Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Изоляция Ламина Проприа моноядерных клеток из Курина толстой с использованием коллагеназа E

Published: September 26, 2019 doi: 10.3791/59821
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4,5
1Department of Pediatrics, Division of Hematology / Oncology and Bone Marrow Transplantation, University of Miami Miller School of Medicine, 2Batchelor Children's Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 3Department of Microbiology & Immunology, University of Miami Miller School of Medicine, 4Sylvester Comprehensive Cancer Center, University of Miami Miller School of Medicine, 5Holtz Children's Hospital, University of Miami Miller School of Medicine

Summary

Целью этого протокола является изоляция моноядерных клеток, которые находятся в ламинальной проприии толстой кишки путем ферментативного пищеварения тканей с помощью коллагеназы. Этот протокол позволяет эффективно изоляции моноядерных клеток в результате одной подвески клеток, которые, в свою очередь, могут быть использованы для надежного иммунофенотипирования.

Abstract

Кишечник является домом для наибольшего числа иммунных клеток в организме. Малые и большие кишечные иммунные системы полиции воздействия экзогенных антигенов и модулировать ответы на мощные микробиально производных иммунных стимулов. По этой причине, кишечник является основным целевым местом иммунной дисрегуляции и воспаления во многих заболеваниях, включая, но, не ограничивавшись воспалительными заболеваниями кишечника, такими как болезнь Крона и язвенный колит, трансплантат против хозяина болезни (GVHD) после кости трансплантации костного мозга (BMT), и многие аллергические и инфекционные заболевания. Морин модели желудочно-кишечного воспаления и колита в значительной степени используются для изучения осложнений Г.И. и предварительно оптимизировать стратегии профилактики и лечения. Данные, полученные из этих моделей с помощью изоляции и фенотипического анализа иммунных клеток из кишечника имеет решающее значение для дальнейшего иммунного понимания, которые могут быть применены для улучшения желудочно-кишечных и системных воспалительных расстройств. В этом отчете описывается высокоэффективный протокол для изоляции моноядерных клеток (MNC) от толстой кишки с помощью смешанного интерфейса градиента плотности на основе кремнезема. Этот метод воспроизволит значительное количество жизнеспособных лейкоцитов при минимизации загрязнения мусора, позволяя последующее иммунное фенотипирование путем цитометрии потока или другими методами.

Introduction

Хотя желудочно-кишечного тракта (ГИ) в первую очередь посвященобработке и реабсорбции питательных веществ из пищи, желудочно-кишечный тракт также поддерживает центральную роль в целостности сосудистой, лимфатической и нервной систем и многих других органов через его слизистой и субмукозной иммунной системы1. Иммунная система GI имеет влиятельную роль как в желудочно-кишечном и системном здоровье из-за его постоянного воздействия иностранных антигенов из пищи, сопутствующих бактерий, или вторжение патогенов1,2. Таким образом, иммунная система Г.И. должна поддерживать хрупкий баланс, в котором она переносит непатогенные антигены, адекватно реагируя на патогенные антигены1,2. Когда нарушается баланс толерантности и защиты, локализованы или системной иммунной дисрегуляции и воспаления может произойти в результате множества заболеваний1,2,3.

Кишечник таит в себе не менее 70% всех лимфоидных клеток в организме4. Большинство первичных иммунологических взаимодействий включают по крайней мере одну из трех иммунных станций в кишечнике: 1) Патчи Пейера, 2) Интраэпителиальные лимфоциты (IEL) и 3) лимины проприа лимфоциты (LPL). Каждый из них состоит из сложной взаимосвязанной сети иммунных клеток, которые быстро реагируют на нормальные иммунные проблемы в кишечнике5. Ограниченный строма выше muscularis слизистые оболочки, слабо структурированные ламины propria является соединительной ткани слизистой оболочки кишечника и включает в себя леса для villus, сосуды, лимфатический дренаж, и слизистой нервной системы, а также многие врожденные нервной системы и адаптивные иммунные подмножества6,7,8,9. LPL состоят из CD4и CD8 Т-клеток в приблизительном соотношении 2:1, плазматические клетки и миелоидные клетки линии, включая, дендритные клетки, тучные клетки, эозинофилы и макрофаги6.

Существует растущий интерес к пониманию иммунной дисрегуляции и воспаления кишечника, как это относится к различным состояниям заболевания. Такие условия, как болезнь Крона и язвенный колит все проявляются различные уровни воспаления толстой кишки10,11,12. Кроме того, у пациентов со злокачественными или незлокачественными расстройствами костного мозга или иммунной системы, которые проходят аллогенную трансплантацию костного мозга (алло-БМТ), могут развиться различные формы колита, включая 1) прямую токсичность от схем кондиционирования до BMT, 2) инфекций, вызванных иммуносупрессией после BMT и 3) трансплантата против хозяина болезни (GVHD) обусловлен донора типа Т-клеток, реагирующих на донора алло-антигенов в тканях после BMT13,14,15. Все эти пост-BmT осложнений приводят к значительным изменениям в иммунной среде кишечника16,17,18. Предлагаемый метод позволяет надежную оценку накопления иммунных клеток в толстой кишке мыши и, при применении к получателям мурина после BMT, облегчает эффективное анализ как донора, так и реципиента иммунных клеток, участвующих в переноске трансплантации19 ,20. Дополнительные причины воспаления кишечника включают злокачественные новообразования, пищевую аллергию или нарушение микрофлоры кишечника. Этот протокол позволяет получить доступ к кишечной моноядерной клетке из толстой кишки и, с модификациями, к лейкоцитам тонкой кишки в любой из этих доклинических моделей мурин.

Поиск PubMed с использованием поисковых терминов "intestine And immune cell And isolation" показывает более 200 публикаций, описывающих методы пищеварения тонкой кишки для извлечения иммунных клеток. Однако, подобный поиск словесности для двоеточия не дает никакие well-delineated протоколы определяя изоляцию иммунных клеток от двоеточия. Это может быть потому, что двоеточие имеет более мышечной и интерстициальной слоев, что делает его более трудным для полного переваривания, чем тонкой кишки. В отличие от существующих протоколов, этот протокол специально использует Коллагеназа E от Clostridium histolyticum без других бактериальных коллагенезов (Collagenase D/ Коллагеназа I). Мы демонстрируем, что, используя этот протокол, пищеварение толстой ткани может быть достигнуто при сохранении качества изолированных кишечных моноядерных иммунных клеток (MNC) без добавления анти-слипающихся реагентов, таких как версенат натрия (EDTA), Dispase II, и дезоксирибонуклеэI (DNAse I)21,22,23. Этот протокол оптимизирован, чтобы позволить воспроизводимой надежной добычи жизнеспособной MNC из толстой кишки для дальнейших направленных исследований и должны поддаваться на изучение иммунологии толстой кишки или (с модификациями) тонкой кишки24, 25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все исследования были проведены в соответствии с протоколами исследования грызунов рассмотрены и одобрены институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Медицинской школы Университета Майами Миллера, которая отвечает ветеринарным стандартам, установленным Американской ассоциацией для лабораторных животных (AALAS).

1. Подготовка решений

  1. Как описано в таблице 1, подготовить colon Buffer, Силика основе плотности разделения СМИ 100%, Силика основе плотность разделения СМИ 66%, Силика основе плотность разделения СМИ 44%, Collagenase E Пищеварения буфера, и FACS буфера.
    1. Подготовка colon Buffer за день до процедуры и хранить на ночь при 4 градусах Цельсия.
    2. Подготовка 100% Силика основе плотности разделения СМИ за день до процедуры и хранить на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию, размещение при комнатной температуре утром процедуры оттаивания.
    3. Подготовка 66% и 44% Силика основе разделения СМИ в утром изоляции, используя комнатную температуру 100% Силика основе плотности разделения СМИ и толстой буфера.
    4. Измерьте соответствующее количество Clostridium histolyticum-производной Коллагеназе E и храните при -20 градусов за одну ночь до процедуры. На следующее утро, растворить в соответствующем томе колонии буфера для получения Коллагеназа пищеварения буфера. Для всех инкубаций с коллагенеза пищеварения буфера в день процедуры, предварительно подогреть решения до 37 градусов по Цельсию.
  2. В течение всего протокола держите одну центрифугу при 20 градусах Цельсия и скорости вращения 859 х г,при этом тормоза инактивированы (0 торможения) для центрифугирования градиента. Установите еще до 4 градусов по Цельсию и скорость вращения 859 х г, со стандартным замедлением, для мытья шагов.

2. Сбор толстой кишки

  1. Эвтаназия мышь с помощью CO2 удушья следуют AALAC утвержденных подтверждающий метод.
  2. Поместите мышь в положение на спине и распылите мех с 70% этанола. Используя большие ножницы ткани, сделать вертикальный разрез средней линии и подвергать нетронутыми перитонеума.
  3. Используя тонкие ножницы для вскрытия, откройте перитонеум. Используйте щипчи для перемещения тонкой кишки в одну сторону и подвергать нисходящей толстой кишки. Слегка потяните вверх по нисходящей толстой кишки, чтобы максимально разоблачить ректальную часть толстой кишки. Вырезать дистальную прямую кишку глубоко в таз и вскрыть и удалить всю толстую кишку, как один блок, от дистальной прямой кишки до цекалякрышки.
  4. Передача толстой кишки в 20 мл охлажденной толстой кишки буфера в 50 мл полипропиленовой трубки.

3. Очистка толстой кишки

  1. Поместите толстую кишку на увлажненные бумажные полотенца и извлечь твердый стул, применяя мягкое давление на стенку кишечника с тупым концом ножниц или щипцы.
  2. Поместите толстую кишку в чашку Петри и промойте кишечник с 10 мл охлажденных двоеточие буфера с помощью шприца 10 мл с 18 G тупой иглы заполнения.
  3. Передача толстой кишки в толстой кишки буфера увлажненное бумажное полотенце и удалить мезентерии и жира с острым концом ножниц.
  4. Поместите толстой кишки в чашку Петри заполнены 5-10 мл охлажденной толстой кишки буфера агитации вручную, чтобы мыть оставшееся содержимое толстой кишки. Повторите 2-3 раза.
  5. Вырезать толстой кишки продольно от его более мышечной ректальной конце проксимальной толстой кишки (генерации одного прямоугольного открытого кучи толстой кишки кусок) в чашке Петри заполнены свежим охлажденным двоеточие буфера. Откажитесь от существующих носителей и пополнить с чистой охлажденной колонии буфера.
  6. Вымойте кишечник 3 раза, энергично закрученного его в чашку Петри и заменив 5-10 мл охлажденной толстой кишки буфера после каждой стирки.
  7. Поместите прямоугольную ткань толстой кишки на бумажное полотенце, смоченное колонией и разрежьте его, нарезая его горизонтально, а затем на мелкие фрагменты (3 мм х 3 мм секций).
  8. Соберите фрагменты толстой кишки тщательно с помощью мелких щипцы в 20 мл охлажденной толстой кишки буфера в 50 мл полипропилена коническойтрубки.
  9. Вымойте фрагменты толстой кишки 3 раза, каждый мыть в 20 мл колонии буфера, энергично закрученного трубки в течение 30 с. Между каждым возбуждением, позволяют фрагменты ткани, чтобы осесть на дно трубки. Декант или вакуума аспирирует супернатант, предотвращая потерю фрагмента ткани в процессе аспирации между каждой стиркой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости менять трубку после каждой стирки.

4. Коллагенеза пищеварение 1

  1. Добавьте 20 мл коллагенезового варежесца буфера к промытым фрагментам толстой кишки в 50 мл полипропиленовой конической трубки.
  2. Поместите закрытую трубку 50 мл при 37 градусах Цельсия в инкубаторный орбитальный шейкер с скоростью вращения, установленной на уровне 2 х г в течение 60 мин. Убедитесь, что фрагменты ткани находятся в постоянном движении во время агитации; при необходимости постепенно увеличивайте скорость вращения, чтобы не оседать фрагменты тканей на дно трубки.

5. Подготовка Силика основе разделения СМИ Градиенты

  1. Подготовка 66% и 44% Силика основе плотность разделения сми, используя 100% Силика основе плотность разделения средств при температуре 20 градусов по Цельсию (комнатная температура) и колон-буфер.
  2. Налейте 5 мл 66% Силика основе плотность разделения средств в каждом из 3 отдельных 15 мл полипропиленовых труб. Подготовка 3 трубки на толстой кишке. Это формирует более высокую плотность основания процедуры изоляции градиента, на которой более низкие носители разделения плотности будут наслоены для того чтобы создать градиент разделения.
  3. Хранить при 20 градусах По до использования.

6. Коллекция Супернатанта из пищеварения 1

  1. Соберите только супернатант с помощью 25 мл серологического пипетки и фильтруйте супернатант через 40 мкм поры фильтрации ткани клеточной ткани ситечко помещается в чистой 50 мл полипропилена коническая трубка, после Collagenae Digestion 1 завершена. Будьте осторожны, чтобы не аспирировать любые существующие фрагменты ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраните все оставшиеся видимые фрагменты ткани в трубке. Они будут проходить второй коллагенеза пищеварения (шаг 8).

7. Утолить коллагенеза пищеварения буфер

  1. Заполните 50 мл полипропиленовой трубки полностью охлажденной колонии буфера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коллагенеза активна при 37 градусах Цельсия; следовательно, охлажденный буфер инактивирует этот фермент.
  2. Центрифуга трубки при 4 градусах по Цельсию при 800 х г в течение 5 мин.
    1. Откажитесь от супернатанта с помощью вакуумного аспирации. Вымойте клетки с 25 мл свежего буфера толстой кишки и центрифуги на 800 х г в течение 5 мин.
    2. Отдохните гранулы менее чем в 1 мл свежего охлажденных colon Buffer.
    3. Поместите 50 мл полипропиленовой конической трубки на льду.

8. Коллагеназа пищеварение 2

  1. Повторите шаг 4 (Digestion 1) с оставшимися фрагментами ткани, сохраненными со ступени 6.1.

9. Ткань Disaggregation После пищеварения 2

  1. Промыть фрагменты ткани энергично вперед и назад между трубкой и 10 мл шприц через 18 G тупой конец иглы.
  2. Повторите этот флеш как минимум 7-8 полных проходов, продолжая до тех пор, пока не будут видны фрагменты ткани или мусора.

10. Фильтровые клетки

  1. Передайте подвеску дезагрегации тканей через 40 мкм-пор фильтрации ткани клеточной ткани ситечко в чистую 50 мл полипропиленовой трубки.
  2. Вымойте фильтрации ткани ячейки ситечко с 10 мл охлажденной толстой буфера для восстановления любых клеток, попавших в фильтр.

11. Утолить варесьение коллагенеза

  1. Заполните 50 мл полипропилена коническая трубка на ободе с охлажденной колонии буфера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Температура colon Buffer имеет решающее значение для обеспечения закалки коллагеназа деятельности.
  2. Спин при 4 кв. м и 800 х г в течение 5 мин.
  3. Откажитесь от супернатанта с помощью вакуумного аспирации.
  4. Вымойте путем повторного приостановки в 25 мл свежего охлажденных колониибуфера , а затем центрифугации при 4 КС, 800 х г в течение 5 мин.
  5. Откажитесь от супернатанта с помощью вакуумного аспирации.
  6. Объедините повторное гранулы из Collagenase Digestion 1 (шаг 7) в соответствующую трубку со ступени 11.4.
  7. Повторите шаг 11.4 (мытье и центрифугация).

12. Силика основе плотность разделения СМИ Градиент разделения

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте шаги 12-18 как можно быстрее, чтобы обеспечить быстрое закалку коллагеназной активности.

  1. После шага 11.7, resuspend каждый гранулы в 24 мл в общей сложности 44% Силика основе плотность разделения СМИ на толстой кишке.
  2. Медленно слой 8 мл средств массовой информации от шага 12,1 на каждой из трех труб, подготовленных на шаг 5.2 (содержащий 66% Силика основе плотность разделения средств массовой информации), используя 10 мл серологические пипетки. Поддерживайте устойчивый и медленный поток 44% Плотность Разделения Сми при наслоении градиента, чтобы избежать нарушения интерфейса.
  3. Тщательно сбалансировать все трубы в центрифуге ведра с помощью весовой шкалы или баланса.
  4. Спин трубки 20 мин на 859 х г в центрифуге без тормоза при 20 градусах Цельсия. Разрешить роторы прийти к полной отдохнуть перед удалением труб, заботясь, чтобы не нарушить ячейки на градиент интерфейса.

13. Сбор моноядерных ячеек из интерфейса Gradient

  1. Визуализируйте интерфейс градиента (около отметки 5 мл), где обычно присутствует белая полоса толщиной 1-2 мм (содержащая MNC).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно или не может видеть белую полосу. Тем не менее, MNC будет на этом интерфейсе и должны затуманить ясность интерфейса градиента.
  2. Вакуумный аспиратии и отбросить верхний 7 мл верхнего градиента, чтобы облегчить доступ пипетки к интерфейсу.
  3. Используя непрерывную ручную всасывание и устойчивое вращающееся движение запястья, соберите интерфейсный слой клеток в чистую полипропиленовый коническую трубку мощностью 50 мл. Собирайте до тех пор, пока интерфейс между 2 градиентами не будет ясным и рефрактивым (ясно от ячеек).
  4. Заполните трубку для сбора 50 мл охлажденных FACS Buffer. Спин при 4 градусах по Цельсию, 800 х г в течение 5 мин.
  5. Примачивайте супернатант с помощью вакуумного аспирации и приостанавливаете пеллету в 1 мл буфера FACS.
  6. Подсчитайте клетки на гемоцитометре при разбавлении 1:2 с помощью соответствующих методов исключения мертвых клеток.
  7. Приступить к FACS окрашивания или другие анализы с свежеиспятой толстой MNC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

При работе с моделями заболеваний толстой кишки, полезно, чтобы иметь возможность как количественно и качественно оценить, среди MNC толстой кишки, несколько подмножеств иммунных клеток, участвующих в воспалительном процессе. Одноклеточная приостановка МНК, полученная в результате применения этого протокола, облегчает такую фенотипическую характеристику надежным и воспроизводимым образом. В качестве доказательства принципа применения этого метода изоляции в различных экспериментальных настройках, мы извлекли толстой кишки MNC с помощью этого метода и выполнили многопараметрический цикл потока цитометрии на клетках, изолированных от мышей с (Рисунок 1 и Рисунок 2 , аллогенные BMT) и без(Рисунок 2A, syngeneic BMT) значительные иммунно-опосредованные повреждения толстой кишки после BMT.

Цитометрия потока и анализ данных были выполнены для сравнения фракций апоптотики и некротики мертвых лимфоцитов при использовании либо Коллагеназа E или D для изоляции, с или без Лечения DNase 1. Стратегия gating, используемая во время цитометрии потока, предусмотрена на рисунке 1A.  После Annexin V (маркер апоптоза) и поправимый Live/Dead Blue краситель (маркер некроза) окрашивание на одноклеточных суспензий после каждой изоляции, Collagenase E без DNAse показал значительно более высокий процент Annexin Vneg Live/Dead Blueneg живые клетки (средний 43,3%, диапазон 26,5%-59,9%, n no 3) после изоляции по сравнению с Коллагеназой D без DNAse (средний 8,7%, диапазон 3,6%-10,2%, n no 3), даже по сравнению с Коллагеназой E и DNAse (средний диапазон 8,18%, диапазон 4,7%-40) Коллагеназе Дз DNAse (средний 15,10%, диапазон 9,9%-21,4%, n No 3). Кроме того, мы определили некротические клетки Annexin VnegLive/Dead Blue в среднем проценте 41,0% в группе Коллагеназе Е (диапазон 37,1%-58,8%, n 3) против 90,0% в группе Collagenase D (диапазон 69,7%-95,5%, n 3), 75,9% в Коллагеназе E группы, и 80,3% в группе Коллагеназе D и DNAse, соответственно (диапазон 65,7%-79,5%, диапазон 54,9%-89,9%, n No 3). Представитель FACS участков из n No 1 животных в каждой группе показано Рисунок 1B).

В качестве дополнительного доказательства принципа последовательности и урожайности жизнеспособной MNC с помощью этой процедуры у больных мышей, мультипараметрический поток цитометрии был применен к MNC изолированы от CD45.2 BALB/c получателя мышей на 7 день после получения BMT либо аллогенных (CD45.1 C57BL/6 донора) или сингенных (CD45.1 BALB/c донора) BMT моделей. Использование абсолютных номеров MNC, умноженных на процент ысоретных иммунных подмножеств, полученных с помощью анализов цитометрии потока, среднее абсолютное число доноровCD4 и CD8- Т-клеток, извлеченных из толстой кишки получателя БМТ, может быть рассчитано и сравнивается (n No 4 в группе, Рисунок 2A). Так как это может быть важно для выявления и / или количественно редких популяций иммунных клеток в таких моделях мыши, мы оценили редкие подмножества, включая донора полученных (CD45.1)Foxp3и T регулятивных клеток (Treg) в обоих синдигенных и аллогенных моделей BMT. Показана стратегия gating, чтобы достичь клеток-доноров Treg(CD4-CD25)от антител-окрашенных одноклеточных суспензий (последовательностьворот, очерченных красной стрелкой; Рисунок 2B). Используя этот метод, даже редкие подмножества, такие как донор производные толстой кишки Treg инфильтрации реципиента мыши толстой кишки после BMT может быть проанализирована(Рисунок 2C, представительный участок; n No 1).

На рисунке 3 показано расширенное применение этого метода в исторических данных из нашей группы, используя представленный протокол для сравнения накопления Cd8, вызывающих GVHD, по сравнению с CD4 »донорскими Т-клетками в толстой кишке мышей BALB/c либо защищены, либо не защищены от GVHD по предварительному бМТ режиму предварительного лечения (кондиционирования)20. Испытанные подготовительные схемы включали 800 cGy/myeloablative полное облучение организма (TBI800) или немиелоаблиативное TBI (400TBI), а также немиелоабливный кондиционирование с использованием общего лимфоидного облучения (TLI), при котором облучение было доставлено в лимфу узлов, тимуса и селезенки с защитой черепа, легких, конечностей, таза и хвоста. Все кондиционирования были объединены с анти-тимоцита сыворотки (АТС), иммуномодулирующего агента. Уже в 6-й день после BMT, этот протокол изоляции толстой кишки MNC привел о надежном циклометрическом анализе потока по сравнению с идентичными анализами на более лимфоцитных обогащенных органах-мишенях GVHD, таких как селезенка и мезентерические лимфатические узлы (MLN) (Рисунок 3A)20 . Воспроизводимая изоляция толстой кишки MNC через получателей BMT (n 7-10 в группе лечения) позволило надежное статистическое сравнение абсолютных чисел доноров CD8и эффектор Т-клеток между различными группами лечения предварительной трансплантации кондиционирования ( Рисунок 3B), что дает важные данные о фенотипах иммунной системы, что привело к ключевым исследованиям выявления врожденных иммунных механизмов защиты GVHD от TLI, в отличие от Кондиционирования TBI до BMT. 20

Figure 1
Рисунок 1: Циклометрический анализ потока толстой кишки MNC на 7-й день после BMT в аллогенной мыши модели систем при изоляции с Коллагеназe E и D с и без DNAse 1. Дикий тип (WT) (CD45.2)BALB/c (H2Kd)мыши получили BMT от CD45 congenic (CD45.1)C57BL/6 донорских мышей (аллогенные BMT, n 3 в группу). WT (CD45.2)BALB/c получателя мышей вводили 800cGy TBI (BALB/c) за день до BMT. На 7-й день после BMT, одноклеточные суспензии реципиента толстой кишки были подготовлены после методов этой рукописи с использованием Коллагеназе E (100 U/mL), Коллагеназе E (100 U/mL) с DNAse 1 (500 мкг/мл), Коллагеназе D (500 мкг/мл), или Коллагенеза D (500 м/м00г), или Коллагенеза D (500 м/мл) с DNAse 1 (500 мкг/мл) (n - 3 на группу). Клетки были окрашены Live/dead-UV450 (Live/Dead Blue), Annexin V-APC, H-2Kd-PE,CD45.1-BV605, CD3-FITC, CD4-BV711, CD8-APC-Cy7, FoxP3-Pacific Blue и антителами CD11b-PE-Cy7. (A) Стратегия Gating для анализа FACS. Ворота 0, передний разброс (FSC-A) и боковой рассеяние (SSC-A) на одноклеточной подвеске MNC, используемой для идентификации лейкоцитов; Ворота 1, исключение неодиночных ячеек с использованием SSC-A; Ворота 2, исключение неодиночных ячеек с использованием FSC-A; Ворота 3, идентификация Annexin V-положительный (апоптотический) и поправляемый краситель жизнеспособности Live/Dead-UV450-Annexin V-отрицательные (некротические) подмножества клеток. (B) Представитель FACS участков Annexin V и поправляемой жизнеспособности красителя окрашивания закрытых лейкоцитов среди MNC для 4 экспериментальных групп. N No 1 репрезентативная мышь на группу в группах: Коллагеназа Е (100 U/mL), Коллагеназе Е (100 U/mL) - DNAse 1 (500 мкг/мл), Коллагеназе D (500 мкг/мл) и Коллагеназе D (50 мкг/мл) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Поток цитометрической характеристики толстой кишки MNC на 7-й день после BMT в аллогенеи и сингенных систем модели мыши. WT (CD45.2)C57BL/6 (H2Kd-neg) и BALB/c (H2Kd)мыши получили BMT от CD45-конгении (CD45.1)C57BL/6 и BALB/c донорских мышей (сингенные или аллогенные BMT, n 4 в экспериментальной группе). Мыши-получатели C57BL/6 и BALB/c получили режимы подготовки кондиционирования 950cGy (C57BL/6) и 800cGy (BALB/c) миелоабливный TBI, поставленный за день до BMT. На 7-й день после БМТ, одноклеточные суспензии получателя толстой кишки MNC были подготовлены в соответствии с методами этой рукописи. Клетки были окрашены Live-dead-BV510,H-2K d-PE, CD45.1-BV605, CD4-FITC, CD8-APC-Cy7, CD25-PacificBlue, FoxP3-AF647 и CD11b-PE-Cy7 антителами, N и 4 мышами на группу. (A) Среднее абсолютное число SEM (журнал 10) CD45.1- H-2kd-neg или CD45.1- H-2k d ( типдонора, в каждом случае) CD11bnegCD4и CD8- T-клетки, изолированные от толстой кишки получателя в день 7 после кондиционирования и CD45.1 C57BL/6 (донор) CD45.2 BALB/c (получатель) BMT. N - 4 евро на группу. (B) Стратегия Gating для анализа FACS. Ворота 0, передний разброс (FSC-A) и боковой рассеяние (SSC-A) на одноклеточной подвеске MNC, используемой для идентификации лейкоцитов; Ворота 1, исключение неодиночных ячеек с использованием SSC-A; Ворота 2, исключение неодиночных ячеек с использованием FSC-A; Ворота 3, живой отбор клеток Ворота 4, разделение гематопогетических клеток донора BMT против происхождения получателя БМТ; Ворота 5, выбор донорских клеток немиелоидной линии; Ворота 6, селективное gating CD4и Т-клеток; Ворота 7, отдельные gating CD4иCD25-FoxP3- T регулятивные (Treg) клетки. Красная стрелка обозначает стратегию сверления.ру. (C) Представитель FACS участков CD25 и FoxP3 окрашивания с использованием стратегии gating в (B) на 7-й день после кондиционирования и BMT в толстой кишке BALB/c получателя аллогенные BMT (C57BL/6 BALB/c). Процент ячеек в каждом воротах дается в воротах. WT - дикий тип; TBI - полное облучение организма; БМ No 10 х 106 CD45.1 конгенгенные C57BL/6 или BALB/c донорские клетки костного мозга; Тефф и Т-эффекторные клетки; Трег и Фоксп3и T регулятивные ячейки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Немиелоабливный TLI/ATS, но не Кондиционирование TBI/ATS уменьшает донора ТКРЗ-CD8- эффектор Т-клеток накопления. (A) Представитель FACS участки CD4 и CD8 окрашивания закрытого H-2Kb 'TCR- клетки от донора H-2Kb' C57BL/6 мышей в селезенке (верхний ряд), мезентерический лимфатический узл (MLN) (средний ряд) и толстой кишки (нижний ряд) получателей в день 6 после кондиционирования и трансплантации. Процент ячеек в каждом воротах дается над воротами. (B) Среднее абсолютное число SEM (журнал 10) H-2Kb 'TCR'CD8- клетки в селезенке (верхняя панель), MLN (средняя панель) и толстой кишки (нижняя панель) получателей на 6-й день после кондиционирования и BMT. WT - дикий тип; TBI - полное облучение организма; ТЛИ: полное лимфоидное облучение; АТС - антитимоцитовая сыворотка; БМ 50 x 106 WT C57BL/6 донорские клетки костного мозга; SPL 60 x 106 WT C57BL/6 донорские селезенки; TBI800, TBI400 и cGy дозы миелоаблиативного (TBI800) или немиелоаблиативного (TBI400) TBI. «Эта цифра была изменена с ван дер Мерве и др.20. Авторское право 2013. Американская ассоциация иммунологов, Inc Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой цифры.

Решение Формула
Колония-буфер 500 мл RPMI - 10 мМ HEPES - 10% FBS (тепло инактивировано при 56oC в течение 60 минут, рН скорректировано до 7,3)
Силика основе плотность градиентных средств массовой информации 100% (за толстую кишку) 22,5 мл Силик-основе плотность Градиент Сми 2,5 мл 10x PBS.
Силика основе плотность градиента СМИ 66% (за толстую кишку) 10,72 мл Силика основе плотность градиентных средств массовой информации 100% 5,28 мл колонии буфер
Силика основе плотность градиентных средств массовой информации 44% (за толстую кишку) 11 мл Силика основе плотность градиентных средств массовой информации 100% и 14 мл колонии буфер
Коллагенеза пищеварения буфер (за толстую кишку) 100 U/mL коллагеназа E от Clostridium histolyticum, растворенный в 40 mL Колония Буфер
FACS Буфер 500 мл 1x PBS 5 г BSA 1 мм ЭДТА 0,2 г Натрия Азида

Таблица 1: Таблица подготовки решений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот визуальный протокол описывает хорошо переносимые методы изоляции моноядерных клеток толстой кишки, включая лиминпрорийские лимфоциты (LPL). Учитывая, что этот протокол был оптимизирован в оценке тяжелых посттрансплантационных моделей мышь колит, где воспалительные цитокины и травмы тканей поддаются плохой жизнеспособности восстановленных MNC, мы ожидаем, что эти методы могут быть переведены на другие приложения, требующие фенотипического анализа толстой кишки MNC. К ним относятся, но, не ограничиваются оценкой воспаления толстой кишки в мышиных моделях воспалительных заболеваний кишечника, исследования иммунных реакций колита-ориентированного лечения, и колит, производимый инфекционных патогенов. Кроме того, наши данные с использованием изоляции у здоровых (сингенных BMT) мышей показывают, что процедура изоляции не требует значительных воспалительных инфильтра, чтобы позволить обнаружению иммунных клеток в изолятах MNC. Действительно, аналогичные данные были получены с использованием необработанных здоровых (не-BMT) мышей (данные не показаны).

Несколько ключевых шагов этого протокола отличают его от других опубликованных методов и способствуют высокой урожайности и жизнеспособности. Например, оптимизация Clostridium histolyticum-производнойактивности коллагеназа E (100 U/mL окончательный уровень активности) позволяет последовательные расчеты для различных партий фермента в течение длительных экспериментов26. Есть 28 различных членов в семье коллагена, вместе составляют почти 30% всех белков в организме млекопитающих27. Кроме того, различные ткани имеют различные распределения коллагеновых подтипов, каждый из которых требует уникальных коллагенов для пищеварения28. Коллагенеза от C. histolyticum включает в себя 6 различных белков, разделенных на два класса29,30. Специфический тип используемого коллагенеза может изменить жизнеспособность и общее качество клеток изолированных от двоеточия31. Предыдущие исследования показали, что коллагенеза типа C-2139 (Коллагеназа Е) позволяет высокий выход лимфоцитов среди MNC изолированы от тонкой кишки25. Однако эти протоколы не касались переваривания толстой кишки, гораздо более мускулистого органа со значительно более сложным составом коллагена, чем тонкий кишечник.

Адекватность и надежность деградации ферментативных тканей является установленным фактором, влияющим на общий выход клеток и жизнеспособность путем минимизации необходимости рецидивирующих механических нарушений (что приводит к увеличению механических травм тканей). Благодаря адекватному ферментативному пищеварению интерстициального и слизистой коллагена коллагена с использованием коллагенеза E-специфического протокола (по сравнению с коллагеназой D-опосредованного пищеварения протоколов в стандартном использовании), этот протокол минимизирует количество механических манипуляций фрагменты ткани, необходимые для нарушения интерстития и выпустить иммунные клетки подмножества в подвеску. Это еще больше повышает жизнеспособность изолированной МНК для последующих анализов. Как показано в данных(Рисунок 1B), это устраняет необходимость DNAse и других химических или механических анти-слипания маневров за стандартной фильтрации одной подвески ячейки через ситечко. Другие доклады с изложением изоляции кишечных лимфоидных клеток использовали дитиотрейтол (DTT) и EDTA в качестве муколитических агентов для повышения урожайности и жизнеспособности изолированных моноядерных лейкоцитов24.

Другим уникальным аспектом этого протокола, который улучшает выход клеток, является применение тонко настроенного градиента среды разделения плотной плотности на основе кремнезема. Другие методы пищеварения документы, опубликованные на сегодняшний день не используют такой градиент разделения плотности21,31. Однако, по опыту авторов и опыту сотрудников, используя этот протокол для изоляции функционально активных лимфоидных клеток, очищение градиента плотности улучшает как жизнеспособность, так и чистоту MNC, восстановленной после пищеварения19 , 20 , 32.

Хотя это и не фокус этой рукописи, достойный упоминания для тех, кто работает с моделями воспаления кишечника у мышей является то, что методы в этой рукописи могут быть изменены, чтобы позволить аналогичные высококачественные изоляции жизнеспособной MNC из тонкой кишки. Модификация первичного протокола толстой кишки, необходимых для достижения этой цели является использование одного 90-мин пищеварения (а не два 60-мин пищеварения), со всеми другими шагами (в том числе уровень активности фермента и утоления шаги) идентичны тем, которые показаны. Эта модификация обычно дает диапазон 0,8-4 х 106 MNC на тонкой кишке без или 1,5-2,5 х 106 MNC с включением терминала ileum в том числе лейкоцитов богатых cecal крышка. Таким образом, одна из новинок этого протокола заключается в том, что применение первичного протокола к толстой кишке и измененный протокол к тонкой кишке, можно было бы изолировать MNC с высокой воспроизводимостью и хорошей жизнеспособностью как из тонкой кишки, так и толстой кишки отдельных экспериментальных животных в том же эксперименте.

Таким образом, описанный протокол позволяет эффективную и воспроизводимую изоляцию моноядерных клеток от толстой кишки или, с модификациями, тонкой кишки. С 2 опытных операторов, работающих вместе, целых 10 отдельных двоеток могут быть обработаны и проанализированы в один день, и одноклеточные суспензии могут быть готовы для последующего фенотипического и функционального анализа в течение 6-8 ч от сбора ткани. Применение этого протокола может оказаться ценным для других целей исследований, нуждающихся в иммунной оценки воспаления толстой кишки, что позволяет другим следователям охарактеризовать иммунную систему толстой кишки мыши в строгой и воспроизводимой образом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих финансовых интересах.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами #1K08HL088260 и #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.) и Фондом детских исследований Батчелора (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). Мыши C57BL/6 и BALB/c, используемые в этом исследовании, были либо выведены в нашем учреждении, либо предоставлены Jackson Labs или Taconic.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60 mm Petri DIsh Thermo Scientific 150288
1x PBS Corning 21-040-CV
10x PBS Lonza BioWhittaker BW17-517Q
10 mL Disposable Serological Pipette Corning 4100
10 mL Syringe Becton Dickinson 302995
15 mL Non-Sterile Conical Tubes TruLine TR2002
18 G Blunt Needle Becton Dickinson 305180
25 mL Disposable Serological Pipette Corning 4250
40 μm pore size Cell Strainer Corning 352340
50 mL Falcon Tube Corning 21008-951
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A4503-1KG
Fixation Buffer Biolegend 420801
E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum Sigma C2139
EDTA, 0.5 M Sterile Solution Amresco E177-500ML
Fetal Bovine Serum Thermo /Fisher Scientific -HyCLone SV30014.03
HEPES GE Healthcare-HyClone SH30237.01
Percoll GE Healthcare-Life Sciences 1708901
RPMI Medium Corning 17-105-CV
Sodium Azide VWR Life Science Amresco 97064-646
Trypan Blue Lonza BioWhittaker 17-942E

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schneeman, B. Gastrointestinal physiology and functions. British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).
  2. Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract. Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).
  3. Blumberg, R. S. Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment. Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).
  4. Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut. Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).
  5. Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N. Isolation of T Cells from the Gut. T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Waisman, A., Becher, B. , Humana Press. New York, NY. 21-25 (2014).
  6. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional Specialization within the Intestinal Immune System. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
  7. Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).
  8. Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria. Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).
  9. Mowat, A. M., Viney, J. L. The anatomical basis of intestinal immunity. Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).
  10. Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J. Irritable Bowel Syndrome. The New England Journal of Medicine. 376 (26), 2566-2578 (2017).
  11. Harb, W. J. Crohn's Disease of the Colon, Rectum, and Anus. Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).
  12. Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F. Ulcerative Colitis. The Lancet. 389 (10080), 1756-1770 (2017).
  13. Mohty, B., Mohty, M. Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update. Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).
  14. Hatzimichael, E., Tuthill, M. Hematopoietic stem cell transplantation. Stem cells and cloning: advances and applications. 3, 105-117 (2010).
  15. Hernandez-Margo, P. M., et al. Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation. Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).
  16. Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).
  17. Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children. Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).
  18. Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management. Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).
  19. Shuyu, E., et al. Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine β-thalassemia. Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).
  20. van der Merwe, M., et al. Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation. Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).
  21. Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (111), e54114 (2016).
  22. Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
  23. Weigmann, B. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue. Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).
  24. Bull, D. M., Bookman, M. A. Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells. Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).
  25. Davies, M. D., Parrott, D. M. Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine. Gut. 22, 481-488 (1981).
  26. Carrasco, A., et al. Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa. Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
  27. Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).
  28. Harrington, D. J. Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease. Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).
  29. Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases - A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).
  30. Autengruber, A., et al. Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function. European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
  31. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
  32. van der Heijden, P. j, Stok, W. Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine. Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).

Tags

Иммунология и инфекция Выпуск 151 Лимфоциты толстой кишки мурин ламины проприия колит трансплантация цитометрия потока ферментативное пищеварение воспаление моноядерные клетки
Изоляция Ламина Проприа моноядерных клеток из Курина толстой с использованием коллагеназа E
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McManus, D., Novaira, H. J., Hamers, … More

McManus, D., Novaira, H. J., Hamers, A. A. J., Pillai, A. B. Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E. J. Vis. Exp. (151), e59821, doi:10.3791/59821 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter