Summary
이 프로토콜의 목표는 콜라게나제를 사용하여 조직의 효소 소화에 의해 결장의 라미나 프로피리아에 있는 단핵 세포를 분리하는 것입니다. 이 프로토콜은 단일 핵 세포의 효율적인 분리를 허용하여 단일 세포 현탁액을 생성하여 강력한 면역 세포 증식에 사용할 수 있습니다.
Abstract
창 자 본문에 면역 세포의 가장 큰 수에 가정. 작고 큰 장 내 면역 계통은 외인성 항원에 노출하고 강력한 미생물 유래 면역 자극에 대한 반응을 조절합니다. 이러한 이유로, 장은 크론병및 궤양성 대장염, 이식편 대 숙주질환(GVHD)과 같은 염증성 장질환을 포함하되 이에 국한되지 않는 많은 질병에서 면역 조절 및 염증의 주요 표적 부위이다. 골수 이식 (BMT), 그리고 많은 알레르기 및 전염성 조건. 위장 염증과 대장염의 뮤린 모델은 GI 합병증을 연구하고 예방 및 치료를 위한 전략을 전임상적으로 최적화하는 데 많이 사용됩니다. 장에서 면역 세포의 격리 및 phenotypic 분석을 통해 이러한 모델에서 수집 된 데이터는 위장 및 전신 염증 성 질환을 개량 할 수있는 추가 면역 이해에 중요하다. 이 보고서는 혼합 실리카 기반 밀도 구배 계면을 사용하여 결장으로부터 단핵 세포(MNC)를 분리하기 위한 매우 효과적인 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 오염 된 파편을 최소화하면서 생존 가능한 백혈구의 상당수를 재현하여 유세포 분석 또는 다른 방법에 의해 후속 면역 자형법을 허용합니다.
Introduction
위장 (GI) 관은 주로 음식에서 영양소의 처리 및 재흡수에 전념하지만, 위관은 또한 혈관, 림프, 신경계 및 수많은 다른 장기의 무결성에 중심 적인 역할을 유지합니다. 그것의 점막 및 점막 면역 계통1. GI 면역 계통은 음식, 공생 박테리아, 또는 침입 병원체에서 외국 항원에 그것의 일정한 노출 때문에 위장 및 전신 건강 둘 다에 있는 영향력 있는 역할을 합니다1,2. 따라서, GI 면역 계통은 병원성 항원1,2에적절히 반응하면서 비병원성 항원을 용인하는 섬세한 균형을 유지해야 한다. 관용과 방어의 균형이 중단되면, 국소화 또는 전신 면역 dysregulation 및 염증은 질병의 무수한 의 결과로 발생할 수 있습니다1,2,3.
창자 항구 적어도 70% 본문에 있는 모든 림프 세포의4. 대부분의 1 차적인 면역학 상호 작용은 창자에 있는 3개의 면역 국중 적어도 1개를 관련시킵니다: 1) Peyer의 패치, 2) 상피 내 림프구 (IEL) 및 3) 라미나 프로피아 림프구 (LPL). 이들의 각각은 창자5에있는 일반적인 면역 도전에 급속하게 반응하는 면역 세포의 복잡한 상호 연결된 네트워크로 이루어져 있습니다. 근육 점막 위의 기질로 제한되는 느슨하게 구조화 된 라미나 프로프리아는 창자 점막의 결합 조직이며 융모, 혈관 구조, 림프 배수 및 점막 신경계뿐만 아니라 많은 선천성 신경 조직에 대한 비계를 포함합니다. 및 적응 면역 하위 집합6,7,8,9. LPL은CD4+ 및CD8+ T 세포로 구성되며, 약 2:1의 비율로, 혈장 세포 및 골수성 혈통 세포, 수지상 세포, 비만 세포, 호산구 및 대식세포6을포함한다.
다양한 질병 상태에 관련되어 있는 면역 dysregulation 및 창자의 염증을 이해에 있는 증가하는 관심사가 있습니다. 크론병 및 궤양성 대장염과 같은 조건은 모두 대장염증10,11,12의다양한 수준을 나타낸다. 추가적으로, 동종 골수 이식 (allo-BMT)를 겪는 골수 또는 면역 계통의 악성 또는 비 악성 무질서를 가진 환자는 1) 조건정 식이요법에서 직접 독성을 포함하여 대장염의 각종 양식을 개발할 수 있습니다 BMT 전, 2) BMT 및 3) 이식편 대 숙주 질환(GVHD)에 의해 유발된 감염은 BMT13,14,15이후 조직에서 공여자 알로항원에 반응하는 기증자 형 T 세포에 의해 구동된다. 이 모든 포스트 BMT 합병증은 장의 면역 군대에 있는 중요한 변경 귀착됩니다16,17,18. 제안된 방법은 마우스 결장에서 면역 세포 축적의 신뢰할 수 있는 평가를 허용하고, BMT 후 뮤린 수용자에 적용될 때, 이식 내성 19에 관여하는 기증자 및 수용자 면역 세포 둘 다의 효율적인 분석법을 용이하게한다. ,20. 창 자 염증의 추가 원인은 악성 포함, 음식 알레르기, 또는 창 자 미생물의 중단. 이 프로토콜은 결장에서 창자 단핵 세포의 접근을 허용하고, 수정으로, 이 전임상 뮤린 모형의 소장의 백혈구에.
"내장 및 면역 세포 및 격리"라는 검색어를 사용한 PubMed 검색은 면역 세포를 추출하기 위해 소장 소화 방법을 설명하는 200 개 이상의 간행물을 보여줍니다. 그러나, 결장에 대 한 유사한 문학 검색 콜론에서 면역 세포의 격리를 지정 하는 잘 설명 된 프로토콜을 산출. 이것은 결장이 더 많은 근육과 간질 층을 가지고 있기 때문일 수 있습니다, 그것을 더 어렵게 소장 보다는 소화하기 위하여 렌더링합니다. 기존 프로토콜과 달리, 이 프로토콜은 다른 세균성 콜라게나제(콜라게나제 D/콜라게나아제 I)없이 클로스트리디움 의 콜라주나아제 E를 사용합니다. 우리는 이 프로토콜을 사용하여, 결장 조직의 소화가 나트륨 versenate (EDTA), Dispase II및 와 같은 반대로 응집 시약의 추가 없이 고립된 창자 단핵 면역 세포 (MNC)의 질을 보존하면서 달성될 수 있다는 것을 보여줍니다 deoxyribonuclease I (DNAse I)21,22,23. 이 프로토콜은 추가 지시 된 연구를 위해 뮤린 결장에서 생존 가능한 MNC의 재현 가능한 강력한 추출을 허용하도록 최적화되어 있으며 결장의 면역학 또는 소장 (수정)의 연구에 자신을 빌려주어야합니다24, 25.
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Protocol
모든 연구는 미국 협회가 정한 수의학적 기준을 충족하는 마이애미 밀러 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 검토되고 승인된 설치류 연구 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 실험실 동물 과학 (AALAS)에 대 한.
1. 솔루션 준비
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표 1에 기재된 바와 같이, 결장 완충제, 실리카 계 밀도 분리 매체 100%, 실리카 계 밀도 분리 매체 66%, 실리카 계 밀도 분리 매체 44%, 콜라제나제 E 소화 완충제 및 FACS 버퍼를 준비한다.
- 수술 전날 결장 완충을 준비하고 4 °C에서 하룻밤 보관하십시오.
- 시술 전날 100% 실리카 계 밀도 분리 매체를 준비하고 4°C에서 하룻밤 동안 보관하고, 해동시 오전에 실온에 두었다.
- 실온 100% 실리카 계 밀도 분리 매및 결장 완충액을 사용하여 격리의 아침에 66% 및 44% 실리카 기반 분리 매체를 준비합니다.
- 적당량의 클로스트리디움-유래콜라게나아제 E를 측정하고 시술 전에 -20°C에서 하룻밤 동안 보관하였다. 다음 날 아침, 콜라게나아제 소화 완충액을 유도하기 위해 결장 완충액을 적정량에 녹입니다. 콜라게나아제 소화 완충액이 있는 모든 배양물의 경우, 용액을 37°C로 미리 데우다.
- 프로토콜 단계 전체에 대해 1개의 원심분리기를 20°C에서 유지하고 회전 속도를 859 x g로유지하며, 그라데이션 원심분리를 위해 브레이크가 비활성화(0 감속)됩니다. 세척 단계에 대한 표준 감속과 함께 4 °C 및 회전 속도를 859 x g로설정합니다.
2. 결장 수확
- CO2 질식을 통해 마우스를 안락사시키고 AALAC 승인 확인 방법.
- 마우스를 스파인 위치에 놓고 70% 에탄올로 모피에 스프레이합니다. 큰 조직 가위를 사용하여 수직 중간선을 절개하고 손상되지 않은 각막에 노출하십시오.
- 미세 해부 가위를 사용하여, 각막을 엽니 다. 집게를 사용하여 작은 창자를 한쪽으로 이동하고 내림차순 결장에 노출시면 됩니다. 결장의 직장 부분을 최대한 노출하기 위해 내림차순 결장에서 약간 위로 당깁니다. 골반 깊은 원위 직장을 잘라 해부하고 말단 직장에서 cecal 캡에 하나의 단위로 전체 결장제거.
- 50 mL 폴리프로필렌 튜브에 20 mL 냉각 결장 완충제에 결장 옮기십시오.
3. 결장 청소
- 축축한 종이 타월에 결장과 가위 또는 집게의 무딘 끝으로 창자 벽에 가벼운 압력을 가하여 단단한 대변을 추출하십시오.
- 페트리 접시에 결장과 18G 무딘 채우기 바늘10 mL 주사기를 사용하여 차가운 결장 완충액 10 mL로 용기를 씻어.
- 결장콜을 축축한 종이 타월로 옮기고 가위의 날카로운 끝으로 장간막과 지방을 제거합니다.
- 5-10 mL 냉장 콜론 버퍼 교반으로 채워진 페트리 접시에 결장을 놓고 남은 결장 내용물세척합니다. 2-3회 반복합니다.
- 신선한 차가운 결장 버퍼로 채워진 페트리 접시에 더 근육질의 직장 끝에서 근위 결장 (단일 직사각형 오픈 콜론 조각을 생성)에 세로로 잘라. 기존 용지를 버리고 깨끗한 차가운 콜론 버퍼로 리필하십시오.
- 페트리 접시에 격렬하게 소용돌이치며 5-10 mL의 차가운 결장 완충제를 각 세척 후 교체하여 소장을 3회 세척합니다.
- 직사각형 결장 조직을 콜론 버퍼로 적신 종이 타월에 놓고 수평으로 자른 다음 작은 조각 (3mm x 3mm 섹션)으로 자릅니다.
- 50 mL 폴리 프로필렌 원추형 튜브에 20 mL 냉장 콜론 버퍼에 미세 한 포셉을 사용 하 여 신중 하 게 콜 론 조각을 수집합니다.
- 결장 단편을 3회 세척하고, 각각 20 mL 결장 완충제에서 세척하고, 튜브를 30s. 각 교반 사이에 격렬하게 소용돌이치면서, 조직 단편이 튜브의 바닥에 정착하도록 한다. 다이너티트 또는 진공은 상월제를 흡인하면서 각 세척 사이의 흡인 과정에서 조직 단편 손실을 방지한다.
참고: 각 세척 후 튜브를 변경할 필요가 없습니다.
4. 콜라게나아제 소화 1
- 콜라게나아제 소화 완충제 20 mL를 50 mL 폴리프로필렌 원엽 튜브의 세척된 결장 단편에 첨가합니다.
- 폐쇄 된 50 mL 튜브를 37 °C에 인큐베이션 궤도 셰이커에 놓고 60 분 동안 2 x g로 설정된 회전 속도를 유지합니다. 필요한 경우 회전 속도를 점진적으로 증가시키면 조직 조각이 튜브 바닥에 정착하지 않도록 합니다.
5. 실리카 기반 분리 매체 그라데이션 준비
- 20°C(실온) 및 결장 완충액에서 100% 실리카 기반 밀도 분리 매체를 사용하여 66% 및 44% 실리카 기반 밀도 분리 매체를 준비합니다.
- 실리카 기반 밀도 분리 매체 를 66% 5mL를 3개의 분리된 15mL 폴리프로필렌 튜브각각에 붓습니다. 결장 당 3 개의 튜브를 준비하십시오. 이는 그라데이션 절연 절차의 더 높은 밀도 기반을 형성하며, 그 위에 는 더 낮은 밀도 분리 매체가 겹쳐져 분리 그라데이션을 작성합니다.
- 사용할 때까지 20°C에서 보관하십시오.
6. 소화 1에서 상급의 컬렉션
- 25 mL 의 혈청학적 피펫을 사용하여 상량체만 을 수집하고 40 μm 기공 여과 직물 세포 스트레이너를 통해 상급체를 걸러내고 깨끗한 50 mL 폴리프로필렌 원유관에 넣은 후 콜라게나아제 소화 1이 완료된다. 기존 조직 조각을 흡인하지 않도록주의하십시오.
참고: 튜브에 남아있는 눈에 보이는 조직 조각을 유지합니다. 이들은 두 번째 콜라게나아제 소화를 겪게 됩니다 (단계 8).
7. 담금질 콜라게나아제 소화 완충제
- 차가운 결장 완충제으로 50 mL 폴리 프로필렌 튜브를 완전히 채웁니다.
참고: 콜라게나제는 37°C에서 활성; 따라서 차가운 버퍼는이 효소를 비활성화합니다. - 튜브를 800 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 진공 포부를 통해 상급을 폐기하십시오. 신선한 결장 완충액 25 mL로 세포를 씻고 원심 분리기를 800 x g에서 5 분 동안 씻으하십시오.
- 신선한 차가운 콜론 버퍼의 1 mL 미만에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다.
- 50 mL 폴리 프로필렌 원점 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
8. 콜라게나아제 소화 2
- 4단계(소화 1)를 반복하고 나머지 조직 단편을 6.1단계에서 유지하였다.
9. 소화 후 조직 분리 2
- 18 G 무딘 끝 바늘을 통해 관과 10 mL 주사기 사이 조직 단편을 격렬하게 앞뒤로 플러시합니다.
- 총 조직 파편이나 파편이 보이지 않는 때까지 계속, 최소 7-8 완전한 통로에 대한이 플러시를 반복합니다.
10. 필터 셀
- 조직 분리 현탁액을 40 μm-기공 여과 직물 세포 스트레이너를 통해 깨끗한 50 mL 폴리프로필렌 튜브로 전달한다.
- 여과 직물 세포 스트레이너를 10 mL 냉각 된 콜론 버퍼로 씻어 필터에 감아진 모든 세포를 복구하십시오.
11. 담금질 콜라게나아제 소화
- 50 mL 폴리 프로필렌 원추형 튜브를 차가운 결장 완충제으로 림에 채웁니다.
참고: 콜론 버퍼의 온도는 콜라게나제 활성의 담금질을 보장하는 데 중요합니다. - 4 °C에서 800 x g에서 5 분 동안 회전하십시오.
- 진공 포부를 통해 상급을 폐기하십시오.
- 신선한 차가운 결장완충액 25 mL로 다시 일시 중단한 다음 4 °C에서 원심분리, 800 x g를 5 분 동안 세척하십시오.
- 진공 포부를 통해 상급을 폐기하십시오.
- 콜라게나아제 소화 1(단계 7)에서 11.4단계에서 해당 튜브로 재부유된 펠릿을 풀링합니다.
- 11.4 단계 (세척 및 원심 분리)를 반복합니다.
12. 실리카 기반 밀도 분리 매체 그라데이션 분리
참고: 콜라게나제 활성의 신속한 담금질을 보장하기 위해 가능한 한 빨리 12-18단계를 수행하십시오.
- 11.7단계에 이어, 콜론당 44% 실리카 계 밀도 분리 매의 총 24 mL에서 각 펠릿을 재중단시켰다.
- 10 mL의 혈청학적 파이펫을 사용하여 5.2단계(66% 실리카 계 밀도 분리 매체 포함)에서 제조된 3개의 튜브 각각에 12.1단계로부터 의 8 mL의 매체를 천천히 층화한다. 인터페이스의 중단을 방지하기 위해 그라데이션을 계층화하는 동안 44% 밀도 분리 매체의 일정하고 느린 흐름을 유지합니다.
- 계량 스케일 또는 저울을 사용하여 원심 분리기 버킷 내의 모든 튜브의 균형을 신중하게 조정합니다.
- 20 °C에서 브레이크없이 원심 분리기에서 859 x g에서 튜브를 20 분 회전시면됩니다. 로터가 튜브를 제거하기 전에 휴식을 취하도록 허용하고 그라데이션 인터페이스에서 세포를 방해하지 않도록 주의하십시오.
13. 그라데이션 인터페이스에서 단핵 셀 수집
- 그라데이션 인터페이스(5mL 마크 근처)를 시각화하여 일반적으로 1-2mm 두께의 흰색 밴드(MNC 포함)가 있는 경우.
참고: 백색 밴드가 보일 수도 있습니다. 그러나 MNC는 이 인터페이스에 있으며 그라데이션 인터페이스의 선명도를 흐리게 해야 합니다. - 진공 흡입 및 인터페이스에 대한 더 쉬운 파이펫 액세스를 허용하기 위해 상단 그라데이션의 상위 7 mL을 폐기합니다.
- 연속 수동 흡입과 꾸준한 회전 손목 동작을 사용하여 셀의 인터페이스 층을 깨끗한 50mL 폴리 프로필렌 원점 튜브로 수집합니다. 2 그라데이션 사이의 인터페이스가 명확하고 refractile (셀의 지우기) 때까지 수집합니다.
- 차가운 FACS 버퍼 50 mL로 수집 튜브를 채웁니다. 4 °C, 800 x g에서 5 분 동안 회전하십시오.
- 진공 흡인을 통해 상구체를 흡인하고 FACS 버퍼의 1 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다.
- 적절한 죽은 세포 배제 방법을 사용하여 1:2 희석에서 혈세포계의 세포를 계산합니다.
- FACS 염색 또는 갓 분리된 결장 MNC로 다른 분석으로 진행합니다.
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Representative Results
뮤린 결장 질환 모델로 작업할 때, 염증 과정에 관여하는 결장의 MNC, 다중 면역 세포 서브세트를 정량화하고 질적으로 평가할 수 있는 것이 도움이 된다. 이 프로토콜의 적용을 통해 얻은 MNC의 단세포 현탁액은 강력하고 재현 가능한 방식으로 이러한 현상형 특성화를 용이하게 한다. 다양한 실험 설정하에서 이러한 격리 방법의 적용에 대한 원리의 증거로서, 우리는 이 방법을 사용하여 콜로닉 MNC를 회수하고 마우스로부터 분리된 세포에 대한 다중 파라미터 유동 세포측정을 수행하였다(도1 및 그림 2 , 동종 BMT) (도2A,syngeneic BMT)BMT 에 따른 상당한 면역 매개 대장 손상.
유세포 분석 및 데이터 분석은 DNase 1 치료의 유무에 관계없이 콜라게나제 E 또는 D를 사용하여 아포토틱 및 괴사 죽은 림프구의 분획을 비교하기 위해 수행되었다. 유세포분석 중에 사용되는 게이팅 전략은 도 1A에제공된다. 아넥신 V(apoptosis marker) 및 고정 가능한 라이브/데드 블루 염료(괴사 마커)에 이어 각 분리된 후 단일 세포 현탁액에 염색한 후, DNAse가 없는 콜라게나제 E는 아넥신 V 네그에서 상당히 높은 비율을보였습니다. 라이브/데드 블루네그 라이브 셀 (중앙값 43.3%, 범위 26.5%-59.9% , n = 3) DNAse 없이 콜라게나아제 D와 비교했을 때 격리 후(중앙값 8.7%, 범위 3.6%-10.2%, n= 3), 콜라주나제 E + DNAse(중앙값 8.18%, 범위 4.7.7%)와 비교하더라도 콜라게나아제 D + DNAse (중앙값 15.10%, 범위 9.9%-21.4%, n = 3). 또한, 우리는 콜라주나아제 E 군(범위 37.1%-58.8%, n=3)에서 41.0%의 중간 백분율로 아넥신 Vneg Live/DeadBlue+ 괴사 세포를 확인했으며, 콜라나제 D 군(범위 69.7%-95.5%, n = 3), 75.9% 콜라게나아제 D+ D나아제 군에서 각각 80.3%(범위 65.7%-79.5%, 범위 54.9%-89.9%, n=3). 각 군에서 n=1 동물로부터의 대표적인 FACS 플롯은 도 1B)를도시한다.
병에 걸린 마우스에서 이 절차를 사용하여 생존 가능한 MNC의 일관성 및 수율의 원리에 대한 추가 증거로서, 다중 파라메트릭 유동 세포측정은 동종(CD45.1)의 BMT를 받은 후 7일째에 CD45.2 BALB/c 수용자 마우스로부터 분리된 MNC에 적용되었다. C57BL/6 기증자) 또는 동기화(CD45.1 BALB/c 기증자) BMT 모델. 유세포분석 분석에 의해 얻어진 백분율 게이트 면역 서브세트를 곱한 절대 MNC 숫자를 사용하여, BMT 수령인의 결장에서 추출된 기증자CD4+ 및 CD8+ T 세포의 절대 수를 계산하고 비교할 수 있었다(n = 4 그룹당, 그림 2A). 이러한 마우스 모델에서 희귀 면역 세포 집단을 식별 및/또는 정량화하는 것이 중요할 수 있기 때문에, 우리는 합성 및 동종 BMT 모델 모두에서 기증자 유래 (CD45.1+) Foxp3+ T 조절 세포 (Treg)를 포함한 희귀 한 하위 집합을 평가했습니다. 항체 염색 단세포 현탁액으로부터 공여자 트레그 세포(CD4+ CD25+FoxP3+)에 도달하는 게이팅 전략이 도시된 단계(적색화살표로 묘사된 게이트의 서열; 그림 2B)를참조하십시오. 이 방법을 사용하여, BMT 후 기증자 유래 결장 Treg 와 같은 드문 서브세트도 분석할 수있었다(도 2C,대표 플롯; n=1).
그림 3은 BALB/c 마우스의 결장에서 GVHD 유도 CD8+와 CD4+ 기증자 유래 T 세포의 축적을 비교하기 위해 제시된 프로토콜을 사용하여 당사 그룹의 역사적 데이터에서 이 방법의 확장된 적용을 보여줍니다. GVHD에서 사전 BMT 치료 준비에 의해 (컨디셔닝) 처방20. 시험된 예비 식이요법은 800cGy/골수성 총 체조사 (TBI800) 또는 비 골수성 TBI (400TBI)뿐만 아니라 총 림프 조사 (TLI)를 사용하여 비 골수성 컨디셔닝을 포함했습니다. 두개골, 폐, 사지, 골반 및 꼬리의 차폐로 노드, 흉선 및 비장. 모든 컨디셔닝은 면역 조절제인 항-티모시테 혈청(ATS)과 결합되었다. BMT 후 6 일 일찍, 이 결장 MNC 격리 프로토콜은 비장과 장간막 림프절 (MLN)과 같은 더 많은 림프구 농축 GVHD 표적 장기에 대한 동일한 분석에 비해 강력한 흐름 세포 측정 분석 결과(그림 3A)20 . BMT 수용자에 걸쳐 대장 MNC의 재현 가능한 격리 (n = 7-10 치료 그룹 당) 다른 이식 전 컨디셔닝 치료 그룹 사이의 기증자 CD8+ 이펙터 T 세포의 절대 수의 강력한 통계적 비교를 허용 ( 도 3B),TBI 프리 BMT 컨디셔닝과 반대로 TLI로부터 GVHD 보호의 선천적인 면역 메커니즘을 밝히는 주요 연구를 이끈 면역 표현형에 대한 중요한 데이터를 산출한다. 20개
그림 1: 유동 세포 측정 분석 DNAse 1의 유무에 관계없이 콜라게나아제 E 및 D로 격리된 경우 동종 마우스 모델 시스템에서 BMT 후 7일째에 대장 MNC를. 야생형(WT)(CD45.2+)BALB/c(H2Kd+)마우스는 CD45 선천성(CD45.1+)C57BL/6 도포 마우스(동종 BMT, n=그룹당 3)로부터 BMT를 받았다. WT(CD45.2+) BALB/c 수용자 마우스를 BMT 1일 전에 800cGy TBI(BALB/c)를 투여하였다. BMT 후 7일째에, 수령인 결장의 단세포 현탁액은 콜라게나제 E(100 U/mL), 콜라게나아제 E(100 U/mL) 및 DNAse 1(500 μg/mL), 콜라주나아제 D(500 μg/mL), 또는 콜라겐(500 μg/mL) 또는 콜라겐을 사용하여 이 원고의 방법에 따라 제조되었습니다. DNAse 1(500μg/mL)(그룹당 n = 3)을 사용합니다. 세포는 라이브/데드 UV450(Live/Dead Blue), 아넥신 V-APC, H-2Kd-PE,CD45.1-BV605, CD3-FITC, CD4-BV711, CD8-APC-Cy7, FoxP3-Pacific Blue 및 CD11b-PE-7 항물체로 염색하였다. (A)FACS 분석을 위한 게이팅 전략. 백혈구를 식별하는 데 사용되는 MNC의 단세포 현탁액상에 게이트 0,전방 산란(FSC-A) 및 측면 산란(SSC-A); 게이트 1,SSC-A를 이용한 비단일 셀의 배제; 게이트 2,FSC-A를 이용한 비단일 셀의 배제; 게이트 3,아넥신 V 양성(apoptotic) 및 고칠 수 있는 생존성 염료 라이브/데드 UV450+아넥신 V-음성(괴사) 세포 서브세트의 식별. (B)4개의 실험군에 대한 MNC 중의 게이트백혈구의 Annexin V 및 고정 가능한 생존성 염료 염색의 대표적인 FACS 플롯. N =그룹당 대표 마우스 1개: 콜라게나아제 E (100 U/mL), 콜라주나아제 E (100 U/mL) + DNAse 1 (500 μg/mL), 콜라주나아제 D(500 μg/mL), 콜라주나아제 D(500 μg/mL) + DNL(500 μg/mL) + DNL 100mL. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 동종 및 합성 마우스 모델 시스템에서 BMT 후 7일째에 대장 MNC의 유동 세포측정 특성 분석. WT (CD45.2+) C57BL/6 (H2Kd-neg)및 BALB/c (H2Kd+)마우스는 CD45-congenic (CD45.1+ )C57BL/6 및 BALB/c 공여자 마우스(신생성 또는 동종 BMT, n=실험군당 4)로부터 BMT를 받았다. C57BL/6 및 BALB/c 수용자 마우스는 BMT 하루 전에 전달된 950cGy (C57BL/6) 및 800cGy (BALB/c) 골수성 TBI의 예비 컨디셔닝 요법을 받았습니다. BMT 후 7일째에, 수용자 결장 MNC의 단세포 현탁액은 이 원고의 방법에 따라 제조되었다. 세포는 살아있는 죽은 BV510, H-2Kd-PE,CD45.1-BV605, CD4-FITC, CD8-APC-Cy7, CD25-퍼시픽블루, FoxP3-AF647 및 CD11b-PE-Cy7 항체, N=그룹당 4개의 마우스로 염색하였다. (A)평균 ± SEM 절대 번호 (로그 10) CD45.1+ H-2kd-neg 또는 CD45.1+ H-2kd + (기증자 유형, 각각의 경우) CD11bneg CD4+ 및 CD8+ T 세포는 7 일째에 받는 사람 결장에서 분리되었습니다. 컨디셔닝 및 CD45.1 C57BL/6 (기증자) → CD45.2 BALB/c (수신자) BMT. N = 그룹당 4개. (B)FACS 분석을 위한 게이팅 전략. 백혈구를 식별하는 데 사용되는 MNC의 단세포 현탁액상에 게이트 0,전방 산란(FSC-A) 및 측면 산란(SSC-A); 게이트 1,SSC-A를 이용한 비단일 셀의 배제; 게이트 2,FSC-A를 이용한 비단일 셀의 배제; 게이트 3,라이브 셀 선택 게이트 4, BMT 공여체의 조혈 세포의 분리 대 BMT 수용자 기원; 게이트 5, 공여자 비골수성 혈통 세포의 선택; 게이트 6,CD4+ T 세포의 선택적 게이팅; 게이트 7, CD4+CD25+FoxP3+ T 조절 (Treg) 세포의 별도의 게이팅. 빨간색 화살표는 드릴다운 게이팅 전략을 나타냅니다. (C)동종 BMT의 BALB/c 수용자의 결장에서 컨디셔닝 및 BMT 후 7일째에 (B)에서 게이팅 전략을 이용하여 CD25 및 FoxP3 염색의 대표적인 FACS 플롯(C57BL/6 →BALB/c). 각 게이트의 셀 백분율은 게이트 내에 주어집니다. WT = 와일드 타입; TBI = 총 체조사; BM = 10 x 106 CD45.1+ 선천성 C57BL/6 또는 BALB/c 공여자 골수 세포; 테프 = T 이펙터 셀; Treg = Foxp3+ T 조절 셀. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 비골수성 TLI/ATS는 TBI/ATS 컨디셔닝이 감소시키지만 공여자 TCRαβ+CD8+ 이펙터 T 세포 축적을 감소시다. (A)CD4의 대표적인 FACS 플롯 H-2Kb+TCRαβ+ 세포의 비장(맨 위 행), 장간막 림프절(맨 위 줄), 대장간 림프절(중간 줄), 그리고 수령인의 결장(맨 아래 행) 6 컨디셔닝 및 이식 후. 각 게이트의 셀 백분율은 게이트 위에 표시됩니다. (B)평균 ± SEM 절대 수 (log 10) H-2Kb +TCRαβ+CD8+ 세포비장 (상부 패널), MLN (중간 패널), 및 결장 (하단 패널) 컨디셔닝 및 BMT 후 6 일째에 받는 사람의. WT = 와일드 타입; TBI = 총 체조사; TLI =: 총 림프조사; ATS = 항-흉선 혈청; BM = 50 x 106 WT C57BL/6 공여자 골수 세포; SPL = 60 x 106 WT C57BL/6 공여자 비장 세포; TBI800, TBI400 = 골수제 (TBI800) 또는 비 골수제 (TBI400) TBI의 cGy 복용량. *이 그림은 반 데르 메르웨 외20에서수정되었습니다. 저작권 2013. 미국 면역학자 협회, Inc.는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 솔루션 | 수식 |
| 콜론 버퍼 | 500 mL RPMI + 10mM HEPES + 10% FBS (60 분 동안56oC에서 열 불활성화, pH 7.3로 조정) |
| 실리카 기반 밀도 그라데이션 미디어 100% (콜론당) | 실리카 기반 밀도 그라데이션 미디어 22.5 mL + 10x PBS의 2.5 mL. |
| 실리카 기반 밀도 그라데이션 미디어 66% (콜론당) | 10.72 mL 실리카 기반 밀도 그라데이션 미디어 100% + 5.28 mL 결장 버퍼 |
| 실리카 기반 밀도 그라데이션 미디어 44% (콜론당) | 11 mL 실리카 기반 밀도 그라데이션 미디어 100% + 14 mL 결장 버퍼 |
| 콜라게나아제 소화 완충제 (콜론당) | 클로스트리디움 운동용 분석에서콜라게나아제 E 100 U/mL, 40 mL 결장 완충제에 용해 |
| FACS 버퍼 | 500 mL 1x PBS + 5 g BSA + 1mm EDTA + 0.2 g 아지드 나트륨 |
표 1: 솔루션 준비 표.
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Discussion
이 시각적 프로토콜은 라미나 프로피아 림프구(LPL)를 포함하는 결장 단핵 세포의 분리를 위한 잘 용납되는 방법을 기술한다. 이 프로토콜은 염증성 사이토카인과 조직 손상이 회복 된 MNC의 가난한 생존력에 자신을 빌려 심각한 이식 후 마우스 대장염 모델을 평가에 최적화 된 것을 감안할 때, 우리는 이러한 방법이 다른 것으로 번역 될 수 있음을 예상 결장 MNC의 현상학적 분석을 요구하는 응용 프로그램. 이들은, 선동적인 장 질병의 마우스 모형에 있는 결장 염증, 대장염 표적으로 한 처리의 면역 반응의 연구 결과, 및 전염성 병원체에 의해 생성된 대장염을 포함하지만, 이에 국한되지 않습니다. 추가적으로, 건강한 (syngeneic BMT) 마우스에 있는 격리를 사용하여 우리의 데이터는 격리 절차가 MNC 격리에 있는 면역 세포 검출을 허용하기 위하여 중요한 선동적인 침투를 요구하지 않는다는 것을 표시합니다. 실제로, 유사한 데이터는 치료되지 않은 건강한 (비 BMT) 마우스를 사용하여 수득되었습니다 (데이터는 도시되지 않음).
이 프로토콜의 몇 가지 주요 단계는 게시된 다른 방법과 구별되어 높은 수율과 실행 가능성에 기여합니다. 예를 들어, 클로스트리디움 의 운동성 -유래콜라게나아제 E 활성(100 U/mL 최종 활성 도)의 최적화는 장거리 실험26에걸쳐 다양한 효소에 대한 일관된 계산을 가능하게 한다. 콜라겐 가족에있는 28개의 다른 일원이 있습니다, 함께 포유동물 바디에 있는 모든 단백질의 거의 30%를 구성하는27. 또한, 상이한 조직은 콜라겐 아류형의 뚜렷한 분포를 가지며, 각각 소화를 위해 독특한 콜라게나제가 요구되는28. C. 히토틱으로부터의 콜라게나아제는29,30으로분류된 6개의 상이한 단백질을 포함한다. 사용되는 콜라게나아제의 특정 유형은결장(31)으로부터분리된 세포의 생존가능성 및 전반적인 품질을 변화시킬 수 있다. 이전 연구는 콜라게나아제 타입 C-2139 (콜라게나아제 E)가 소장25에서분리 된 MNC 중 의 높은 수율을 허용한다는 것을 입증했다. 그러나, 이 프로토콜은 소장보다는 훨씬 더 복잡한 교원질 조성을 가진 훨씬 더 많은 근육 기관인 결장의 소화를 다루지 않았습니다.
효소 조직 분해의 타당성 및 신뢰성은 재발하는 기계적 중단의 필요성을 최소화함으로써 전반적인 세포 수율 및 생존에 영향을 미치는 확립 된 요인입니다 (이는 조직에 증가 된 기계적 외상을 유도). 콜라게나제 E 특이적 프로토콜을 사용하여 간질 및 점막 콜라겐의 적절한 효소 소화로 인해(표준 사용시 콜라겐 나제 D 매개 소화 프로토콜과 비교), 이 프로토콜은 의 기계적 조작량을 최소화합니다. 간진을 방해하고 현탁액으로 면역 세포 서브세트를 풀어 놓는 데 필요한 조직 단편. 이것은 후속 분석에 대한 격리된 MNC의 생존가능성을 더욱 향상시킵니다. 데이터(그림 1B)에서입증된 바와 같이, 이것은 스트레이너를 통해 단일 세포 현탁액의 표준 여과를 넘어 DNAse 및 기타 화학적 또는 기계적 응집 방지 기동에 대한 필요성을 제거한다. 장 림프세포의 분리를 설명하는 다른 보고는 디티오트라이톨(DTT) 및 EDTA를 점액용액제로 사용하여 단핵백혈구(24)의수율 및 생존력을 모두 향상시켰다.
세포 수율을 향상시키는 이 프로토콜의 또 다른 독특한 측면은 미세 조정된 실리카 기반 밀도 분리 매체 그라데이션의 적용이다. 현재까지 공표된 다른 소화방법 논문은 이러한 밀도 분리구배(21,31)를사용하지 않는다. 그러나, 저자의 경험과 기능적으로 활성 림프 세포를 분리하기 위해이 프로토콜을 활용하는 협력자의 사람들에서, 밀도 그라데이션 정제는 소화 후 회복 MNC의 생존력과 순도를 모두 향상19 , 20개 , 32.
비록이 원고의 초점, 쥐에서 장 염증 모델으로 작업 하는 사람들을 위해 언급의 가치는이 원고에 있는 방법은 소장에서 실행 가능한 MNC의 유사한 높은 품질 격리를 허용 하기 위해 수정될 수 있다. 이를 달성하기 위해 필요한 기본 대장 프로토콜의 변형은 표시된 것과 동일한 다른 모든 단계 (효소 활성 수준 및 담금질 단계를 포함)와 함께 단일 90 분 소화 (2 개의 60 분 소화가 아닌)를 사용하는 것입니다. 이러한 변형은 전형적으로 백혈구가 풍부한 세칼 캡을 포함하는 말단 장의 포함과 함께 소장당 0.8-4 x 106 MNC 또는 1.5-2.5 x 106 MNC의 범위를 산출한다. 따라서, 이 프로토콜의 한 가지 참신은 소장에 1 차 프로토콜을 적용하고 수정된 프로토콜을 소장에 적용하면 개인의 소장과 결장 모두에서 높은 재현성과 좋은 생존율로 MNC를 격리할 수 있다는 것입니다. 실험 동물과 같은 실험을 한다.
요약하면, 설명된 프로토콜은 결장또는 수정으로 소장으로부터 단핵 세포를 효율적이고 재현 가능하게 분리할 수 있게 한다. 2명의 숙련된 연산자가 함께 작업하면 하루에 10개의 개별 결장으로 처리 및 분석할 수 있으며, 단일 세포 현탁액은 조직 수확에서 6-8시간 이내에 후속 현상및 기능 분석을 위해 준비될 수 있습니다. 이 프로토콜의 적용은 다른 연구자가 엄격하고 재현 가능한 방식으로 마우스 결장의 면역 체계를 특성화 할 수 있도록, 대장 염증의 면역 평가를 필요로 다른 연구 목표에 대한 가치를 증명할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 #1K08HL088260 및 #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.) 및 소아 연구를위한 배치 재단 (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.)에 의해 지원되었습니다. 이 연구에서 사용된 C57BL/6 및 BALB/c 마우스는 우리 시설에서 사육되었거나 잭슨 연구소 또는 타코닉에서 제공했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm Petri DIsh | Thermo Scientific | 150288 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 10x PBS | Lonza BioWhittaker | BW17-517Q | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4100 | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 302995 | |
| 15 mL Non-Sterile Conical Tubes | TruLine | TR2002 | |
| 18 G Blunt Needle | Becton Dickinson | 305180 | |
| 25 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4250 | |
| 40 μm pore size Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning | 21008-951 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503-1KG | |
| Fixation Buffer | Biolegend | 420801 | |
| E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum | Sigma | C2139 | |
| EDTA, 0.5 M Sterile Solution | Amresco | E177-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo /Fisher Scientific -HyCLone | SV30014.03 | |
| HEPES | GE Healthcare-HyClone | SH30237.01 | |
| Percoll | GE Healthcare-Life Sciences | 1708901 | |
| RPMI Medium | Corning | 17-105-CV | |
| Sodium Azide | VWR Life Science Amresco | 97064-646 | |
| Trypan Blue | Lonza BioWhittaker | 17-942E |
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