Summary
このプロトコルの目的は、コラゲナーゼを用いて組織の酵素消化によって結腸のラミナプロプリに存在する単核細胞を単離させることである。このプロトコルは、単核細胞の効率的な単核分離を可能にし、その結果、単一細胞懸濁液を生成し、堅牢な免疫表現型に使用することができます。
Abstract
腸は、体内の免疫細胞の最大数に家です。小規模および大規模な腸内免疫系は、外因性抗原への暴露を警察し、強力な微生物由来の免疫刺激に対する応答を調節する。このため、腸は、クローン病や潰瘍性大腸炎、骨後の移植片対宿主病(GVHD)などの炎症性腸疾患に限定されない多くの疾患における免疫調節および炎症の主要な標的部位である。骨髄移植(BMT)、および多くのアレルギーおよび感染性状態。消化管炎症および大腸炎のマウスモデルは、GI合併症を研究し、予防と治療のための前臨床最適化戦略に多く使用されています。これらのモデルから収集されたデータは、腸からの免疫細胞の単離および発型分析を介して収集され、消化管および全身性炎症性疾患を改善するために適用することができるさらなる免疫理解に不可欠である。本報告では、混合シリカベースの密度勾配界を用いて結腸から単核細胞(MNC)を単核細胞(MNC)を単離するための非常に有効なプロトコルについて述べている。この方法は、汚染された破片を最小限に抑えながら、かなりの数の生存性白血病を再現可能に分離し、その後の血流サイトメトリーまたは他の方法による免疫表現型を可能にする。
Introduction
消化管(GI)管は主に食物からの栄養素の処理と再吸収に専念していますが、GI管はまた、血管、リンパ系、神経系および他の多くの器官の完全性において中心的な役割を維持しています。その粘膜および粘膜下免疫システム1.GI免疫システムは、食品、共生細菌、または侵入病原体1、2からの外来抗原への絶え間ない暴露による消化管および全身の健康の両方に影響力のある役割を有する。したがって、GI免疫系は、病原性抗原1、2に適切に応答しながら非病原性抗原に許容する微妙なバランスを維持しなければならない。耐性と防御のバランスが崩れると、局所的または全身性免疫不自由および炎症が起こり得る1、2、3の無数の疾患をもたらす。
腸は、体内のすべてのリンパ球の少なくとも70%を収容する4.ほとんどの一次免疫相互作用は、腸内の3つの免疫局の少なくとも1つを含む:1)ペイヤーのパッチ、2)上皮内リンパ球(IEL)および3)ラミナプロプリアリンパ球(LPL)。これらの各々は、腸内の正常な免疫課題に迅速に応答する免疫細胞の複雑な相互接続されたネットワークで構成されています5.筋粘膜上の間質に制限され、緩やかに構造化されたラミナプロプリアは腸粘膜の結合組織であり、絨毛、血管系、リンパ液の排液、粘膜神経系、ならびに多くの自然の足場を含む。および適応免疫サブセット6,7,8,9.LPLは、CD4+およびCD8+T細胞を2:1の近似比で構成し、血漿細胞および骨髄系統細胞、樹状細胞、マスト細胞、好酸球およびマクロファージ6を含む。
様々な疾患状態に関連する腸の免疫不調と炎症を理解することに対する関心が高まっています。クローン病および潰瘍性大腸炎のような状態はすべて、大腸炎症10、11、12の様々なレベルを現す。さらに、同種骨髄移植(allo-BMT)を受ける骨髄または免疫系の悪性または非悪性障害を有する患者は、1)コンディショニングレジメンからの直接的な毒性を含む様々な形態の大腸炎を発症する可能性がある。BMTの前に、2)BMTおよび3)BMT後の免疫抑制によって引き起こされる感染症および3)BMT13、14、15の後に組織内のドナー・アロ抗原に反応するドナー型T細胞によって駆動される移植片対宿主病(GVHD)。これらすべてのポストBMT合併症は、腸16、17、18の免疫環境に有意な変化をもたらす。提案された方法は、マウス結腸における免疫細胞蓄積の信頼できる評価を可能にし、BMT後のマウスレシピエントに適用すると、移植耐性に関与するドナーおよびレシピエント免疫細胞の両方の効率的なアッセイを容易にする19 、20.腸の炎症の追加の原因は、悪性腫瘍、食物アレルギー、または腸内微生物叢の破壊が含まれます。このプロトコルは、結腸からの腸単核細胞のアクセスを可能にし、修飾して、これらの前臨床マウスモデルのいずれかで小腸の白血球にアクセスする。
検索語「腸と免疫細胞と分離」を用いたPubMed検索は、免疫細胞を抽出するための小腸消化の方法を記述する200以上の出版物を明らかにする。しかし、コロンの同様の文献検索では、結腸からの免疫細胞の単離を指定する十分に記述されたプロトコルは得られなかった。これは、結腸がより筋肉と間質の層を持っているので、小腸よりも完全に消化するのが難しいからかもしれません。既存のプロトコルとは異なり、このプロトコルは、特に他の細菌性コラゲナーゼ(コラゲナーゼD/コラゲナーゼI)なしでクロストリジウム内素体からコラゲナーゼEを使用します。我々は、このプロトコルを用いて、ナトリウムversenate(EDTA)、ディスパーゼIIなどの抗束試薬を添加することなく、単核免疫細胞(MNC)の単核免疫細胞の品質を維持しながら、大腸組織の消化を達成できることを実証する。デオキシリボヌクレアーゼI(DNAse I)21、22、23.このプロトコルは、さらなる指示された研究のためにマウス結腸から生存可能なMNCの再現可能な堅牢な抽出を可能にするために最適化され、コロンの免疫学の研究または(修飾を伴う)小腸24、25.
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Protocol
すべての研究は、米国協会によって設定された獣医基準を満たすマイアミミラー大学医学部の機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって検討され、承認されたげっ歯類の研究プロトコルの下で行われました。実験動物科学(AALAS)用。
1. ソリューションの準備
-
表1に説明するように、コロンバッファー、シリカ系密度分離媒体100%、シリカ系密度分離媒体66%、シリカ系密度分離媒体44%、コラゲナーゼE消化バッファー、およびFACSバッファーを調製する。
- 手順の前日にコロンバッファを準備し、4 °Cで一晩保存します。
- 手順の前日に100%シリカベースの密度分離媒体を準備し、4°Cで一晩保存し、解凍する手順の朝に室温に置きます。
- 室温100%シリカベース密度分離媒体とコロンバッファを使用して、分離の朝に66%および44%のシリカベースの分離媒体を準備します。
- クロストリジウムの口論体由来コラーゲナーゼEの適量を測定し、手順の前に一晩-20°Cで保存します。翌朝、コロナセ消化バッファーを導出するために適切な量のコロンバッファーに溶解する。手順の日にコラゲナーゼ消化バッファーを持つすべてのインキュベーションのために、37 °Cに溶液を事前に温めます。
- プロトコルステップ全体について、1つの遠心分離機を20°Cに保ち、回転速度は859 x gで、勾配遠心分離のためにブレーキが不活性化(0減速)します。洗浄ステップのために、標準的な減速で、別の4 °Cと859 x gの回転速度に別のものを設定します。
2. コロンの収穫
- CO2窒息を介してマウスを安楽死させ、AALAC承認の確認方法を行う。
- マウスをサフィンの位置に置き、70%のエタノールで毛皮をスプレーします。大きな組織はさみを使用して、垂直中線切開を行い、無傷の下腸膜を露出させる。
- 細かい解剖はさみを使用して、ペリトネウムを開きます。鉗子を使用して小腸を片側に移動し、下側の結腸を露出させる。下降コロンをわずかに上方に引き上げ、結腸の直腸部分を最大限に露出します。骨盤の深部の遠位直腸を切り取り、解剖し、遠位直腸からセカルキャップまで、結腸全体を1単位として取り除きます。
- 50 mLポリプロピレンチューブで20 mL冷蔵コロンバッファーにコロンを移します。
3. コロンのクリーニング
- 湿ったペーパータオルの上にコロンを置き、はさみや鉗子の鈍い端で腸壁に軽度の圧力を加えることによって固体便を抽出します。
- ペトリ皿にコロンを入れ、18Gの鈍い充填針で10 mLの注射器を使用して、冷やしたコロンバッファーの10 mLで腸を洗い流します。
- コロンバッファー湿潤ペーパータオルにコロンを転送し、ハサミの鋭い端で腸間膜と脂肪を削除します。
- 5-10 mLの冷蔵コロンバッファーで満たされたペトリ皿にコロンを入れ、残りのコロニックコンテンツを洗浄するために手動で攪拌します。2~3回繰り返します。
- 新鮮な冷蔵コロンバッファーで満たされたペトリ皿で、より筋肉の直腸端から近位結腸(単一の長方形の開いたコロンピースを生成する)に長手方向に大腸をカットします。既存のメディアを破棄し、きれいな冷蔵コロンバッファで補充します。
- ペトリ皿に激しく旋回し、各洗浄後に冷やしたコロンバッファーの5-10 mLを交換することにより、腸を3回洗います。
- 長方形の大腸組織をコロンバッファーで湿らせてペーパータオルに置き、水平にスライスしてから小さな断片(3mm x 3mmのセクション)に切り取ります。
- 50 mLポリプロピレン円錐管で20 mL冷やされたコロンバッファーに細かい鉗子を使用して慎重にコロン断片を収集します。
- 結腸断片を3回洗浄し、各洗浄を20mLコロンバッファーで洗浄し、各攪拌の間に30秒間チューブを激しく旋回させることにより、組織断片がチューブの底部に沈着することを可能にする。各洗浄間の吸引プロセスにおける組織断片の損失を防ぎながら、上清を吸引するデカントまたは真空。
注:各洗浄後にチューブを交換する必要はありません。
4. コラゲナセ消化 1
- 50 mLポリプロピレン円錐管の洗浄された結腸断片にコラゲナーゼ消化バッファーの20 mLを追加します。
- 閉じた50 mLチューブを37°Cのインキュベートされた軌道シェーカーに置き、回転速度を2 x gに60分間設定し、組織断片が攪拌中に一定の動きにあることを確認します。必要に応じて、回転速度を増やして、組織断片がチューブ底部に落ち着かないようにします。
5. シリカベースの分離メディアグラデーションの準備
- 20°C(室温)とコロンバッファーで100%シリカベースの密度分離媒体を使用して、66%および44%のシリカベースの密度分離媒体を準備します。
- 66%のシリカベースの密度分離媒体の5 mLを3つの別々の15 mLポリプロピレン管のそれぞれに注ぎます。コロンごとに3本のチューブを準備します。これは、グラデーション分離手順の高密度ベースを形成し、その上に低密度分離媒体が層化され、分離勾配が作成されます。
- 使用するまで20°Cで保管してください。
6. 消化からの上清のコレクション 1
- 25 mLの血清ピペットを使用して上清のみを収集し、コラーゲナーゼ消化1が完了した後、クリーンな50 mLポリプロピレン円錐管に置かれた40 μmの細孔ろ過布セルストレーナーを通して上清を濾過します。既存の組織断片を吸引しないように注意してください。
注:チューブ内の残りの可視組織断片を保持します。これらは第2のコラーゲナーゼ消化を受ける(ステップ8)。
7. コラゲナーゼ消化バッファーのクエンチング
- 50 mLポリプロピレンチューブを冷やしたコロンバッファーで完全に充填します。
注:コラゲナセは37 °Cで活性です。したがって、冷やしたバッファーは、この酵素を不活性化します。 - チューブを4°Cで800 x gで5分間遠心分離します。
- 真空吸引を介して上清を廃棄します。新鮮なコロンバッファーと遠心分離機の25 mLで細胞を5分間800 x gで洗浄します。
- 新鮮な冷蔵コロンバッファーの1 mL未満でペレットを再中断します。
- 50 mLポリプロピレン円錐管を氷の上に置きます。
8. コラゲナセ消化 2
- ステップ4(消化1)を繰り返し、残りの組織断片をステップ6.1から保持します。
9. 消化後の組織分解 2
- 18 Gの鈍い端の針を通して管および10 mLの注射器の間で組織の断片を激しく前後に洗い流す。
- このフラッシュを7~8回の完全な通路で繰り返し、グロス組織の断片や破片が見えなくなるまで続きます。
10. セルのフィルタ
- 40 μm-poreろ過布セルストレーナーを通して組織の溶解懸濁液をきれいな50 mLポリプロピレンチューブに渡します。
- 濾過布地のストレーナーを10mLの冷蔵コロンバッファーで洗浄し、フィルターに入った細胞を回収します。
11. コラゲナセ消化をクエンチング
- 50 mLポリプロピレン円錐管を冷やしたコロンバッファーでリムに充填します。
注:コロナバッファーの温度は、コラゲナーゼ活性の消光を確保するために重要です。 - 4 °C と 800 x gで 5 分間スピンします。
- 真空吸引を介して上清を廃棄します。
- 新鮮な冷蔵コロンバッファーの25 mLで再中断し、続いて4°Cで遠心分離、800 x gを5分間洗浄します。
- 真空吸引を介して上清を廃棄します。
- コラーゲンナーゼ消化1(ステップ7)からステップ11.4から対応するチューブに再懸濁ペレットをプールします。
- ステップ11.4(洗浄と遠心分離)を繰り返します。
12. シリカベースの密度分離媒体グラデーション分離
注:可能な限り迅速にステップ12〜18を実行し、コラゲナーゼ活性の迅速な消光を確保する。
- ステップ11.7に続いて、結腸当たり44%のシリカ系密度分離媒体の合計24mLで各ペレットを再中断する。
- ステップ12.1からステップ5.2(66%シリカ系密度分離媒体を含む)で調製された3本のチューブのそれぞれに、10mLの血清ピペットを用いて、培線の8mLをゆっくりと層化する。インターフェイスの中断を避けるためにグラデーションを重ねながら、44% 密度分離メディアの安定した低速な流れを維持します。
- 計量スケールまたはバランスを使用して、遠心分離管内のすべてのチューブを慎重にバランスを取ります。
- 20°Cでブレーキなしで遠心分離機で859 x gでチューブを20分回転させます。ローターがチューブを取り外す前に休息を完了するようにし、グラデーションインターフェイスでセルを破壊しないように注意してください。
13. グラデーション界面から単核細胞を収集する
- グラデーション インターフェイス(5 mL マーク付近)を視覚化し、通常は 1 ~ 2 mm の厚さの白いバンド (MNC を含む) が存在します。
注:白いバンドが表示される場合と見えない場合があります。ただし、MNC はこのインターフェイスにあり、グラデーション インターフェイスの明瞭さを曇らせる必要があります。 - 真空吸引し、インターフェイスへのより簡単なピペットアクセスを可能にするために、トップグラデーションのトップ7 mLを破棄します。
- 連続的な手動吸引および安定した回転手首の動きを使用して、きれいな50 mLポリプロピレン円錐形の管に細胞の界面層を集める。2つのグラデーション間のインターフェイスが明確で、再フラクタイル(セルのクリア)になるまで収集します。
- 回収管に50mLの冷蔵FACSバッファーを充填します。4 °C、800 x gで5分間スピンします。
- 真空吸引を介して上清を吸引し、FACSバッファの1 mLでペレットを再中断します。
- 適切な死細胞排除法を用いて1:2希釈で血球計上の細胞を数えます。
- 新たに単離された結腸MNCを用いてFACS染色または他のアッセイに進みます。
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Representative Results
マウス結腸疾患モデルを使用する場合、結腸のMNCの中で、炎症過程に関与する複数の免疫細胞サブセットを定量化および定性的に評価することができるのが有用である。このプロトコルの適用を介して得られたMNCの単一細胞懸濁液は、堅牢で再現可能な方法でそのような型近性特性を容易にする。多様な実験設定下でこの単離法を適用するための原理の証明として、この方法を用いて大腸MNCを回収し、マウスから単離した細胞に対して多パラメータフローサイトメトリーを行った(図1および図 2,同種BMT)(図2A、合成BMT)BMT後の有意な免疫媒介性結腸損傷なし。
フローサイトメトリーとデータ分析は、DNase 1治療の有無にかかわらず、コラゲナーゼEまたはDのいずれかを単離に使用する場合に、アポトーシスおよび壊死性死果リンパ球の画分を比較するために行った。フローサイトメトリー中に使用されるゲーティング戦略は、図1Aで提供されています。 アネキシンV(アポトーシスマーカー)と固定可能なライブ/デッドブルー染料(壊死マーカー)に続いて、各単一細胞懸濁液に染色し、DNAseを持たないコラーゲンネーゼEは、アネキシンVネグの有意に高い割合を示したライブ/デッドブルーネグライブセル(中央値43.3%) 範囲 26.5%-59.9% ,n = 3) DNAse なしのコラゲナーゼDと比較した場合の単離後(中央値8.7%、範囲3.6%-10.2%、n=3)、コラゲナーゼE+DNaae(中央値8.18%、レンジ4.7%-20.4%、n=3)コラゲナーゼD +DNaAse(中央値15.10%、範囲9.9%-21.4%、n=3)。また、コラゲナーゼE群の中央値41.0%(範囲37.1%-58.8%、n=3)対コラゲナーゼD群の90.0%対90.0%(範囲69.7%-95.5%、n=3)、75.9%のコラージュでアネキシンVネグライブ/デッドブルー+壊死細胞を同定しました。コラゲナーゼD+DNAse群では80.3%(範囲65.7%~79.5%、範囲54.9%~89.9%、n=3)。各群のn=1動物からの代表的なFACSプロットを図1Bに示す。
病気のマウスでこの手順を用いた生存可能なMNCの一貫性と収率のさらなる証明として、同種のBMTを受けた後の7日目にCD45.2 BALB/cレシピエントマウスから単離されたMNCにマルチパラメトリックフローサイトメトリーを適用した(CD45.1)C57BL/6ドナー)または同系(CD45.1 BALB/cドナー)BMTモデル。フローサイトメトリー分析によって得られたパーセンテージゲート免疫サブセットを掛けた絶対MNC数を使用して、BMTレシピエントの結腸から抽出されたドナーCD4+およびCD8+T細胞の絶対数を計算し、比較することができました(n = 4グループごとの、図 2A)。このようなマウスモデルでは希少免疫細胞集団を同定および/または定量化することが重要であるため、同種BMTモデルおよび同種BMTモデルの両方でドナー由来(CD45.1 +)Foxp3+ T調節細胞(Treg)を含む希少なサブセットを評価した。抗体染色された単一細胞懸濁液からドナーTreg細胞(CD4+CD25+FoxP3+)に到達するためのゲーティング戦略が示されている(赤い矢印で描かれたゲートの配列;図 2B)。この方法を用いて、BMT後のドナー由来のコロニックTreg浸潤レシピエントマウスコロンなどの希少なサブセットも分析することができた(図2C、代表プロット、n=1)。
図3は、BALB/cマウスの結腸内のGVHD誘導CD8+対CD4+ドナー由来T細胞の蓄積を比較するために提示されたプロトコルを使用して、我々のグループからの履歴データにおけるこの方法の拡張適用を示す。BMT前処理準備(コンディショニング)レジメン20によるGVHDから。試験された準備療法には、800 cGy/骨髄筋全体照射(TBI800)または非骨髄性TBI(400TBI)、ならびに照射がリンパに送達された全リンパ照射(TLI)を用いた非骨髄調節調節が含まれていた。頭蓋骨、肺、手足、骨盤および尾のシールドを伴うノード、胸腺、および脾臓。全ての調節を抗チモサイト血清(ATS)と組み合わせ、免疫調節剤を用いたた。BMT後6日目の早い段階で、この大腸MNC単離プロトコルは、脾臓および腸間膜リンパ節(MLN)などのより多くのリンパ球濃縮GVHD標的器官に対する同一の分析と比較して、堅牢なフローサイトメトリック分析をもたらした(図3A)20.BMTレシピエント間の結腸MNCの再現可能な単離(治療群当たりn=7-10)は、異なる移植前調節治療群間のドナーCD8+エフェクターT細胞の絶対数の強い統計的比較を可能にした(図3Bは、TBIプレBMT調節とは対照的に、TLIからのGVHD保護の自然免疫メカニズムを明らかにする主要な研究につながった免疫表現型に関する重要なデータを得る。20歳
図1:フローサイトメトリック解析DNAse 1の有無にかかわらずコラゲナーゼEおよびDで単離した場合、同種マウスモデルシステムにおけるBMT後7日目のコロニックMNC。野生型(WT)(CD45.2+)BALB/c(H2Kd+)マウスは、CD45先天性(CD45.1+)C57BL/6ドナーマウス(同種BMT、n=3群当たり)からBMTを受け取った。WT(CD45.2+)BALB/cレシピエントマウスをBMTの1日前に800cGy TBI(BALB/c)を投与した。BMT後7日目に、コラゲナーゼE(100U/mL)、コラーゲナーゼE(100U/mL)、DNAE1(500μg/mL)、コラーゲナーゼD(500μg/mL)、またはコラージュナーゼD(500μg/mL)を用いて、この原稿の方法に従って単細胞懸濁液を調製した。DNAse 1(500μg/mL)(n = 3群)を使用します。細胞は、ライブ/デッドUV450(ライブ/デッドブルー)、アネキシンV-APC、H-2Kd-PE、CD45.1-BV605、CD3-FITC、CD4-BV711、CD8-APC-Cy7、FoxP3-パシフィックブルー、およびCD11b-PE-Cy7抗体で染色した。(A)FACS分析のためのゲーティング戦略。ゲート0、前方散乱(FSC-A)および側散乱(SSC-A)は、白血病を同定するために使用されるMNCの単一細胞懸濁液上で。ゲート1、SSC-Aを用いる非単一細胞の除外;ゲート2、FSC-Aを用いて非単一細胞の除外;ゲート3、アネキシンV陽性(アポトーシス)および固定可能な生存率染料ライブ/デッドUV450+アネキシンV-陰性(壊死)セルサブセットの同定。(B)4実験群に対するMNC間のゲート状白血球のアネキシンV及び固定可能な生存性染料染色剤の代表的なFACSプロット。N =1群群当たりの代表マウス:コラゲナセE(100U/mL)、コラゲナセE(100U/mL)+DNAse 1(500μg/mL)、コラゲナーゼD(500μg/mL)、コラゲナーゼD(500μg/mL)+DNAe(500μg/mL)+この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:同種および同種マウスモデルシステムにおけるBMT後7日目におけるコロニーMNCのフローサイトメトリック特性解析WT (CD45.2+ ) C57BL/6 (H2Kd-neg)および BALB/c (H2Kd+)マウスは、CD45-先天性(CD45.1+)C57BL/6およびBALB/cドナーマウス(同種または同種BMT、n=4実験群当たり)からBMTを受け取った。C57BL/6およびBALB/cレシピエントマウスは、BMTの前日に950cGy(C57BL/6)および800cGy(BALB/c)骨髄筋TBIの準備調節レジメンを受け取った。BMT後7日目に、この原稿の方法に従ってレシピエントコロニーMNCの単細胞懸濁液を調製した。細胞は、ライブデッドBV510、H-2K d-PE、CD45.1-BV605、CD4-FITC、CD8-APC-Cy7、CD25-パシフィックブルー、FoxP3-AF647、およびCD11b-PE-Cy7抗体、N=4マウス/グループで染色した。(A)平均 ± SEM 絶対数 (ログ 10) CD45.1+ H-2kd-negまたは CD45.1+ H-2kd+ (ドナー型、 各ケースで) CD11bnegCD4+および CD8+ T 細胞を 7 日目にレシピエントコロンから単離コンディショニング後、CD45.1 C57BL/6(ドナー)→CD45.2 BALB/c(レシピエント)BMT。N = グループあたり 4。(B)FACS分析のためのゲーティング戦略。ゲート0、前方散乱(FSC-A)および側散乱(SSC-A)は、白血病を同定するために使用されるMNCの単一細胞懸濁液上で。ゲート1、SSC-Aを用いる非単一細胞の除外;ゲート2、FSC-Aを用いて非単一細胞の除外;ゲート3、生細胞選択ゲート4、BMTドナー対BMTレシピエント起源の造血細胞の分離;ゲート5は、ドナー非骨髄系統細胞の選択;ゲート6、CD4+T細胞の選択的ゲーティング;ゲート7は、CD4+CD25+FoxP3+T調節(Treg)細胞の別々のゲーティング。赤い矢印は、ドリルダウンゲーティング戦略を示します。(C)同種BMT(C57BL/6→BALB/c)のBALB/cレシピエントの結腸におけるコンディショニングおよびBMT後7日目(B)におけるゲーティング戦略を用いたCD25およびFoxP3染色の代表的なFACSプロット。各ゲート内のセルのパーセンテージは、ゲート内に与えられます。WT = ワイルドタイプ;TBI = 全身照射;BM = 10 x 106 CD45.1+前因性C57BL/6またはBALB/cドナー骨髄細胞;テフ = T エフェクター セル;Treg = Foxp3+ T調節細胞。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:非骨髄性TLI/ATSではなく、TBI/ATS調節はドナーTCRαβ+CD8+エフェクターT細胞蓄積を減少させる。(A)脾臓におけるドナーH-2Kb+C57BL/6マウスからのゲートH-2Kb+ TCRαβ+細胞のCD4およびCD8染色の代表的なFACSプロット(上段)、間腸間膜リンパ節(MLN)(中央行)、および結腸(下段)の1日のレシピエント6条件付けおよび移植後。各ゲートのセルのパーセンテージは、ゲートの上に与えられます。(B)平均±SEM絶対数(log 10)H-2Kb+TCRαβ+CD8+脾臓(上パネル)、MLN(中央パネル)、およびコロン(下パネル)の細胞は、コンディショニングおよびBMT後6日目にレシピエントの。WT = ワイルドタイプ;TBI = 全身照射;TLI =: 全リンパ球照射;ATS = 抗胸腺細胞血清;BM = 50 x 106 WT C57BL/6 ドナー骨髄細胞;SPL = 60 x 106 WT C57BL/6 ドナー脾臓細胞;TBI800, TBI400 = 骨髄切除(TBI800)または非骨髄筋症(TBI400)TBIのcGy用量。*この図は、ファンデルメルウェら20から変更されています。著作権 2013.米国免疫学会は、この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| ソリューション | 式 |
| コロン バッファ | 500 mL RPMI + 10mM HEPES + 10% FBS (56oC で 60 分間熱不活性化、pH を 7.3 に調整) |
| シリカ系密度勾配媒体 100%(コロンごと) | シリカベース密度勾配媒体の22.5 mL + 10x PBSの2.5 mL。 |
| シリカベース密度勾配媒体 66%(コロンごと) | 10.72 mLシリカベース密度勾配媒体100% + 5.28 mLコロンバッファ |
| シリカベース密度勾配媒体 44%(コロンごと) | 11 mLシリカベース密度勾配媒体100% + 14 mLコロンバッファー |
| コラーゲナーゼ消化バッファー(コロンごと) | クロストリジウム内網由来のコラゲナーゼEの100 U/mL、40mLコロンバッファーに溶解 |
| FACS バッファ | 500 mL 1x PBS + 5 g BSA + 1 mm EDTA + 0.2 g アジ化ナトリウム |
表 1: ソリューションの準備表。
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Discussion
この視覚プロトコルは、ラミナプロプリアリンパ球(LPL)を含む大腸単核細胞の単核細胞の単離のための十分に許容される方法を説明する。このプロトコルは、炎症性サイトカインおよび組織損傷が回収されたMNCの生存率の低下に自分自身を貸し出す重度の移植後マウス大腸炎モデルの評価に最適化されたことを考えると、これらの方法は他の方法に翻訳できると予想される結腸MNCのフェオティピック分析を必要とするアプリケーション。これらには、炎症性腸疾患のマウスモデルにおける結腸炎症の評価、大腸炎標的治療の免疫応答の研究、および感染性病原体によって産生される大腸炎が含まれる。さらに、健康な(合成BMT)マウスにおける単離を用いての我々のデータは、MNC単離物における免疫細胞検出を可能にするために、分離手順が有意な炎症浸潤を必要としないことを示している。実際、同様のデータは、未処理の健氏(非BMT)マウスを用いて得られた(データは示さない)。
このプロトコルのいくつかの重要なステップは、他の公開された方法と区別し、高収率と実行可能性に貢献します。例えば、クロストリジウム組織組織-由来コラゲナーゼE活性(100U/mL最終活性レベル)の最適化は、長期実験26に対する異なる多くの酵素に対して一貫した計算を可能にする。コラーゲンファミリーには28の異なるメンバーがあり、哺乳動物体内のすべてのタンパク質のほぼ30%を構成する27.さらに、異なる組織は、コラーゲンサブタイプの異なる分布を有し、それぞれが消化28のためのユニークなコラゲナーゼを必要とする。C.組織溶解体からのコラゲナーゼは、2つのクラス29、30に分類される6つの異なるタンパク質を含む。使用されるコラゲナーゼの特定のタイプは、結腸31から単離された細胞の生存率および全体的な品質を変えることができる。これまでの研究では、コラゲナーゼ型C-2139(コラゲナーゼE)が小腸25から単離されたMNC間のリンパ球の高収率を可能にすることを実証している。しかし、これらのプロトコルは、小腸よりもはるかに複雑なコラーゲン組成を持つ結腸の消化に対処しなかった。
酵素組織の分解の妥当性および信頼性は、再発性機械的破壊(組織への機械的外傷の増加を誘発する)の必要性を最小限に抑えることによって、全体的な細胞収率および生存率に影響を与える確立された因子である。コラゲナーゼE特異的プロトコルを用いた間質および粘膜コラーゲンの適切な酵素消化(標準使用におけるコラゲナーゼD媒介消化プロトコルと比較して)により、このプロトコルは機械的操作の量を最小限に抑えます。間質を破壊し、免疫細胞サブセットを懸濁液に放出するために必要な組織断片。これにより、後続のアッセイに対する単離されたMNCの生存率がさらに向上します。データ(図1B)で示されるように、これはストレーナーを通して単一の細胞懸濁液の標準的なろ過を超えてDNAseおよび他の化学的または機械的な集まり防止操縦の必要性を除去する。腸リンパ球細胞の単離を概説する他の報告は、単核白血球24の収量および生存率の両方を高めるために粘液溶解剤としてジチオスレイトール(DTT)およびEDTAを使用している。
細胞収率を向上させるこのプロトコルのもう一つのユニークな側面は、微調整されたシリカベースの密度分離メディアグラデーションの適用です。現在までに発表された他の消化方法論文は、このような密度分離勾配21、31を使用しない。しかし、著者の経験と機能的に活性リンパ球細胞を単離するためにこのプロトコルを利用する共同研究者の経験では、密度勾配精製は、消化後に回収されたMNCの生存率と純度の両方を向上させる19,20歳,32.
この原稿の焦点ではないが、マウスの腸の炎症モデルで働く人々のために言及する価値があることは、この原稿の方法は、小腸から生存可能なMNCの同様の高品質の単離を可能にするために変更することができるということである。これを達成するために必要な一次結腸プロトコルの変更は、単一の90分消化(2つの60分消化ではなく)を使用し、他のすべてのステップ(酵素活性レベルおよびクエンチステップを含む)が示されたものと同一である。この修飾は、通常、白血病を含む末端回腸を含むまたは1.5-2.5 x 106 MNCなしで小腸当たり0.8-4 x 106 MNCの範囲を生み出す。したがって、このプロトコルの1つの目新しさは、一次プロトコルをコロンに適用し、改変されたプロトコルを小腸に適用することで、個々の小腸と結腸の両方から高い再現性と良好な生存率を有するMNCを分離できる可能性があることである。同じ実験で実験動物。
要約すると、記載されたプロトコルは、結腸から、または、修飾して、小腸からの単核細胞の効率的かつ再現性の分離を可能にする。2人の熟練したオペレータが一緒に働くことで、1日に10個もの別々のコロンを処理および分析することができ、単細胞懸濁液は組織収穫から6-8時間以内にその表現型および機能的分析の準備ができている。このプロトコルの適用は、結腸炎症の免疫評価を必要とする他の研究目的にとって有益であり、他の研究者がマウス結腸の免疫系を厳密かつ再現可能な方法で特徴付けることを可能にする。
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Disclosures
著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。
Acknowledgments
この研究は、助成金#1K08HL088260と#1R01HL133462-01A1(A.B.P.、H.N.、S.J.)、および小児研究のためのバチェラー財団(D.M.、H.N.、S.J.、A.A.H.、A.B.P.)によって支援されました。本研究で使用したC57BL/6およびBALB/cマウスは、当施設で飼育されるか、ジャクソン・ラボまたはタコニックによって提供された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm Petri DIsh | Thermo Scientific | 150288 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 10x PBS | Lonza BioWhittaker | BW17-517Q | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4100 | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 302995 | |
| 15 mL Non-Sterile Conical Tubes | TruLine | TR2002 | |
| 18 G Blunt Needle | Becton Dickinson | 305180 | |
| 25 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4250 | |
| 40 μm pore size Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning | 21008-951 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503-1KG | |
| Fixation Buffer | Biolegend | 420801 | |
| E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum | Sigma | C2139 | |
| EDTA, 0.5 M Sterile Solution | Amresco | E177-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo /Fisher Scientific -HyCLone | SV30014.03 | |
| HEPES | GE Healthcare-HyClone | SH30237.01 | |
| Percoll | GE Healthcare-Life Sciences | 1708901 | |
| RPMI Medium | Corning | 17-105-CV | |
| Sodium Azide | VWR Life Science Amresco | 97064-646 | |
| Trypan Blue | Lonza BioWhittaker | 17-942E |
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