परख की सुविधा19 ,20. आंत सूजन के अतिरिक्त कारणों में द्रोह, खाद्य एलर्जी, या आंत माइक्रोबायोम के विघटन शामिल हैं। इस प्रोटोकॉल बृहदान्त्र से आंत mononuclear कोशिकाओं का उपयोग करने की अनुमति देता है और, संशोधनों के साथ, इन पूर्व नैदानिक murine मॉडल में से किसी में छोटी आंत के ल्यूकोसाइट्स के लिए.

खोज शब्दों का उपयोग कर एक PubMed खोज "आंत्र और प्रतिरक्षा सेल और अलगाव" छोटी आंत पाचन के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं को निकालने के लिए तरीकों का वर्णन 200 से अधिक प्रकाशनों से पता चलता है. हालांकि, बृहदान्त्र के लिए एक समान साहित्य खोज कोई अच्छी तरह से परिभाषित प्रोटोकॉल बृहदान्त्र से प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अलगाव निर्दिष्ट पैदावार. यह हो सकता है क्योंकि बृहदान्त्र अधिक मांसपेशियों और अंतरालीय परतों है, यह और अधिक मुश्किल पूरी तरह से छोटी आंत से पचाने के लिए प्रतिपादन. मौजूदा प्रोटोकॉल के विपरीत, इस प्रोटोकॉल विशेष रूप से अन्य जीवाणु collagenases के बिना Clostridium हिस्टोलिटिकम से Collagenase ई का उपयोग करता है (Collagenase डी / हम प्रदर्शित करते हैं कि, इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर, औपनिवेशिक ऊतक के पाचन प्राप्त किया जा सकता है, जबकि अलग आंत mononuclear प्रतिरक्षा कोशिकाओं की गुणवत्ता के संरक्षण (MNC) ऐसे सोडियम versenate के रूप में विरोधी clumping अभिकर्मकों के अलावा के बिना (EDTA), dispase द्वितीय, और deoxyribonuclease I (DNAse I)21,22,23. इस प्रोटोकॉल आगे निर्देशित अध्ययन के लिए murine बृहदान्त्र से व्यवहार्य एमएनसी के reproducible मजबूत निष्कर्षण की अनुमति देने के लिए अनुकूलित है और खुद को बृहदान्त्र के इम्यूनोलॉजी के अध्ययन के लिए उधार देना चाहिए या (संशोधन के साथ) छोटी आंत24, 25.

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Protocol

सभी अध्ययनकृंतक अनुसंधान प्रोटोकॉल के तहत आयोजित किए गए थे की समीक्षा की और मियामी मिलर स्कूल ऑफ मेडिसिन, जो अमेरिकी एसोसिएशन द्वारा निर्धारित पशु चिकित्सा मानकों को पूरा की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACU) द्वारा अनुमोदित प्रयोगशाला पशु विज्ञान (AALAS) के लिए.

1. समाधान की तैयारी

  1. जैसा कि तालिका 1 में वर्णित है, Colon बफर, सिलिका आधारित घनत्व पृथक्करण मीडिया 100%, सिलिका आधारित घनत्व पृथक्करण मीडिया 66%, सिलिका आधारित घनत्व पृथक्करण मीडिया 44%, Collagenase ई पाचन बफर, और FACS बफर तैयार करते हैं.
    1. प्रक्रिया से पहले दिन बृहदान्त्र बफर तैयार करें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. प्रक्रिया से पहले दिन 100% सिलिका-आधारित घनत्व पृथक्करण मीडिया तैयार करें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें, कमरे के तापमान पर सुबह को थथने के लिए रखें।
    3. कमरे के तापमान का उपयोग कर 66% और 44% सिलिका आधारित पृथक्करण मीडिया तैयार 100% सिलिका आधारित घनत्व पृथक्करण मीडिया और Colon बफर.
    4. प्रक्रिया से पहले रात भर -20 डिग्री सेल्सियस पर क्लोस्ट्रिडियम हिस्टोलिटिकम व्युत्पन्नकोलेजाइनी ई और स्टोर की उचित मात्रा को मापें। अगले दिन सुबह, Colon बफर की उचित मात्रा में भंग Collagenase पाचन बफर प्राप्त करने के लिए. प्रक्रिया के दिन Collagenase पाचन बफर के साथ सभी ऊष्मायन के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस के लिए समाधान पूर्व गर्म.
  2. प्रोटोकॉल चरणों के संपूर्ण चरण के लिए, एक केन्द्रापसारक को 20 डिग्री सेल्सियस तथा 859 x gकी घूर्णन चाल, जिसमें ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन के लिए ब्रेक निष्क्रिय (0 मंदन) होते हैं। धोने के चरणों के लिए, मानक मंदी के साथ, 859 x gकी एक और 4 डिग्री सेल्सियस और रोटेशन गति सेट करें।

2. बृहदान्त्र कटाई

  1. एएएलएसी द्वारा अनुमोदित पुष्टिविधि द्वारा पीछा करने के बाद सीओ2 asphyxiation के माध्यम से माउस को यूथेनाइज करें।
  2. माउस को एक सुपाच्य स्थिति में रखें और 70% इथेनॉल के साथ फर स्प्रे करें। बड़े ऊतक कैंची का उपयोग करना, एक ऊर्ध्वाधर midline चीरा बनाने के लिए और बरकरार peritoneum बेनकाब.
  3. ठीक विच्छेदन कैंची का उपयोग करना, peritoneum खोलो. छोटे आंत्र को एक तरफ ले जाने और अवरोही बृहदान्त्र को बेनकाब करने के लिए संदंश का प्रयोग करें। बृहदान्त्र के मलाशय भाग को अधिक से अधिक उजागर करने के लिए उतरते बृहदान्त्र पर थोड़ा ऊपर की ओर खींच. श्रोणि में डिस्टेल मलाशय को काटें और पूरे बृहदान्त्र को एक इकाई के रूप में निकालें, डिस्टल मलाशय से सेकल कैप तक।
  4. एक 50 एमएल polypropylene ट्यूब में 20 एमएल ठंडा Colon बफर में बृहदान्त्र स्थानांतरण.

3. बृहदान्त्र की सफाई

  1. एक गीला कागज तौलिया पर बृहदान्त्र प्लेस और कैंची या संदंश के कुंद अंत के साथ आंत्र दीवार के लिए हल्के दबाव लागू करने से ठोस मल निकालने.
  2. एक पेट्री डिश में बृहदान्त्र प्लेस और 18 जी कुंद भरने सुई के साथ एक 10 एमएल सिरिंज का उपयोग कर ठंडा Colon बफर के 10 एमएल के साथ पेट फ्लश.
  3. एक Colon बफर कागज तौलिया गीला करने के लिए बृहदान्त्र स्थानांतरण और कैंची के तेज अंत के साथ mesentery और वसा को हटा दें.
  4. 5-10 एमएल ठंडा Colon बफर के साथ भरा एक पेट्री डिश में बृहदान्त्र रखें मैन्युअल रूप से शेष औपनिवेशिक सामग्री धोने के लिए. 2-3 बार दोहराएँ.
  5. अपने अधिक मांसपेशियों आयतिक अंत से लंबे समय तक बृहदान्त्र कट proximal बृहदान्त्र (एक आयताकार खुले बृहदान्त्र टुकड़ा पैदा) ताजा ठंडा बृहदान्त्र बफर से भरा एक पेट्री डिश में. मौजूदा मीडिया को छोड़ें और क्लीन ठंडा Colon बफ़र के साथ फिर से भरना।
  6. आंत को पेट्री डिश में तेजी से घूमता है और प्रत्येक धोने के बाद ठंडा Colon बफर के 5-10 एमएल की जगह से 3 बार धो लें।
  7. एक कागज तौलिया पर आयताकार बृहदान्त्र ऊतक प्लेस Colon बफर के साथ गीला और यह क्षैतिज टुकड़ा करके और फिर छोटे टुकड़ों में कटौती (3 मिमी x 3 मिमी वर्गों).
  8. 50 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन शंकु नली में 20 एमएल ठंडा कोलन बफर में बारीक बलपों का उपयोग करके कोलन के टुकड़े सावधानी से एकत्र करें.
  9. बृहदान्त्र टुकड़े 3 बार धो लें, 20 एमएल Colon बफर में प्रत्येक धोने, जोरदार प्रत्येक आंदोलन के बीच 30 s. के लिए ट्यूब घूमता द्वारा, ऊतक टुकड़े ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं. प्रत्येक धोने के बीच आकांक्षा प्रक्रिया में ऊतक टुकड़ा नुकसान को रोकने के दौरान, सुपरनेंट को निष्क्रिय करें।
    नोट: प्रत्येक धोने के बाद ट्यूब को बदलने की कोई जरूरत नहीं है।

4. Collagenase पाचन 1

  1. 50 एमएल पॉलीप्रोपीलीन शंकु ट्यूब में धोया बृहदान्त्र टुकड़े करने के लिए Collagenase पाचन बफर के 20 एमएल जोड़ें।
  2. बंद 50 एमएल ट्यूब को एक इनक्यूबेटकिएटेड कक्षीय शेकर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें, जिसमें 60 मिनट के लिए 2 x ग्राम पर निर्धारित रोटेशन दर होती है। यह सुनिश्चित करें कि आंदोलन के दौरान ऊतक के टुकड़े निरंतर गति में हैं; यदि आवश्यक हो, तो यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोई ऊतक के टुकड़े ट्यूब के नीचे से व्यवस्थित नहीं होते हैं, रोटेशन दर में वृद्धि करें।

5. सिलिका आधारित पृथक्करण मीडिया ग्रेडिएट्स तैयार करें

  1. 20 डिग्री सेल्सियस (कमरे के तापमान) और Colon बफर पर 100% सिलिका आधारित घनत्व पृथक्करण मीडिया का उपयोग कर, 66% और 44% सिलिका आधारित घनत्व पृथक्करण मीडिया तैयार करें।
  2. 3 अलग 15 एमएल polypropylene ट्यूबों में से प्रत्येक में 66% सिलिका आधारित घनत्व पृथक्करण मीडिया के 5 एमएल डालो. बृहदान्त्र प्रति 3 ट्यूब तैयार करें. यह ग्रेडिएंट आइसोलेशन प्रक्रिया का उच्च घनत्व आधार बनाता है, जिस पर कम घनत्व पृथक्करण मीडिया को पृथक्करण प्रवणता बनाने के लिए स्तरित किया जाएगा।
  3. उपयोग होने तक 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें.

6. पाचन से Supernatant का संग्रह 1

  1. केवल supernatant एक 25 एमएल serological pipette का उपयोग कर लीजिए और एक 40 डिग्री मीटर pores कपड़े सेल छलनी के माध्यम से supernatant फिल्टर एक साफ 50 एमएल polypropylene शंकु ट्यूब में रखा, के बाद Collagenase पाचन 1 पूरा हो गया है. किसी भी मौजूदा ऊतक के टुकड़े को प्रेरित न करने के लिए सावधान रहें।
    नोट: ट्यूब में किसी भी शेष दृश्य ऊतक के टुकड़े को बनाए रखें। ये दूसरे कोलैजानेस पाचन से गुजरना होगा (कदम 8).

7. Quenching Collagenase पाचन बफर

  1. ठंडा Colon बफर के साथ पूरी तरह से 50 एमएल polypropylene ट्यूब भरें.
    नोट: कोलैजेनस 37 डिग्री सेल्सियस पर सक्रिय है; इसलिए ठंडा बफर इस एंजाइम को निष्क्रिय करता है।
  2. 5 मिनट के लिए 800 x ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें।
    1. वैक्यूम आकांक्षा के माध्यम से supernatant छोड़ दें. 5 मिनट के लिए 800 x ग्राम पर ताजा Colon बफर और अपकेंद्रित्र के 25 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो लो।
    2. ताजा ठंडा Colon बफर के कम से कम 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित.
    3. 50 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन शंकु नली को बर्फ पर रखें।

8. Collagenase पाचन 2

  1. चरण 6.1 से बनाए रखा शेष ऊतक टुकड़े के साथ चरण 4 (पाचन 1) दोहराएँ.

9. ऊतक विघटन पाचन के बाद 2

  1. ट्यूब और एक 18 जी कुंद अंत सुई के माध्यम से एक 10 एमएल सिरिंज के बीच तेजी से आगे और पीछे ऊतक के टुकड़े फ्लश.
  2. 7-8 पूरा मार्ग की एक न्यूनतम के लिए इस फ्लश दोहराएँ, जब तक कोई सकल ऊतक टुकड़े या मलबे दिखाई दे रहे हैं जारी है.

10. फ़िल्टर सेल

  1. एक साफ 50 एमएल पॉलीप्रोपीलीन ट्यूब में एक 40 डिग्री मीटर-पोर निस्पंदन कपड़े सेल छलनी के माध्यम से ऊतक disaggregation निलंबन गुजरती हैं।
  2. फिल्टर में फंस किसी भी कोशिकाओं को ठीक करने के लिए 10 एमएल ठंडा Colon बफर के साथ निस्पंदन कपड़े सेल छलनी धो लें।

11. Quenching Collagenase पाचन

  1. ठंडा Colon बफर के साथ रिम करने के लिए 50 एमएल polypropylene शंकु ट्यूब भरें.
    नोट: Colon बफर का तापमान collagenase गतिविधि की शमन सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है.
  2. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और 800 x ग्राम पर स्पिन करें।
  3. वैक्यूम आकांक्षा के माध्यम से supernatant छोड़ दें.
  4. ताजा ठंडा Colon बफर के 25 एमएल में resssssinssed द्वाराधो, 4 डिग्री सेल्सियस पर centrifugation के बाद, 5 मिनट के लिए 800 x ग्राम.
  5. वैक्यूम आकांक्षा के माध्यम से supernatant छोड़ दें.
  6. कोलैडेनेज पाचन 1 (चरण 7) से अपने इसी ट्यूब के लिए चरण 11.4 से resuspended गोली पूल.
  7. चरण 11.4 दोहराएँ (धोने और centrifugation).

12. सिलिका आधारित घनत्व पृथक्करण मीडिया ग्रेडिएंट पृथक्करण

नोट: चरण 12-18 के रूप में जल्दी संभव के रूप में प्रदर्शन, collagenase गतिविधि के तेजी से शमन सुनिश्चित करने के लिए.

  1. चरण 11.7 के बाद, बृहदान्त्र प्रति 44% सिलिका आधारित घनत्व पृथक्करण मीडिया के 24 एमएल कुल में प्रत्येक गोली resuspend.
  2. धीरे धीरे कदम 12.1 से मीडिया के 8 एमएल परत चरण 5.2 पर तैयार तीन ट्यूबों में से प्रत्येक पर (66% सिलिका आधारित घनत्व पृथक्करण मीडिया युक्त), एक 10 एमएल serological pipette का उपयोग कर. इंटरफ़ेस के व्यवधान से बचने के लिए ढाल परत करते समय 44% घनत्व पृथक्करण मीडिया का एक स्थिर और धीमी गति से प्रवाह बनाए रखें।
  3. ध्यान से एक वजन पैमाने या एक संतुलन का उपयोग कर centrifuge बाल्टी के भीतर सभी ट्यूबों संतुलन.
  4. 20 डिग्री सेल्सियस पर ब्रेक के बिना अपकेंद्रित्र में 859 x ग्राम पर 20 मिनट ट्यूब स्पिन करें। ट्यूब को हटाने से पहले आराम पूरा करने के लिए rotors आने के लिए अनुमति दें, ध्यान रखने के लिए ढाल इंटरफ़ेस पर कोशिकाओं को बाधित नहीं.

13. ग्रेडिएंट इंटरफ़ेस से मोनोन्यूक्लियर सेल लीजिए

  1. ढाल इंटरफ़ेस कल्पना (5 एमएल निशान के पास), जहां आम तौर पर एक 1-2 मिमी मोटी सफेद बैंड (MNC युक्त) मौजूद है.
    नोट: एक हो सकता है या एक सफेद बैंड नहीं देख सकते हैं. हालांकि, MNC इस इंटरफ़ेस पर होगा और ढाल इंटरफ़ेस की स्पष्टता बादल चाहिए.
  2. वैक्यूम aspirate और इंटरफ़ेस करने के लिए आसान pipette का उपयोग करने की अनुमति देने के लिए शीर्ष ढाल के शीर्ष 7 एमएल त्याग दें।
  3. सतत मैनुअल चूषण और स्थिर घूर्णन कलाई गति का उपयोग करना, एक साफ 50 एमएल polypropylene शंकु ट्यूब में कोशिकाओं के इंटरफेस परत इकट्ठा. 2 gradients के बीच इंटरफ़ेस स्पष्ट और refractile (कोशिकाओं के स्पष्ट) है जब तक लीजिए.
  4. ठंडा FACS बफर के 50 एमएल के साथ संग्रह ट्यूब भरें. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस, 800 x ग्राम पर स्पिन करें।
  5. वैक्यूम आकांक्षा के माध्यम से supernatant aspirate और FACS बफर के 1 एमएल में गोली resuspend.
  6. उपयुक्त मृत कोशिका बहिष्करण विधियों का उपयोग करके 1:2 कमजोर पड़ने पर हीमोसाइटोमीटर पर कोशिकाओं की गणना करें।
  7. ताजा अलग उपनिवेश MNC के साथ FACS धुंधला या अन्य assays के लिए आगे बढ़ें.

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Representative Results

जब murine बृहदान्त्र रोग मॉडल के साथ काम कर रहे हैं, यह दोनों परिमाणऔर गुणात्मक आकलन करने में सक्षम होने के लिए उपयोगी है, बृहदान्त्र के MNC के बीच, भड़काऊ प्रक्रिया में शामिल कई प्रतिरक्षा सेल सबसेट. इस प्रोटोकॉल के अनुप्रयोग के माध्यम से प्राप्त एमएनसी का एकल-सेल निलंबन एक मजबूत और पुनउत्पादनीय तरीके से इस प्रकार के लक्षणलक्षणों को सुविधाजनक बनादेता है। विविध प्रयोगात्मक सेटिंग्स के तहत इस अलगाव विधि के आवेदन के लिए सिद्धांत का एक सबूत के रूप में, हम इस विधि का उपयोग कर colonic MNC पुनः प्राप्त और के साथ चूहों से अलग कोशिकाओं पर बहु-पैरामीटर प्रवाह साइटोमेट्री प्रदर्शन किया (चित्र 1 और चित्र 2 , एलोजीनिक बीएमटी) और बिना (चित्र 2A, syngeneic BMT) महत्वपूर्ण प्रतिरक्षा मध्यस्थता बृहठीय चोट BMT के बाद.

प्रवाह साइटोमेट्री और डेटा विश्लेषण apoptotic और नेक्रोटिक मृत लिम्फोसाइटों के अंशों की तुलना करने के लिए प्रदर्शन किया गया जब अलगाव के लिए या तो Collagenase ई या डी का उपयोग कर, के साथ या बिना DNase 1 उपचार. प्रवाह साइटोमेट्री के दौरान प्रयुक्त गेटिंग कार्यनीति चित्र 1कमें प्रदान की गईहै।  Annexin वी (apoptosis मार्कर) और fixable लाइव / मृत ब्लू डाई (नेक्रोसिस मार्कर) प्रत्येक अलगाव के बाद एकल सेल निलंबन पर धुंधला के बाद, DNAse बिना Collagenase ई Ansin वीनेग का एक काफी अधिक प्रतिशत दिखाया Live/Dead Blueneg live cells (मध्य 43.3%, रेंज 26.5%-59.9% , n $ 3) अलगाव के बाद जब DNAse के बिना Collagenase डी की तुलना में (मध्य 8.7%,range 3.6%-10.2%, n ] 3), यहां तक कि जब कोलेजाइन ई + DNAse (मध्य 8.18%, $ 3%, $ 3.7%, $ 3.7.7.) की तुलना में Collagenase D + DNAse (मध्य 15.10%, रेंज 9.9%-21.4%, n ] 3). इसके अलावा, हमने कोलेजाइन ई समूह में 41.0% की औसत प्रतिशत पर एनेक्सीन वीनेगलाइव/डेड ब्लू+ नेक्रोटिक कोशिकाओं की पहचान की (रेंज 37.1%-58.8%, n ] 3) कोलेजाने सोंडे समूह में 90.0% बनाम (रेंज 69.7%-95.5%, n ] 3), 75.9% कोलेजाइन में एनेस एनेस एनेस में समूह, और 80.3% Collagenase डी + DNAse समूह में, क्रमशः (रेंज 65.7%-79.5%, सीमा 54.9%-89.9%, n $ 3). प्रत्येक समूह में n से n $ 1 पशु से प्रतिनिधि FACS भूखंडों चित्र 1Bदिखाया गया है.

रोगग्रस्त चूहों में इस प्रक्रिया का उपयोग करके व्यवहार्य बहुराष्ट्रीय कंपनी की स्थिरता और उपज के सिद्धांत के आगे सबूत के रूप में, बहु-पैरामीट्रिक प्रवाह साइटोमेट्री को CD45.2 BALB/c प्राप्तकर्ता चूहों से अलग करने के लिए लागू किया गया था 7 दिन या तो एलोजेनिक (CD45.1) का BMT प्राप्त करने के बाद C57BL/6 दाता) या syngeneic (CD45.1 BALB/c दाता) BMT मॉडल. पूर्ण MNC संख्या प्रवाह cytometry विश्लेषण द्वारा प्राप्त प्रतिशत gated प्रतिरक्षा सबसेट से गुणा का उपयोग करना, दाता CD4+ और CD8+ टी बीएमटी प्राप्तकर्ता के बृहदान्त्र से निकाले गए टी कोशिकाओं की पूर्ण संख्या का मतलब गणना की जा सकती है और तुलना (एन $ 4 प्रति समूह, चित्र 2A). चूंकि यह पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है और / या ऐसे माउस मॉडल में दुर्लभ प्रतिरक्षा सेल आबादी मात्रा में, हम दाता व्युत्पन्न सहित दुर्लभ सबसेट का मूल्यांकन (CD45.1+) Foxp3+ टी नियामक कोशिकाओं (Treg) दोनों syngeneic और allogeneic BMT मॉडल में. दाता Treg कोशिकाओं तक पहुँचने के लिए gating रणनीति (CD4+CD25+FoxP3+) एंटीबॉडी से सना हुआ एकल सेल निलंबन से दिखाया गया है (एकलाल तीर से delineated फाटकों का अनुक्रम; चित्र 2ख) । इस विधि का उपयोग करके, बीएमटी के बाद प्राप्तकर्ता माउस बृहदान्त्र को घुसपैठ करने वाले दाता व्युत्पन्न कॉलनी ट्रेग जैसे दुर्लभ सबसेट का विश्लेषण किया जा सकता है (चित्र 2C, प्रतिनिधि आलेख; n ] 1)।

चित्र 3 हमारे समूह से ऐतिहासिक डेटा में इस विधि का एक विस्तारित आवेदन से पता चलता है प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए GVHD-प्रेरित CD8 + बनाम CD4 + दाता व्युत्पन्न टी कोशिकाओं BALB/c चूहों के बृहदान्त्र में या तो संरक्षित या संरक्षित नहीं पूर्व BMT उपचार तैयारी (कंडीशनिंग) आहार20द्वारा GVHD से | परीक्षण की गई तैयारी की गई अवधियों में 800 cGy/myeloablative कुल शरीर विकिरण (TBI800) या गैर-मायलोएब्लेटिव टीबीआई (400TBI), साथ ही कुल लिम्फोइड विकिरण (TLI) का उपयोग करते हुए nonmyeloablative कंडीशनिंग शामिल थे जिसमें विकिरण लिम्फ को दिया गया था खोपड़ी, फेफड़े, अंग, श्रोणि और पूंछ की परिरक्षण के साथ नोड्स, थाइमस, और तिल्ली। सभी कंडीशनिंग विरोधी थाइमोसाइट सीरम (एटीएस), एक इम्यूनोमॉडुलेशन एजेंट के साथ संयुक्त किया गया था। BMT के बाद 6 दिन के रूप में जल्दी के रूप में, इस कोलनिक एमएनसी अलगाव प्रोटोकॉल मजबूत प्रवाह cytometric विश्लेषण के रूप में अधिक लिम्फोसाइट समृद्ध GVHD लक्ष्य अंगों जैसे तिल्ली और मध्यसेरिक लिम्फ नोड्स (MLN) (चित्र 3ए) 20 पर समान विश्लेषण की तुलना में परिणाम . बीएमटी प्राप्तकर्ताओं में कॉलिक एमएनसी के पुनरुत्पादक पृथक्काल (एन $ 7-10 प्रति उपचार समूह) दाता CD8 की निरपेक्ष संख्या की एक मजबूत सांख्यिकीय तुलना के लिए अनुमति दी+ प्रभावक टी कोशिकाओं विभिन्न पूर्व प्रत्यारोपण कंडीशनिंग उपचार समूहों के बीच ( चित्रा 3B), प्रतिरक्षा phenotypes है कि प्रमुख अध्ययन TLI से GVHD संरक्षण के सहज प्रतिरक्षा तंत्र खुलासा करने के लिए नेतृत्व पर महत्वपूर्ण डेटा उपज के रूप में TBI पूर्व BMT कंडीशनिंग के लिए विरोध किया. 20

Figure 1
चित्र 1: प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण 7 दिन में कॉलनी MNC allogeneic माउस मॉडल सिस्टम में BMT के बाद जब Collagenase ई और डी के साथ और बिना DNAse 1 के साथ अलग. जंगली प्रकार (WT) (CD45.2+) BALB/c (H2Kd+) चूहों CD45 congenic से BMT प्राप्त (CD45.1+) C57BL/6 दाता चूहों (allogeneic BMT, n $ 3 प्रति समूह). WT (CD45.2+ )BALB/c प्राप्तकर्ता चूहों को बीएमटी से 1 दिन पहले 800cGy TBI (BALB/ BMT के बाद 7 दिन में, प्राप्तकर्ता बृहदान्त्र के एकल सेल निलंबन Collagenase ई (100 यू/एमएल) के उपयोग के साथ इस पांडुलिपि के तरीकों का पालन करने के लिए तैयार किए गए थे, Collagenase ई (100 U/mL) के साथ DNAse 1 (500 डिग्री / के साथ DNAse 1 (500 g/mL) (n $ 3 प्रति समूह). कोशिकाओं के साथ दाग थे Live/dead-UV450 (Live/Dead Blue), Annexin V-APC, H-2Kd-PE, CD45.1-BV605, CD3-FITC, CD4-BV711, CD8-APC-Cy7, FoxP3-प्रशांत ब्लू, और CD11b-PE-Cy7 एंटीबॉडी. (क)एफएसीएस विश्लेषण के लिए गैटिंग रणनीति। गेट 0, फॉरवर्ड स्कैटर (FSC-A) और साइड स्कैटर (SSC-A) एमएनसी के एकल-सेल निलंबन पर जिसका उपयोग ल्यूकोसाइट्स की पहचान करने के लिए किया जाता है; गेट 1, एसएससी-ए का उपयोग करके गैर-एकल कोशिकाओं का बहिष्करण; गेट 2, FSC-A का उपयोग करके गैर-एकल कोशिकाओं का बहिष्करण; गेट 3, एनेक्सिन वी-पॉजिटिव (एपोप्टोटिक) और स्थिर व्यवहार्यता डाई लाइव/डेड-यूवी450+एनेक्सिन वी-नकारात्मक (नेक्रोटिक) सेल सबसेट की पहचान। (ख)4 प्रयोगात्मक समूहों के लिए एमएनसी के बीच एनेक्सिन वी के प्रतिनिधि एफएसएएस भूखंड ों और गेटेड ल्यूकोसाइट्स के स्थिर व्यवहार्यता डाई धुंधला। समूहों में प्रति समूह N $1 प्रतिनिधि माउस: Collagenase ई (100 U/mL), Collagenase ई (100 U/mL) + DNAse 1 (500 $g/mL), Collagenase D (500g/mL), और Collagenase D (500 g/mL) + DNAse 1 (500 /mL/mL). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: प्रवाह cytometric लक्षण alegeneic और syngeneic माउस मॉडल सिस्टम में BMT के बाद 7 दिन में कोलनिक MNC के लक्षण. WT (CD45.2+) C57BL/6 (H2Kd-neg) और BALB/c (H2Kd+) चूहों CD45-congenic से BMT प्राप्त (CD45.1+) C57BL/6 और BALB/c दाता चूहों (syngeneic या allogeneic BMT, n $ 4 प्रति प्रयोगात्मक समूह). C57BL/6 और BALB/c प्राप्तकर्ता चूहों 950cGy (C57BL/6) और 800cGy (BALB/c) myeloablative TBI, BMT से पहले एक दिन दिया की तैयारी कंडीशनिंग आहार प्राप्त किया. बीएमटी के बाद 7 दिन में, प्राप्तकर्ता औपनिवेशिक एमएनसी के एकल-सेल निलंबन इस पांडुलिपि के तरीकों का पालन करते हुए तैयार किए गए थे। कोशिकाओं लाइव-डेड-BV510, एच-2केडी-पीई, CD45.1-BV605, CD4-FITC, CD8-APC-Cy7, CD25-प्रशांतब्लू, FoxP3-AF647, और CD11b-PE-Cy7 एंटीबॉडी, एन $ 4 चूहों प्रति समूह के साथ दाग थे। (क) मतलब ] SEM निरपेक्ष संख्या (लॉग 10) CD45.1+ H-2kd-neg या CD45.1+ H-2k d+ (दाता-प्रकार, प्रत्येक मामले में) CD11bnegCD4+ और CD8+ टी कोशिकाओं दिन 7 पर प्राप्तकर्ता बृहदान्त्र से अलग कंडीशनिंग और CD45.1 C57BL/6 (दाता) के बाद - CD45.2 BALB/c (प्राप्तकर्ता) BMT. प्रति समूह N $ 4. (बी) एफएसीएस विश्लेषण के लिए गैटिंग रणनीति। गेट 0, फॉरवर्ड स्कैटर (FSC-A) और साइड स्कैटर (SSC-A) एमएनसी के एकल-सेल निलंबन पर जिसका उपयोग ल्यूकोसाइट्स की पहचान करने के लिए किया जाता है; गेट 1, एसएससी-ए का उपयोग करके गैर-एकल कोशिकाओं का बहिष्करण; गेट 2, FSC-A का उपयोग करके गैर-एकल कोशिकाओं का बहिष्करण; गेट 3, लाइव सेल चयन गेट 4, बीएमटी दाता बनाम बीएमटी प्राप्तकर्ता मूल के हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं का पृथक्करण; गेट 5, दाता गैर-माइलॉयड वंश कोशिकाओं का चयन; गेट 6, CD4+ टी कोशिकाओं के चयनात्मक gating; गेट 7, CD4+CD25+FoxP3+ टी नियामक (Treg) कोशिकाओं के अलग gating. लाल तीर ड्रिल-डाउन गेटिंग रणनीति को दर्शाता है। (ग) सीडी 25 और FoxP3 के प्रतिनिधि FACS भूखंडों में gating रणनीति का उपयोग कर (बी) दिन 7 में कंडीशनिंग और Allogeneic BMT के एक BALB/c प्राप्तकर्ता के बृहदान्त्र में BMT के बाद (C57BL/ प्रत्येक गेट में कोशिकाओं का प्रतिशत गेट के भीतर दिया जाता है. डब्ल्यूटी - जंगली प्रकार; TBI - कुल शरीर विकिरण; बीएम - 10 x 106 CD45.1+ congenic C57BL/6 या BALB/c दाता अस्थि मज्जा कोशिकाओं; Teff ] टी प्रभावक कोशिकाओं; Treg - Foxp3+ टी नियामक कोशिकाओं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: गैर-मायलोब्लैटिव TLI/ATS लेकिन नहीं TBI/ATS कंडीशनिंग कम हो जाती है दाता टीसीआर $+CD8+ effector टी सेल संचय. (ए ) सीडी 4 के प्रतिनिधि FACS भूखंडों और gated H-2Kb +TCR]+ दाता H-2Kb + C57BL/6 चूहों से सेल प्लीहा (शीर्ष पंक्ति), मध्य लिम्फ नोड (MLN) (मध्य पंक्ति), और बृहदान्त्र (नीचे पंक्ति) दिन में प्राप्तकर्ताओं के 6 कंडीशनिंग और प्रत्यारोपण के बाद. प्रत्येक गेट में कोशिकाओं का प्रतिशत गेट के ऊपर दिया जाता है। (बी ) मतलब - SEM निरपेक्ष संख्या (लॉग 10) H-2Kb +TCR]+सीडी 8+ तिल्ली (शीर्ष पैनल), MLN (मध्य पैनल) में कोशिकाओं, और बृहदान्त्र (नीचे पैनल) कंडीशनिंग और BMT के बाद दिन में प्राप्तकर्ताओं की 6. डब्ल्यूटी - जंगली प्रकार; TBI - कुल शरीर विकिरण; TLI ]: कुल लसीकाभ विकिरण; एटीएस ] एंटी-थाइमोसाइट सीरम; BM - 50 x 106 WT C57BL/6 दाता अस्थि मज्जा कोशिकाओं; SPL - 60 x 106 WT C57BL/6 दाता तिल्ली कोशिकाओं; TBI800, TBI400 ] cGy खुराक myeloablative (TBI800) या गैर-myeloablative (TBI400) TBI. * यह आंकड़ा वैन der Merwe एट अल से संशोधित किया गया है20. कॉपीराइट 2013. प्रतिरक्षा विज्ञानियों के अमेरिकन एसोसिएशन, Inc कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.

समाधान सूत्र
बृहदान्त्र बफ़र 500 एमएल RPMI + 10mM HEPES + 10% FBS (गर्मी में सक्रिय 56oC के लिए 60 मिनट, पीएच 7.3 करने के लिए समायोजित)
सिलिका आधारित घनत्व ग्रेडिएंट मीडिया 100% (प्रति बृहदान्त्र) सिलिका-आधारित घनत्व ग्रेडिएंट मीडिया + 10x पीबीएस के 2.5 एमएल के 22.5 एमएल।
सिलिका आधारित घनत्व ग्रेडिएंट मीडिया 66% (प्रति बृहदान्त्र) 10.72 एमएल सिलिका आधारित घनत्व ग्रेडिएंट मीडिया 100% + 5.28 एमएल कॉलोन बफर
सिलिका आधारित घनत्व ग्रेडिएंट मीडिया 44% (प्रति बृहदान्त्र) 11 एमएल सिलिका आधारित घनत्व ग्रेडिएंट मीडिया 100% + 14 एमएल कॉलोन बफर
कोलाजनेज़ पाचन बफर (प्रति बृहदान्त्र) क्लोस्ट्रिडियम हिस्टोलिटिकमसे कोलाजनेस ई के 100 यू/
FACS बफर 500 एमएल 1x पीबीएस + 5 ग्राम बीएसए + 1 मिमी एडटा + 0.2 ग्राम सोडियम अज़ीदे

तालिका 1: समाधान तैयारी तालिका.

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Discussion

इस दृश्य प्रोटोकॉल lamina प्रोप्रिया लिम्फोसाइटों (LPL) सहित कोलनिक मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के अलगाव के लिए अच्छी तरह से सहन तरीकों का वर्णन करता है. यह देखते हुए कि इस प्रोटोकॉल गंभीर पोस्ट ट्रांसप्लांट माउस कोलाइटिस मॉडल जहां भड़काऊ cytokines और ऊतक चोट खुद को बरामद एमएनसी की गरीब व्यवहार्यता को उधार देने के मूल्यांकन में अनुकूलित किया गया था, हम आशा करते हैं कि इन तरीकों अन्य करने के लिए अनुवाद किया जा सकता है औपनिवेशिक MNC के phenotypic विश्लेषण की आवश्यकता होती है अनुप्रयोगों. ये शामिल हैं, लेकिन, सूजन आंत्र रोग के माउस मॉडल में बृहदान्त्र सूजन का आकलन करने के लिए सीमित नहीं हैं, कोलाइटिस-लक्षित उपचार की प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के अध्ययन, और संक्रामक रोगजनकों द्वारा उत्पादित कोलाइटिस। इसके अतिरिक्त, स्वस्थ में अलगाव का उपयोग कर हमारे डेटा (syngeneic BMT) चूहों से संकेत मिलता है कि अलगाव प्रक्रिया महत्वपूर्ण भड़काऊ घुसपैठ की आवश्यकता नहीं है एमएनसी अलग में प्रतिरक्षा सेल का पता लगाने की अनुमति. दरअसल, इसी तरह के डेटा अनुपचारित स्वस्थ (गैर-बीएमटी) चूहों (डेटा नहीं दिखाया गया) का उपयोग कर प्राप्त किया गया है।

इस प्रोटोकॉल के कई महत्वपूर्ण कदम इसे अन्य प्रकाशित विधियों से अलग करते हैं और उच्च उपज और व्यवहार्यता में योगदान करते हैं। उदाहरण के लिए, क्लोस्ट्रिडियम हिस्टोलिटिकमव्युत्पन्न कोलाजनेस ई गतिविधि (100 यू/एमएल अंतिम गतिविधि स्तर) का अनुकूलन लंबी दूरी के प्रयोगों पर एंजाइम के विभिन्न बहुत सारे के लिए सुसंगत गणना की अनुमति देता है26. कोलेजन परिवार में 28 अलग अलग सदस्य हैं, एक साथ स्तनधारी शरीर में सभी प्रोटीन का लगभग 30%गठन 27. इसके अलावा, विभिन्न ऊतकों कोलेजन उपप्रकारों के अलग वितरण है, प्रत्येक पाचन28के लिए अद्वितीय collagenases की आवश्यकता होती है. सी हिस्टोलिटिकम के कोलाजनेस में 6 अलग - अलग प्रोटीन शामिल हैं जिन्हें दो कक्षाओं29,30में वर्गीकृत किया गया है . विशिष्ट प्रकार के कोलैडेज का उपयोग बृहदान्त्र31से अलग कोशिकाओं की व्यवहार्यता और समग्र गुणवत्ता को बदल सकता है . पिछले अध्ययनों से पता चला है कि कोलैडेनेस प्रकार सी-2139 (Collagenase ई) छोटी आंत से अलग MNC के बीच लिम्फोसाइटों की एक उच्च उपज की अनुमति देता है25. हालांकि, इन प्रोटोकॉल बृहदान्त्र के पाचन पता नहीं था, छोटी आंत की तुलना में काफी अधिक जटिल कोलेजन संरचना के साथ एक बहुत अधिक मांसपेशियों अंग.

एंजाइमी ऊतक गिरावट की पर्याप्तता और निर्भरता आवर्तक यांत्रिक विघटन की आवश्यकता को कम करके समग्र सेल उपज और व्यवहार्यता को प्रभावित करने वाला एक स्थापित कारक है (जो ऊतक के लिए यांत्रिक आघात में वृद्धि लाती है)। एक कोलाजनेस ई-विशिष्ट प्रोटोकॉल का उपयोग कर के बीचवाला और mucosal कोलेजन की पर्याप्त एंजाइमी पाचन के कारण (मानक उपयोग में कोलाजनेस डी-मध्यस्थ पाचन प्रोटोकॉल की तुलना में), इस प्रोटोकॉल के यांत्रिक हेरफेर की मात्रा को कम करता है ऊतक के टुकड़े इंटरस्टिशियम को बाधित करने और प्रतिरक्षा सेल सबसेट को निलंबन में छोड़ने के लिए आवश्यक हैं। यह आगे बाद के परख के लिए पृथक एमएनसी की व्यवहार्यता को बढ़ाता है. जैसा कि डेटा में प्रदर्शित किया गया है (चित्र 1ख) यह एक छलनी के माध्यम से एक एकल सेल निलंबन के मानक निस्पंदन से परे DNAse और अन्य रासायनिक या यांत्रिक विरोधी clumping युद्धाभ्यास के लिए की आवश्यकता समाप्त. आंतों की लसीकाभ कोशिकाओं के अलगाव को रेखांकित करने वाली अन्य रिपोर्टों में डाइथियोथ्रेइटोल (डीटीटी) और एडीटीए को म्यूकोलिटिक एजेंटों के रूप में इस्तेमाल किया गया है ताकि अलग-अलग मोनोन्यूक्लियर ल्यूकोसाइट्स24की उपज और व्यवहार्यता दोनों को बढ़ाया जा सके ।

सेल उपज में सुधार जो इस प्रोटोकॉल का एक और अनूठा पहलू एक ठीक tuned सिलिका आधारित घनत्व जुदाई मीडिया ढाल का आवेदन है. आज तक प्रकाशित अन्य पाचन विधियों के समाचार पत्र इस प्रकार के घनत्व पृथक्करण प्रवणता21,31का उपयोग नहीं करते . हालांकि, लेखकों के अनुभव और कार्यात्मक सक्रिय लसीकाभ कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग सहयोगियों के उन लोगों में, घनत्व ढाल शुद्धि दोनों व्यवहार्यता और एमएससी की शुद्धता पाचन के बाद बरामद में सुधार19 , 20 , 32.

हालांकि इस पांडुलिपि का ध्यान केंद्रित नहीं, चूहों में आंतों की सूजन मॉडल के साथ काम कर रहे लोगों के लिए उल्लेख के योग्य है कि इस पांडुलिपि में तरीकों छोटी आंत से व्यवहार्य एमएनसी के समान उच्च गुणवत्ता वाले अलगाव की अनुमति के लिए संशोधित किया जा सकता है. इस को प्राप्त करने के लिए आवश्यक प्राथमिक औपनिवेशिक प्रोटोकॉल के संशोधन एक एकल 90 मिनट पाचन का उपयोग है (दो से 60 मिनट पाचन के बजाय), अन्य सभी चरणों के साथ (एंजाइम गतिविधि स्तर और बुझाने के कदम सहित) दिखाए गए उन लोगों के समान. इस संशोधन आम तौर पर की एक सीमा पैदावार 0.8-4 x 106 MNC प्रति छोटी आंत के बिना या 1.5-2.5 x 106 MNC ल्यूकोसाइट अमीर cecal टोपी सहित टर्मिनल ileum के शामिल किए जाने के साथ. इसलिए, इस प्रोटोकॉल की एक नवीनता है कि बृहदान्त्र और छोटी आंत के लिए संशोधित प्रोटोकॉल के लिए प्राथमिक प्रोटोकॉल लागू करने, एक उच्च reproducibility और दोनों छोटी आंत और व्यक्ति के बृहदान्त्र से अच्छी व्यवहार्यता के साथ MNC को अलग कर सकता है एक ही प्रयोग में प्रयोगात्मक जानवरों.

सारांश में, प्रोटोकॉल वर्णित बृहदान्त्र से mononuclear कोशिकाओं के कुशल और reproduible अलगाव की अनुमति देता है या, संशोधनों के साथ, छोटी आंत. के साथ 2 कुशल ऑपरेटरों एक साथ काम कर रहे, के रूप में कई के रूप में 10 अलग बृहदान्त्रसंसाधित और एक ही दिन पर विश्लेषण किया जा सकता है, और एकल सेल निलंबन ऊतक फसल से 6-8 एच के भीतर बाद phenotypic और कार्यात्मक विश्लेषण के लिए तैयार किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल के आवेदन अन्य अनुसंधान के लिए मूल्यवान साबित हो सकता है औपनिवेशिक सूजन की प्रतिरक्षा मूल्यांकन की जरूरत है, अन्य जांचकर्ताओं एक कठोर और reproduible तरीके से माउस बृहदान्त्र की प्रतिरक्षा प्रणाली की विशेषता के लिए अनुमति देता है.

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं.

Acknowledgments

यह कार्य अनुदान #1K08HL088260 और #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.), और बाल चिकित्सा अनुसंधान के लिए Batchelor फाउंडेशन (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.) द्वारा समर्थित किया गया था। C57BL/6 और BALB/c चूहों इस अध्ययन में इस्तेमाल किया या तो हमारी सुविधा में पैदा हुए थे या जैक्सन लैब्स या Taconic द्वारा प्रदान की.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60 mm Petri DIsh Thermo Scientific 150288
1x PBS Corning 21-040-CV
10x PBS Lonza BioWhittaker BW17-517Q
10 mL Disposable Serological Pipette Corning 4100
10 mL Syringe Becton Dickinson 302995
15 mL Non-Sterile Conical Tubes TruLine TR2002
18 G Blunt Needle Becton Dickinson 305180
25 mL Disposable Serological Pipette Corning 4250
40 μm pore size Cell Strainer Corning 352340
50 mL Falcon Tube Corning 21008-951
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A4503-1KG
Fixation Buffer Biolegend 420801
E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum Sigma C2139
EDTA, 0.5 M Sterile Solution Amresco E177-500ML
Fetal Bovine Serum Thermo /Fisher Scientific -HyCLone SV30014.03
HEPES GE Healthcare-HyClone SH30237.01
Percoll GE Healthcare-Life Sciences 1708901
RPMI Medium Corning 17-105-CV
Sodium Azide VWR Life Science Amresco 97064-646
Trypan Blue Lonza BioWhittaker 17-942E

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 151 लिम्फोसाइट्स बृहदान्त्र मुरीन lamina प्रोपरिया कोलाइटिस प्रत्यारोपण प्रवाह साइटोमेट्री एंजाइमी पाचन सूजन मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं
Murine Colon से Lamina Propria मोनोन्यूक्लियर सेल के अलगाव Collagenase ई का उपयोग
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McManus, D., Novaira, H. J., Hamers, … More

McManus, D., Novaira, H. J., Hamers, A. A. J., Pillai, A. B. Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E. J. Vis. Exp. (151), e59821, doi:10.3791/59821 (2019).

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